一种无丙二酸柠檬酸杆菌及其苯酚全细胞生物传感器与应用

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种无丙二酸柠檬酸杆菌及其在检测苯酚浓度上的应用，具体涉及该杆菌在构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器上的应用，包括苯酚全细胞生物传感器及其构建方法、与检测苯酚浓度的方法。


背景技术：

2.苯酚在化学工业中被广泛用于生产医药、农药、塑料等大量工业产品，是最广泛使用的化工产业中间体之一。在环境科学中，苯酚被认为是一种来源广泛、数量巨大、危害较大的优先污染物。在医学中，超过一定剂量的苯酚是一种对生物体具有毒性的污染物质，且苯酚暴露在环境中极易被生物体所摄入，摄入途径包括但不限于皮肤，呼吸道及消化道，并且造成包括腐蚀，中枢神经损伤，肾功能损伤在内的一系列慢性或急性毒性症状。
3.现有的苯酚检测手段一般分为如下三种：滴定法，分光光度法和色谱法。
4.滴定法的测定步骤如下：将苯酚与过量的溴进行反应，生成三溴苯酚，反应发生后将剩下的溴与碘化钾发生反应生成碘，使用标准的硫代硫酸钠溶液对碘进行滴定从而对碘进行绝对定量，最后推断出反应过程中所消耗掉的苯酚的量。
5.分光光度法是食品安全国家标准中对于水产品中挥发酚残留量测定的标准检测方法，最常用的方案是：4-氨基替比林分光光度法。测定原理如下：将酚类化合物吸收在碱性溶液中后,在氧化剂存在下与4-氨基安替比林发生反应,生成红色安替比林染料，根据颜色深浅，用分光光度法测定，再根据标准浓度下的酚类溶液绘制标准曲线，从而对样品中的酚类化合物进行定量检测。
6.色谱法最常用的为气相色谱法与液相色谱法。在270nm的波长下对样品中给的苯酚进行定量检测。
7.滴定法和分光光度法是现有的常规苯酚检测方法，然而在检测过程中需要的试剂品种较多，过程繁琐，且在分光光度法检测时，用以萃取的三氯甲烷对环境存在一定的毒害作用。液相色谱仪的精准度较高，但是仪器本身价格昂贵，且对放置的空间大小以及环境条件较为苛刻，操作液相色谱的人员也需要经过特殊的培训，存在大量的培训成本。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种检测苯酚浓度的方法，包括构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器及其构建方法、与在检测苯酚浓度上的应用，包括提供了一种无丙二酸柠檬酸杆菌。该菌从健康的c57bl/6小鼠肠道中分离得到，对环境没有毒害作用，对苯酚有着极好地响应，于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20221071。
9.本发明的技术方案，如下：
10.本发明公开了一种无丙二酸柠檬酸杆菌citrobacter amalonaticus ps01，其于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20221071。
11.本发明还公开了所述的无丙二酸柠檬酸杆菌在检测苯酚浓度上的应用。
12.本发明还公开了所述的无丙二酸柠檬酸杆菌在构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器上的应用。
13.本发明还公开了一种构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器，为所述的无丙二酸柠檬酸杆菌ps01转入有质粒pcm-dmpr-lux。
14.所述的质粒pcm-dmpr-lux的基因如seq id no.1所示。
15.本发明还公开了所述的全细胞生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
16.(1)构建pcm-lux载体
17.使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pcmgfp-lacz质粒，构建pcm-lux载体；
18.(2)构建pcm-dmpr-lux载体
19.使用同源重组的方法将菌株cf600编码苯酚羟化酶的基因簇dmp家族中的dmpr基因和po启动子连接进入pcm-lux，构建pcm-dmpr-lux载体；
20.(3)将构建好的pcm-dmpr-lux载体测序确认后，转入权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌ps01中，即完成全细胞生物传感器的构建。
21.所述的全细胞生物传感器的构建方法，步骤(1)扩增lux cdabe报告基因所采用的引物为：
22.正向扩增引物：
23.cagaaagcatgccggggatccctcgagctgcagactagtaggcttggaggatacgtatgac，
24.反向扩增引物：cgtaatcatggtcatggatctcaactatcaaacgcttcggttaa；
25.其中，小写下划线字母为载体上的同源臂序列。
26.所述的全细胞生物传感器的构建方法，步骤(2)构建pcm-dmpr-lux的引物为：
27.dmpr-lux s 5：
‘
cagaaagcatgccggggatccctagccttcgatgccgatttt 3’；
28.dmpr lux a 5：
‘
agtctgcagctcgagggatcctgcgcacacggatgtaacg 3’其中，大写字母为载体上的同源臂序列。
29.本发明还公开了所述的全细胞生物传感器检测苯酚浓度的方法，包括以下步骤：
30.(1)利用已知浓度梯度稀释的苯酚溶液中加入权利要求5所述的全细胞生物传感器菌液后的相对发光强度，绘制苯酚浓度与相对发光强度之间标准曲线；
31.(2)另将待测样品加入同步骤(1)od值的全细胞生物传感器菌液中，读取样品的相对发光强度，根据相对发光强度，判断样品中是否含有苯酚或计算样品中的苯酚浓度。
32.所述的全细胞生物传感器检测苯酚浓度的方法，包括以下步骤：
33.(1)将od值为0.4-0.5的100μl所述的全细胞生物传感器菌液与100μl梯度稀释的苯酚溶液和灭菌水以1：1的比例进行混合，加入到96孔板中；
34.(2)将96孔板固定于摇床内，在37℃，180rpm的条件下孵育2小时，读取相对发光强度；
35.(3)根据不同浓度的苯酚与相对发光强度之间的关系，进行拟合作图得到标准曲线。
36.本发明有益的技术效果如下：
37.本发明构建一种用于检测苯酚溶度的全细胞生物传感器，所用的细菌从健康c57
小鼠肠道中分离得到，对环境没有毒害作用，且操作简便，步骤简单，无需进行特定的操作培训，也不需要在测定前准备相关的试剂，可特异性检测待测样品的苯酚含量，灵敏度高，浓度范围为10nmol/l～0.1mmol/l，检出限仅为0.1nmol/l，且无需添加其他昂贵试剂，如luciferin等。
38.ps01菌株是兼性厌氧细菌，虽然最适宜的生存温度为37℃，但是在室温下也可以发挥功效，对操作环境没有特定的需求。
附图说明
39.图1为本发明实施例2的质粒pcm-dmpr-lux的质粒图谱；
40.图2为本发明实施例4的苯酚全细胞生物传感器在完全暗室，曝光时间为60s，对0.01nmol/l～10000nmol/l苯酚和水响应情况的拍摄照片；
41.图3为本发明实施例4的苯酚全细胞生物传感器根据苯酚浓度与发光数值进行分析拟合绘制的标准曲线；
42.图4为本发明实施例4的苯酚全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l苯酚的响应情况示意图；
43.图5为本发明实施例5的苯酚全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l对甲酚的响应情况示意图；
44.图6为本发明实施例5的苯酚全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l邻苯二酚的响应情况示意图；
45.图7为本发明实施例5的苯酚全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l 4-乙基苯酚的响应情况示意图；
46.图8为本发明实施例6的escherichia coli dh5α全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l苯酚的响应情况示意图；
47.图9为本发明实施例实施例6的益生菌escherichia coli nissle1917全细胞生物传感器对浓度0.01nmol/l～10000nmol/l苯酚的响应情况示意图。
具体实施方式
48.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
49.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
50.实施例1ps01菌株筛选
51.取spf级小鼠，解剖并将小鼠的结肠内容物置于100ml lb培养基中，37℃180rpm震荡混匀2小时，取50μl带有小鼠肠道内容物的液体，10倍梯度稀释两次后，于lb固体培养基上使用接种棒均匀涂抹。
52.于37℃、有氧的条件下进行12小时培养，等待固体培养基上长出菌落后，挑取大量单菌落进行16s测序，测定所挑菌种所属种属，并选取所占丰度最大的单菌为无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacter amalonaticus)，将其命名为ps01。于2022年07月11日保藏于中国典
型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20221071。
53.ps01菌株在lb培养基顺利生长，在37℃、有氧的条件下，划线12小时后可见白色半透明的规则圆形菌落。
54.ps01可在以20mmol/l柠檬酸作为唯一碳源的m9液体基础培养基内生长。
55.配置lb固体培养基：每一升的超纯水中加入10g氯化钠，10g胰蛋白胨以及5g酵母提取物，每100ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉。
56.配置m9培养基：每一升超纯水中加入12.8g七水合磷酸氢二钠，3.0g磷酸氢二钾，0.5g氯化钠。1g氯化铵配置成5x的m9母液，使用时将20ml的m9母液与80ml的超纯水，200μl的氯化镁，20μl的氯化钙混合，配置成1x的m9培养基。
57.实施例2质粒pcm-dmpr-lux构建
58.根据已有文献报道【gupta s,saxena m,saini n,et al.an effective strategy for a whole-cell biosensor based on putative effector interaction site of the regulatory dmpr protein[j].plos one,2012,7(8):e43527.】，菌株cf600存在编码苯酚羟化酶的基因簇dmp家族，其中，dmpr基因是一种可以对苯酚产生特异性响应的增强子，并且调控从po启动子开始的一系列基因转录。将构建的质粒pcm-dmpr-lux利用dmpr对苯酚的特异性响应机制，在po启动子的下游连接lux cdabe报告基因，dmpr-lux作为传感器的主要作用部分。
[0059]
(1)构建pcm-lux载体
[0060]
使用同源重组的方法将lux cdabe报告基因连接进入pcmgfp-lacz质粒，构建pcm-lux载体；；其中，pcmgfp-lacz是已知质粒，在文献中曾有报道
[0061]
【zhang wm,zhang jj,jiang x,chao hj,zhou ny.2015.transcriptional activation of multiple operons involved in para-nitrophenol degradation by pseudomonas sp strain wbc-3.appl environ microbiol 81:220-230.】；扩增lux报告基因所采用的引物为：
[0062]
lux基因正向扩增引物：
[0063]
cagaaagcatgccggggatccctcgagctgcagactagtaggcttggaggatacgtatgac；
[0064]
lux基因反向扩增引物：
[0065]
cgtaatcatggtcatggatctcaactatcaaacgcttcggttaa；
[0066]
其中，小写下划线字母为载体上的同源臂序列，大写字母为通过引物添加的多克隆位点序列。
[0067]
(2)构建pcm-dmpr-lux载体
[0068]
使用同源重组的方法将菌株cf600编码苯酚羟化酶的基因簇dmp家族中的dmpr基因和po启动子连接进入pcm-lux，构建pcm-dmpr-lux载体；
[0069]
首先，委托北京擎科生物科技有限公司合成dmpr(包括po启动子)序列，如seq id no.2所示。使用同源重组的方式将dmpr(包括po启动子)序列连接进入pcm-lux，构建pcm-dmpr-lux载体。构建pcm-dmpr-lux的引物为：
[0070]
dmpr lux s：5
‘
cagaaagcatgccggggatccctagccttcgatgccgatttt 3’；
[0071]
dmpr lux a：5
‘
agtctgcagctcgagggatcctgcgcacacggatgtaacg 3’；
[0072]
其中，大写序列为载体上的同源臂序列。
[0073]
质粒pcm-dmpr-lux的质粒图谱如图1所示，其基因序列如seq id no.1所示。经测序确认后，pcm-dmpr-lux质粒构建完成。
[0074]
实施例3苯酚全细胞生物传感器构建
[0075]
将冻存于-80℃，25％甘油液体中的ps01在无抗性的lb固体培养基上划线复苏，于37℃有氧条件下倒置培养12小时。
[0076]
待菌落长出后，挑取单菌落于5ml的无抗性液体lb培养基中，于摇床中37℃，180rpm过夜培养至od值达到0.4-0.5之间。
[0077]
将菌液以1：100的比例接种到100ml的无抗性液体lb培养基中，于摇床中37℃，180rpm过夜培养至od值达到0.4-0.5之间。
[0078]
将菌液在冰上预冷30分钟，后将菌液在以4℃，4000rpm离心10分钟，彻底弃去上清液。
[0079]
使用1ml的预冷的灭菌1mol/l的氯化钙溶液将菌体重悬，在4℃，4000rpm条件下离心10分钟。
[0080]
弃去上清液，重复上述步骤一次。
[0081]
弃去上清液，每50ml的初始菌液使用2ml的含有15％氯化钙和25％甘油的溶液进行重悬，分装进入1.5ml的ep管中，每管分装100μl后冻存于-80℃冰箱中，待用。
[0082]
取10μl的pcm-dmpr-lux质粒，在冰上将其加入到100μl的上述ps01热激感受态细菌中，轻弹混匀后，于冰上孵育30分钟。
[0083]
将质粒和感受态细胞的混合物放置于42℃金属浴上，热激90s。热激后，转移至冰上孵育2分钟。再向其中加入600μl的无抗lb培养基后，于37℃，180rpm的摇床中复苏1小时。
[0084]
将100μl菌液涂布在带有四环素抗性的固体lb培养基上，37℃过夜培养。
[0085]
挑取固体培养基上的单菌落于带四环素抗性的液体培养基中，于37℃，180rpm的摇床中培养12小时，即完成苯酚全细胞生物传感器的构建。
[0086]
实施例4苯酚全细胞生物传感器检测苯酚浓度
[0087]
(1)绘制标准曲线
[0088]
利用已知浓度梯度稀释的苯酚溶液中加入全细胞生物传感器菌液后的相对发光强度，绘制苯酚浓度与相对发光强度之间标准曲线；
[0089]
实验组：将od在0.4-0.5之间的100μl ps01菌液与100μl梯度稀释的苯酚溶液以1：1的比例进行混合，加入到96孔板中，每个浓度梯度做三次重复；将od在0.4-0.5之间的100μl ps01菌液与100μl灭菌水混合，同样做三次重复；
[0090]
将96孔板固定于摇床内，在37℃，180rpm的条件下孵育2小时。
[0091]
在完全暗室条件下，通过60s曝光对加入了以菌液：溶液为1：1的混合溶液的96孔板进行拍照，如图2所示。
[0092]
使用biotek synergyh1实验室自动化工作站对96孔板进行发光读数与od600读数，将梯度稀释的苯酚溶液的读数绘制标准曲线。
[0093]
通过originlab对数据进行拟合，所得到的拟合曲线如表一所示，绘制的标准曲线如图3所示：
[0094]
表一
[0095][0096]
(2)另将待测样品加入同步骤(1)od值的全细胞生物传感器菌液中，读取样品的相对发光强度，根据相对发光强度，判断样品中是否含有苯酚或计算样品中的苯酚浓度。对于0.01nmol/l至10μmol/l
[0097]
(10000nmol/l)的浓度区间内的苯酚的响应情况如图4所示。
[0098]
实施例5苯酚全细胞生物传感器检测苯酚结构类似物
[0099]
将苯酚全细胞生物传感器与苯酚结构类似物(对甲酚，邻苯二酚，4-乙基苯酚)以1：1的比例混合(100μl：100μl)，对该苯酚全细胞生物传感器的特异性进行验证。
[0100]
将od在0.4-0.5之间的100μl ps01菌液与100μl梯度稀释的对甲酚，邻苯二酚以及4-乙基苯酚溶液以1：1的比例进行混合，加入到96孔板中，每个浓度梯度做三次重复；将od在0.4-0.5之间的100μl ps01菌液与100μl灭菌水混合，同样做三次重复；
[0101]
将96孔板固定于摇床内，在37℃，180rpm的条件下孵育2小时。
[0102]
使用biotek synergyh1实验室自动化工作站对96孔板进行发光读数。
[0103]
苯酚全细胞生物传感器对浓度在0.01nmol/l至10μmol/l(10000nmol/l)对甲酚的响应情况如图5所示；
[0104]
苯酚全细胞生物传感器对浓度在0.01nmol/l至10μmol/l(10000nmol/l)邻苯二酚的响应情况如图6所示；
[0105]
苯酚全细胞生物传感器对浓度在0.01nmol/l至10μmol/l(10000nmol/l)4-乙基苯酚的响应情况如图7所示；
[0106]
经测试，该苯酚全细胞生物传感器对苯酚结构类似物的灵敏度较低，且对这三种苯酚结构类似物的最低检出限均高于苯酚。
[0107]
实施例6
[0108]
将pcm-dmpr-lux质粒通过热激的方法转入感受态细胞escherichia coli dh5α和益生菌escherichia coli nissle1917中，所得携带有pcm-dmpr-lux的菌株同样以1：1的体积比加入到梯度稀释的苯酚溶液中，使用biotek synergyh1实验室自动化工作站对其发光读数进行记录并整理，并与ps01菌株进行比较。
[0109]
escherichia coli dh5α全细胞生物传感器对浓度在0.01nmol/l至10μmol/l(10000nmol/l)苯酚的响应情况如图8所示。
[0110]
益生菌escherichia coli nissle1917全细胞生物传感器对浓度在0.01nmol/l至10μmol/l(10000nmol/l)苯酚的响应情况如图9所示。
[0111]
经测试，escherichia coli dh5α全细胞生物传感器的最低检出限为1nmol/l，益生菌escherichia coli nissle1917全细胞生物传感器的最低检出限为100nmol/l，两者均高于本发明的ps01菌株，说明ps01菌株相较于escherichia coli dh5α和益生菌escherichia coli nissle1917对苯酚有着更好的响应度。
[0112]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种无丙二酸柠檬酸杆菌citrobacter amalonaticus ps01(以下简称ps01)，其特征在于，其于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20221071。2.权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌在检测苯酚浓度上的应用。3.权利要求2所述的无丙二酸柠檬酸杆菌在构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器上的应用。4.一种构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器，其特征在于，权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌ps01转入有质粒pcm-dmpr-lux。5.根据权利要求4所述的全细胞生物传感器，其特征在于，所述的质粒pcm-dmpr-lux的基因如seq id no.1所示。6.权利要求5所述的全细胞生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pcm-lux载体使用同源重组的方法将lux报告基因连接进入pcmgfp-lacz质粒，构建pcm-lux载体；(2)构建pcm-dmpr-lux载体使用同源重组的方法将菌株cf600编码苯酚羟化酶的dmpr基因和po启动子连接进入pcm-lux，构建pcm-dmpr-lux载体；(3)将构建好的pcm-dmpr-lux载体测序确认后，转入所述的无丙二酸柠檬酸杆菌ps01中，即完成全细胞生物传感器的构建。7.根据权利要求6所述的全细胞生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤(1)扩增lux cdabe报告基因所采用的引物为：正向扩增引物：cagaaagcatgccggggatccctcgagctgcagactagtaggcttggaggatacgtatgac，反向扩增引物：cgtaatcatggtcatggatctcaactatcaaacgcttcggttaa；其中，小写下划线字母为载体上的同源臂序列。8.根据权利要求6所述的全细胞生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤(2)构建pcm-dmpr-lux的引物为：dmpr-lux s：cagaaagcatgccggggatccctagccttcgatgccgatttt；dmprlux a：agtctgcagctcgagggatcctgcgcacacggatgtaacg其中，大写字母为载体上的同源臂序列。9.使用权利要求5所述的全细胞生物传感器检测苯酚浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用已知浓度梯度稀释的苯酚溶液中加入权利要求5所述的全细胞生物传感器菌液后的相对发光强度，绘制苯酚浓度与相对发光强度之间标准曲线；(2)另将待测样品加入同步骤(1)od值的全细胞生物传感器菌液中，读取样品的相对发光强度，根据相对发光强度，判断样品中是否含有苯酚或计算样品中的苯酚浓度。10.根据权利要求9所述的全细胞生物传感器检测苯酚浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将od值为0.4-0.5的100μl所述的全细胞生物传感器菌液与100μl梯度稀释的苯酚溶液和灭菌水以1：1的比例进行混合，加入到96孔板中；(2)将96孔板固定于摇床内，在37℃，180rpm的条件下孵育2小时，读取相对发光强度；
(3)根据不同浓度的苯酚与相对发光强度之间的关系，进行拟合作图得到标准曲线。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种无丙二酸柠檬酸杆菌及其在检测苯酚浓度上的应用，具体公开了该杆菌在构建检测苯酚浓度全细胞生物传感器上的应用，包括苯酚浓度全细胞生物传感器及其构建方法、与检测苯酚浓度的方法。该杆菌于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 20221071。本发明生物传感器可特异性检测待测样品的苯酚含量，灵敏度高，浓度范围为10nmol/L～0.1mmol/L，检出限仅为0.1nmol/L，且无需添加其他昂贵试剂，如luciferin等。如luciferin等。如luciferin等。


技术研发人员：高义舟 金文煜 菲利普
受保护的技术使用者：中国科学院上海巴斯德研究所
技术研发日：2022.09.30
技术公布日：2023/9/20