荧光标志物的检测方法及检测设备与流程

1.本发明涉及荧光检测技术领域，特别是涉及一种荧光标志物的检测方法及检测设备。


背景技术：

2.常规免疫组织化学/免疫荧光(ihc/if)通常用作组织病理学领域的诊断技术，但存在一定的局限性。其中最主要的局限性是这种技术每次只能检测组织样本上的一个标记物。这可能导致患者样本中重要的预后和诊断信息的错失。以肿瘤浸润性cd8+t细胞为例，可以通过识别cd8、cd3、foxp3和cd20等抗原的表达来识别cd8+t细胞，单独识别其中的一种抗原可能会导致假阳性或者假阴性的问题。同样的，单一抗原的识别也会导致基于ihc/if生物标记评估的另一个缺点——高观察者间变异性，不同人对于同一张切片由于缺乏多种判断依据的相互佐证而导致主观的、不可重复的评估结果。
3.为了解决上述问题，近年来研究者开发出了多重免疫组织化学/免疫荧光(mihc/if)技术，该技术允许在单个组织切片上同时检测多个标记物，并已开始在研究和临床环境中引入使用。通过mihc/if技术可以提供有关癌症微环境、预后、治疗和复发的关键信息；可以使用多重检测的方法同时检查肿瘤微环境的不同组成部分，从而深入了解肿瘤-宿主界面上存在的生物串扰，并提供从亚细胞水平到细胞群水平的信息；可以同时评估多个生物标志物的表达和定位以及它们在细胞之间的共表达或相互作用情况。
4.为了实现多重免疫组织化学/免疫荧光(mihc/if)，目前主要有以下实现途径：基于非荧光的多重成像技术以及基于荧光的多重成像技术。
5.其中基于非荧光的多重成像技术包括多重免疫组织化学连续染色技术、质谱成像技术等。多重免疫组织化学连续染色技术本质是传统免疫组织化学的多次重复实验(可以理解为一次制片、成像就是形成了针对一个标志物的一个图层，通过多个图层的叠加成一张图片，图片中含有反复叠加的多种标志物，从而实现多元检测)。由于需要多次图片叠加，过程复杂；需要反复洗脱底物、抗体剥离、孵育、拍片、制样，时间长。基于质谱的成像技术是通过质谱法对固定细胞或组织的元素或分子成分进行可视化呈现的技术，通过区分不同标志物的分子量或者不同标签的分子量，从而实现多元检测。但是基于质谱的成像技术相对不成熟、成本高昂且扫片速度慢，限制了其发展。
6.基于荧光的多重成像技术包括传统的基于不同荧光发射光谱峰的位置的多重免疫荧光成像技术、基于光谱拆分和分析的多光谱成像技术以及迭代顺序抗体标记和成像技术(mxif和cycif)等。其中基于不同荧光发射光谱峰的位置的多重免疫荧光成像技术成像速度快，技术成熟、应用的最多，但是由于荧光发射光谱的光谱重叠的限制，目前用于多重免疫荧光的成像系统一般最多可以实现4-6个荧光标记的标志物的同时检测，这无法满足对与肿瘤组织、癌旁组织、肿瘤微环境的多标志物联合检测的需求。基于光谱拆分和分析的多光谱成像技术(比如akoya biosciences公司开发出的自动定量病理成像系统)通过识别、拆分重叠的荧光信号，能够识别和量化多个重叠的生物标志物(最多8个)，而不
会因为信号彼此不混合而受到自发荧光的干扰。但是由于多光谱成像技术扫描、解析速度慢，因此相比于常规的成像技术，多光谱成像技术的成像速度非常慢，通量难以提升；此外，多光谱成像技术的成本高昂，需要特别的仪器才能进行成像分析，而多光谱成像技术掌握在akoya、perkinelmer等公司的手中，这就导致这种技术的普适性不高。迭代顺序抗体标记和成像技术通过反复染色—成像—猝灭(抗原修复)的循环实现多元检测，这种方式理论上可以突破荧光发射光谱重叠的限制进行更多元的检测，但是这种方式非常耗时；且抗原与抗体的反应性可能会由于反复的抗原修复而降低，从而导致检测结果出现偏差；同时，多次成像之间需要图像重叠，重叠过程中容易发生位移，导致成像效果不好。因此，亟待开发出一种新的低成本、适用于现有仪器、操作方便的超多元多重编码技术。


技术实现要素：

7.为解决现有技术的不足，本发明提出一种荧光标志物的检测方法及检测设备。区别于传统的mihc/if技术基于荧光的发射光谱峰的位置差异进行编码，本发明同时利用荧光材料的发射光谱峰的位置差异以及斯托克斯位移的差异进行共编码，不依赖迭代顺序抗体标记和成像技术就可以实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元检测，适用于常规的成像仪器、成本低、扫描速度快。
8.为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
9.本发明第一方面公开了一种荧光标志物的检测方法，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。
10.进一步地，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和斯托克斯位移的差异进行共编码。
11.进一步地，所述荧光材料组合包括无机荧光材料之间的组合、有机荧光材料之间的组合或所述无机荧光材料及所述有机荧光材料之间的组合。
12.进一步地，所述荧光材料组合中，至少有一种荧光材料的斯托克斯位移与其余各种荧光材料的斯托克斯位移差值为50nm以上；和/或至少有一种荧光材料为反斯托克斯位移，区别于其余各种荧光材料的斯托克斯位移。
13.进一步地，所述无机荧光材料至少包括量子点、上转换纳米粒子中一种或几种。
14.进一步地，所述量子点包括硅量子点、锗量子点、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点、硒化锌量子点、硫化铅量子点、硒化铅量子点、磷化铟量子点、砷化铟量子点、碳量子点中的一种或几种。所述量子点优选为系列纳米晶体。
15.进一步地，所述上转换纳米粒子优选为由无机纳米晶摻杂稀土离子构成的材料。优选的，所述上转换纳米粒子为无机纳米晶摻杂钇离子构成的材料。更优选的，所述上转换纳米粒子为含有nayf4的材料。
16.进一步地，所述有机荧光材料至少包括有机荧光染料、有机小分子发光材料、有机高分子发光材料、荧光蛋白中的一种或几种。
17.进一步地，所述有机荧光染料包括系列荧光染料、alexa系列荧光染料、evolve
tm
系列荧光染料、opal系列荧光染料、异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明系列荧光染料、花青类荧光染料、德克萨斯红、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、碘化丙啶(pi)、hoechst 33342中的一种或几种。
18.进一步地，所述有机小分子发光材料包括恶二唑及其衍生物类、三唑及其衍生物类、香豆素类衍生物、1,8-萘酰亚胺类衍生物、吡唑啉衍生物、三苯胺类衍生物、卟啉类化合物、咔唑类衍生物、吡嗪类衍生物、噻唑类衍生物、苝类衍生物中的一种或几种。
19.进一步地，所述有机高分子发光材料包括共轭聚合物结构的发光材料或侧链聚合物发光材料，优选为聚苯、聚噻吩、聚芴、聚三苯基胺及其衍生物中的一种或几种。
20.进一步地，所述荧光蛋白包括藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、绿色荧光蛋白(gfp)中的一种或几种。
21.进一步地，所述荧光材料组合为量子点、有机荧光染料、上转换纳米粒子中任意两种或三种的组合。
22.进一步地，所述有机荧光染料的斯托克斯位移＜150nm，优选为＜50nm；所述量子点的斯托克斯位移＞150nm，优选为＞200nm；所述上转换纳米粒子为反斯托克斯位移，优选为＜-100nm。
23.进一步地，所述斯托克斯位移表示发射光谱峰的位置与激发光谱峰的位置的差值，当所述差值＞0时，称为斯托克斯位移；当所述差值＜0时，称为反斯托克斯位移。
24.进一步地，所述基于荧光材料组合中各个荧光材料发射光谱峰的位置差异进行编码包括对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码，若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应一个特定的目标检测物，则进行第一重编码；若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应至少两个特定的目标检测物，则进行第二重编码。
25.进一步地，所述基于荧光材料组合中各种荧光材料斯托克斯位移的差异进行编码包括对发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料用不同的斯托克斯位移或不同的反斯托克斯位移或斯托克斯位移与反斯托克斯位移的差异进行第二重编码。
26.进一步地，所述对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码包括以下步骤：
27.步骤s1、将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系；
28.步骤s2、将标记有不同荧光材料的反应物与待测样本进行反应；
29.步骤s3、根虎荧光材料的种类选择对应的荧光通道，检测设备自动切换与荧光通道相对应的第二滤光片进行滤光；
30.步骤s4、用各种激发光激发不同的荧光材料，其中，发射光谱峰的位置不可区分的荧光材料的发射光通过相同的荧光通道对应的同一第二滤光片；发射光谱峰的位置可区分的荧光材料的发射光通过不同的荧光通道对应的不同第二滤光片；
31.步骤s5、用检测器检测通过不同的第二滤光片滤光后的发射光；
32.步骤s6、根据检测器检测到的经过不同第二滤光片滤光后的结果，确定待测样本中适配于同一第二滤光片的一种或几种荧光材料；
33.步骤s7、当适配于同一第二滤光片仅有一种荧光材料时，通过第一重编码即可确定所述荧光材料的种类及强度，并进一步确定所述荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的种类及含量。
34.进一步地，所述对发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料用不同的斯托克斯位移或不同的反斯托克斯位移进行第二重编码包括以下步骤：
35.步骤s8、对步骤s6中所述待测样本中适配于同一第二滤光片的几种荧光材料，用
不同的激发光进行激发；其中，所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料为具有相同或相近发射光谱峰的位置的荧光材料；
36.步骤s9、用检测器检测通过同一第二滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光；
37.步骤s10、根据不同的激发光、发射光和/或第二滤光片信息进一步确定所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料的种类，从而进一步确定所述荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的种类及含量。
38.进一步地，所述目标检测物包括蛋白、核酸、脂类、小分子化合物、细胞、细胞外囊泡、外泌体中的一种或几种。
39.进一步地，所述反应物包括可以与所述目标检测物发生特异性反应的抗体、核酸、配体中的一种或几种。
40.进一步地，所述将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系包括通过化学交联、生物偶联或物理交联的方法使不同的荧光材料与相对应的反应物交联在一起。
41.进一步地，如上所述的检测方法应用于免疫组织化学和/或免疫荧光领域。
42.本发明第二方面公开了一种荧光标志物的检测设备，所述检测设备包括使用如上所述的检测方法进行检测。
43.进一步地，所述检测设备包括激发光光源，所述激发光光源包括多个波长范围较窄的光源所产生的激发光和/或波长范围较广的光源所产生的激发光；所述激发光光源至少包括紫外光波段、可见光波段、红外光波段中的两个或两个以上。
44.进一步地，所述检测设备还包括滤光片，所述滤光片包括第二滤光片组和/或第一滤光片组；所述第二滤光片组用于对所述荧光材料的发射光进行过滤；所述第一滤光片组用于对所述波长范围较广的光源所产生的激发光进行过滤得到多个特定波长范围的激发光。
45.进一步地，所述检测设备还包括检测器，所述检测器用于检测所述荧光材料经过所述激发光激发，并经过所述第二滤光片组过滤后的发射光。
46.本发明的有益效果为：
47.采用本发明所述荧光标志物的检测方法及检测设备，通过不同发射光谱峰的位置编码以及不同斯托克斯位移的编码理论上最多可以实现的编码数＝不同发射光谱峰的位置的个数
×
不同激发光的个数。通过该种共编码方式可以打破荧光发射光谱重叠的限制，实现多重免疫组织化学/免疫荧光(mihc/if)的超多元编码。该方法不依赖迭代顺序抗体标记和成像技术、不需要多光谱成像技术就可以实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元检测，适用于常规的成像仪器、成本低、扫描速度快。
附图说明
48.图1是本发明实施例中不同有机荧光染料、量子点的发射光谱。其中图1a为有机荧光染料的发射光谱；图1b为量子点的发射光谱；图1c为有机荧光染料和量子点发射光谱的重叠。
49.图2是本发明实施例中不同有机荧光染料、量子点的激发光谱(虚线)以及发射光
谱(色块)。其中图2a为有机荧光染料的激发光谱(虚线)以及发射光谱(色块)；图2b为量子点的激发光谱(虚线)以及发射光谱(色块)谱。
50.图3是本发明实施例中上转换纳米粒子的激发光谱(虚线)以及发射光谱(色块)。
51.图4是本发明实施例中具有相同或相近发射光谱峰的位置(色块)的量子点和有机荧光染料的激发光(虚线)的差异。其中图4a为发射光谱峰的位置相近的alexa 488有机荧光染料和qdot 525量子点激发光的差异；其中图4b为发射光谱峰的位置相近的alexa 532有机荧光染料和qdot 565量子点激发光的差异；其中图4c为发射光谱峰的位置相近的alexa 568有机荧光染料和qdot 605量子点激发光的差异；其中图4d为发射光谱峰的位置相近的alexa 635有机荧光染料和qdot 655量子点激发光的差异；其中图4e为发射光谱峰的位置相近的alexa 680有机荧光染料和qdot 705量子点激发光的差异。
52.图5是本发明实施例中基于发射光谱、斯托克斯位移共编码的多重免疫组织化学/免疫荧光技术原理示意图。
53.图6是本发明实施例中基于发射光谱、斯托克斯位移共编码的多重免疫组织化学/免疫荧光技术的操作流程示意图。
54.图7是本发明实施例中基于发射光谱、斯托克斯位移共编码的多重免疫组织化学/免疫荧光的检测结果示意图。
具体实施方式
55.为了更清楚的理解本发明的内容，下面结合附图、具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
56.本发明中，所述激发光指的是与荧光材料的激发光谱相匹配的具有特定波长的光。所述激发光可以使荧光材料发生光致发光现象，产生另一种波长的发射光。所述激发光光源包括波长范围较广的光源，如汞灯、氙灯、卤素灯，以及波长范围较窄的光源，如各色激光。
57.本发明中，所述斯托克斯位移(stokes shift)和所述反斯托克斯位移(anti-stokes shift)指的是发射光谱和吸收光谱最高峰中间的差值，当差值》0为斯托克斯位移，当差值《0为反斯托克斯位移。
58.常规检测方法及检测设备对于特定发射光谱峰的位置的荧光材料会用特定的一个激发光进行激发，发射光谱峰的位置和激发光是一对一的关系。而在本发明中，发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料具有不同的斯托克斯位移或反斯托克斯位移，表示发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料需要用不同的激发光进行激发。示例性的，荧光材料中对于具有相同或相近的发射光谱峰的位置的量子点、有机荧光染料和上转换纳米粒子，其中，所述量子点有着非常大的斯托克斯位移，其发射光谱峰的位置一般在可见光范围，一般选择在紫外范围的激发光进行激发；本发明中量子点用紫外或近紫外波段的激发光激发；所述有机荧光染料有着较小的斯托克斯位移，发射光谱的一般在可见光范围，其激发光谱在发射光谱附近，一般也在可见光范围内，本发明中有机荧光染料用可见光波段的激发光激发；所述上转换纳米粒子为反斯托克斯位移，其发射光谱一般在可见光范围，但是其激发光在近红外范围，本发明中上转换纳米粒子用近红外波段的激发光进行激发。
59.本发明中所有的量子点均购买自thermofisher的系列纳米晶体。
60.本发明中所有的荧光染料均购买自thermofisher的alexa系列荧光染料。
61.本发明中上转换纳米粒子购买自江苏先丰纳米材料科技有限公司。
62.本发明中抗体购买自biolegend公司。
63.本发明成像所用的仪器改装自olympus公司的slideview vs200。
64.下面以具体地实施例对本技术的技术方案以及本技术的技术方案如何解决上述技术问题进行详细说明。下面这几个具体的实施例可以相互结合，对于相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。下面将结合附图，对本技术的实施例进行描述。
65.实施例1多重免疫组织化学/免疫荧光技术样本的制备
66.本实施例优选地，选取在组织中高表达的蛋白对应的抗体：抗gapdh抗体、抗α-肌动蛋白抗体、抗β-肌动蛋白抗体、抗α-微管蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体、抗转铁蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗纤层蛋白b1抗体、抗pcna抗体、抗sdha抗体、抗组蛋白抗体。
67.本实施例优选地，针对上述抗体选取量子点、有机荧光染料、上转换纳米粒子作为荧光材料组合。
68.本实施例优选地，将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系，优选为通过化学交联、生物偶联或物理交联的方法使不同的荧光材料与相对应的反应物交联在一起。
69.其中，抗gapdh抗体、抗α-肌动蛋白抗体、抗β-肌动蛋白抗体、抗α-微管蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体分别按照说明书用qdot 525、qdot 565、qdot 605、qdot 655、qdot 705标记；抗转铁蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗纤层蛋白b1抗体、抗pcna抗体、抗sdha抗体分别按照说明书用alexa fluor 488、alexa fluor 532、alexa fluor 568、alexa fluor 635、alexa fluor 680标记；抗组蛋白抗体用上转换纳米粒子标记。
70.本实施例优选地，样本前处理方法包括以下步骤：
71.ffpe制备的4μm厚的石蜡组织切片通过二甲苯进行脱蜡，之后经过100％、95％、85％、75％的梯度乙醇复水；
72.抗原修复利用预热的表位修复试剂，微波炉抗原热修复15min，然后利用3％h2o2室温孵育10min进行内源过氧化氢酶灭活；
73.利用10％的羊血清室温温育20min以封闭非特异性表位；
74.用标记了荧光材料的一抗放置于4℃的冰箱过夜处理；
75.用tbst洗5min
×
3次，样本制备完成。
76.其中，所述标记了荧光材料的一抗分别为标记了qdot 525的抗gapdh抗体、标记了qdot 565的抗α-肌动蛋白抗体、标记了qdot 605的抗β-肌动蛋白抗体、标记了qdot 655的抗α-微管蛋白抗体、标记了qdot 705的抗β-微管蛋白抗体、标记了alexa fluor 488的抗转铁蛋白抗体、标记了alexa fluor 532的抗细胞角蛋白抗体、标记了alexa fluor 568的抗纤层蛋白b1抗体、标记了alexa fluor 635的抗pcna抗体、标记了alexa fluor 680的抗sdha抗体以及标记了上转换纳米粒子的抗组蛋白抗体。
77.需要注意的是，样本制备过程有多种方法，只要制备的样本在成像过程中应用了发射光谱峰的位置和激发光的共编码，均落入本发明的保护范围内。
78.本实施例选择的样本及荧光材料是示例性的，仅用于解释本技术，而不能解释为对本技术的限制。
79.实施例2多重免疫组织化学/免疫荧光技术样本基于发射光谱峰的位置的编码
80.对实施例1中制备的样本用slideview vs200多元荧光显微镜进行成像，成像结果如下：
81.对标记了alexa fluor 488的抗转铁蛋白抗体、标记了alexa fluor 532的抗细胞角蛋白抗体、标记了alexa fluor 568的抗纤层蛋白b1抗体、标记了alexa fluor 635的抗pcna抗体、标记了alexa fluor 680的抗sdha抗体进行成像，成像结果如图1a所示，图1a中从左到右分别为有机荧光染料alexa fluor 488、alexa fluor 532、alexa fluor 568、alexa fluor 635、alexa fluor 680的荧光发射光谱，我们可以通过有机荧光染料的不同发射光谱峰的位置对相应的标志物进行编码，最多同时进行5种编码；
82.同样，我们对标记了qdot 525的抗gapdh抗体、标记了qdot 565的抗α-肌动蛋白抗体、标记了qdot 605的抗β-肌动蛋白抗体、标记了qdot 655的抗α-微管蛋白抗体、标记了qdot 705的抗β-微管蛋白抗体进行成像，成像结果如图1b所示，图1b中从左到右分别为量子点qdot 525、qdot 565、qdot 605、qdot 655、qdot 705的荧光发射光谱，我们可以通过量子点的不同发射光谱峰的位置对相应的标志物进行编码，最多同时进行5种编码；
83.但是由于量子点和有机荧光染料的发射光谱存在重叠，如图1c所示，因此尽管我们可以通过发射光谱峰的位置差异对有机荧光染料和量子点都可以分别进行5种编码，但事实上由于量子点和有机荧光染料的发射光谱存在重叠的影响，因此最多还是只能进行5种编码。
84.实施例3多重免疫组织化学/免疫荧光技术样本基于斯托克斯位移进行编码的可行性分析
85.对实施例1中制备的样本上的荧光材料的光谱进行分析，分析结果如图2、图3所示：
86.图2a从左往右分别为有机荧光染料alexa fluor 488、alexa fluor 532、alexa fluor 568、alexa fluor 635、alexa fluor 680的荧光发射光谱(色块)以及激发光谱(虚线)；图2b从左往右分别为量子点qdot 525、qdot 565、qdot 605、qdot 655、qdot 705的荧光发射光谱(色块)以及激发光谱(虚线)；图3为上转换纳米粒子的激发光谱(虚线)以及发射光谱(色块)。综合图2和图3我们可以看出有机荧光染料、量子点和上转换粒子的发射光谱有重叠，但是他们的激发光谱有明显区别。有机荧光染料的激发光一般在可见光范围内(400-800nm)，而相同发射波长的量子点的激发光一般在紫外区域(《400nm)，相同发射波长的上转换纳米粒子的激发光一般在红外区域(》800nm)，这是由于有机荧光染料、量子点和上转换粒子具有不同的斯托克斯位移或反斯托克斯位移造成的。
87.我们以发射光谱相同或相近的有机荧光染料alexa fluor 488和量子点qdot 525、有机荧光染料alexa fluor 532和量子点qdot 565、有机荧光染料alexa fluor 568和量子点qdot 605、有机荧光染料alexa fluor 635和量子点qdot 655、有机荧光染料alexa fluor 680和量子点qdot 705为例，通过图4对比这些组合的激发光可以看到，虽然这些组合的发射光谱相近或者重叠，但是激发光有明显区别，且相较于上转换纳米粒子的激发光(图3)均有显著差异。进一步证明了在不同荧光材料的发射光谱峰的位置相同或相近的情况下，通过不同的激发光进行编码的可行性。
88.实施例4多重免疫组织化学/免疫荧光技术样本基于发射光谱以及斯托克斯位移
的共编码
89.对实施例1中制备的样本用改装的slideview vs200多元荧光显微镜进行成像，改装的slideview vs200装配有可以发射紫外光的光源、可以发射红外光的光源、以及可见光范围内的激光(488nm的激光、532nm的激光、561nm的激光、637nm的激光、680nm的激光)以及相对应的第二滤光片evos light cube,gfp 2.0、evos light cube,yfp 2.0、evos light cube,rfp 2.0、定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)以及evos light cube,cy5 2.0：成像原理如图5所示，选择对应的荧光通道，用不同的激发光激发，用荧光通道对应的第二滤光片对发射光进行滤光后用检测器进行检测，记录对应的激发光、滤光片以及检测到的发射光，并根据上述信息判断荧光材料的种类，根据荧光材料与抗体的对应关系，确定抗体种类和蛋白的种类。
90.在本实施例中，所述基于荧光材料组合中各个荧光材料发射光谱峰的位置差异和斯托克斯位移的差异进行共编码包括以下步骤：
91.步骤s1、将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系；
92.步骤s2、将标记有不同荧光材料的反应物与待测样本进行反应；
93.步骤s3、根据荧光材料的种类选择对应的荧光通道，检测设备自动切换与荧光通道相对应的第二滤光片进行滤光；
94.步骤s4、用各种激发光激发不同的荧光材料，其中，发射光谱峰的位置不可区分的荧光材料的发射光通过相同的荧光通道对应的同一第二滤光片；发射光谱峰的位置可区分的荧光材料的发射光通过不同的荧光通道对应的不同第二滤光片；
95.步骤s5、用检测器检测通过不同的第二滤光片滤光后的发射光；
96.步骤s6、根据检测器检测到的经过不同第二滤光片滤光后的结果，确定待测样本中适配于同一第二滤光片的一种或几种荧光材料；
97.步骤s7、当适配于同一第二滤光片仅有一种荧光材料时，通过第一重编码即可确定所述荧光材料的种类及强度，并进一步确定所述荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的种类及含量；
98.步骤s8、对步骤s6中所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料，用不同的激发光进行激发；其中，所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料为具有相同或相近发射光谱峰的位置的荧光材料；
99.步骤s9、用检测器检测通过同一第二滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光；
100.步骤s10、根据不同的激发光、发射光和/或第二滤光片信息进一步确定所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料的种类，从而进一步确定荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的种类及含量。
101.具体实施方式如图6所示，其中步骤s1、s2的实施方式同实施例1所述，不同滤光片为第一重编码，不同斯托克斯位移(体现为不同激发光)为第二重编码；
102.针对evos light cube,gfp 2.0滤光片(第一重编码)：
103.步骤s3、选择滤光片evos light cube,gfp 2.0对应的荧光通道；
104.步骤s4、用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光；
105.步骤s5、用检测器检测经过evos light cube,gfp 2.0滤光后的结果；
106.步骤s6、检测器检测到经过evos light cube,gfp 2.0滤光后，在两种不同的激发光下都检测到了荧光，待测样本中适配于evos light cube,gfp 2.0滤光片的有两种荧光材料，判断需要进行第二重编码；
107.步骤s8、重新用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光材料；
108.步骤s9、用检测器检测通过evos light cube,gfp 2.0滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光(紫外光、488nm的激光)(第二重编码)；
109.步骤s10、能被紫外光激发、发射光可以通过evos light cube,gfp 2.0滤光片滤光的荧光材料为qdot 525，根据实施例1，qdot 525对应的是抗gapdh抗体，含有目标检测物gapdh蛋白，且根据图7，目标检测物gapdh蛋白的相对荧光强度为33％；能被488nm激光激发、发射光可以通过evos light cube,gfp 2.0滤光片滤光的荧光材料为alexa 488，根据实施例1，alexa 488对应的是抗转铁蛋白抗体，含有目标检测物转铁蛋白，且根据图7，目标检测物转铁蛋白的相对荧光强度为35％。
110.针对evos light cube,yfp 2.0滤光片(第一重编码)：
111.步骤s3、选择滤光片evos light cube,yfp 2.0对应的荧光通道；
112.步骤s4、用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光；
113.步骤s5、用检测器检测经过evos light cube,yfp 2.0滤光后的结果；
114.步骤s6、检测器检测到经过evos light cube,yfp 2.0滤光后，在两种不同的激发光下都检测到了荧光，待测样本中适配于evos light cube,yfp 2.0滤光片的有两种荧光材料，判断需要进行第二重编码；
115.步骤s8、重新用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光材料；
116.步骤s9、用检测器检测通过evos light cube,yfp 2.0滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光(紫外光、532nm的激光)(第二重编码)；
117.步骤s10、能被紫外光激发、发射光可以通过evos light cube,yfp 2.0滤光片滤光的荧光材料为qdot 565，根据实施例1，qdot 565对应的是抗α-肌动蛋白抗体，含有目标检测物α-肌动蛋白，且根据图7，目标检测物α-肌动蛋白的相对荧光强度为54％；能被532nm激光激发、发射光可以通过evos light cube,yfp 2.0滤光片滤光的荧光材料为alexa 532，根据实施例1，alexa 532对应的是抗角蛋白抗体，含有目标检测物角蛋白，且根据图7，目标检测物角蛋白的相对荧光强度为35％。
118.针对evos light cube,rfp 2.0滤光片(第一重编码)：
119.步骤s3、选择滤光片evos light cube,rfp 2.0对应的荧光通道；
120.步骤s4、用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光；
121.步骤s5、用检测器检测经过evos light cube,rfp 2.0滤光后的结果；
122.步骤s6、检测器检测到经过evos light cube,rfp 2.0滤光后，在两种不同的激发光下都检测到了荧光，待测样本中适配于evos light cube,rfp 2.0滤光片的有两种荧光材料，判断需要进行第二重编码；
123.步骤s8、重新用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光材料；
124.步骤s9、用检测器检测通过evos light cube,rfp 2.0滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光(紫外光、561nm的激光)(第二重编码)；
125.步骤s10、能被紫外光激发、发射光可以通过evos light cube,rfp 2.0滤光片滤
光的荧光材料为qdot 605，根据实施例1，qdot 605对应的是抗β-肌动蛋白抗体，含有目标检测物β-肌动蛋白，且根据图7，目标检测物β-肌动蛋白的相对荧光强度为64％；能被561nm激光激发、发射光可以通过evos light cube,rfp 2.0滤光片滤光的荧光材料为alexa 568，根据实施例1，alexa 568对应的是抗纤层蛋白b1抗体，含有目标检测物纤层蛋白b1，且根据图7，目标检测物纤层蛋白b1的相对荧光强度为32％。
126.针对定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片(第一重编码)：
127.步骤s3、选择定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)对应的荧光通道；
128.步骤s4、用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光；
129.步骤s5、用检测器检测经过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光后的结果；
130.步骤s6、检测器检测到经过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光后，在三种不同的激发光下都检测到了荧光，待测样本中适配于定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片的有两种荧光材料，判断需要进行第二重编码；
131.步骤s8、重新用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光材料；
132.步骤s9、用检测器检测通过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光(紫外光、637nm的激光、红外光)(第二重编码)；
133.步骤s10、能被紫外光激发、发射光可以通过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片滤光的荧光材料为qdot 655，根据实施例1，qdot 655对应的是抗α-微管蛋白抗体，含有目标检测物α-微管蛋白，且根据图7，目标检测物α-微管蛋白的相对荧光强度为27％；能被637nm激光激发、发射光可以通过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片滤光的荧光材料为alexa 635，根据实施例1，alexa 635对应的是抗pcna抗体，含有目标检测物pcna，且根据图7，目标检测物pcna的相对荧光强度为53％；能被红外光激发、发射光可以通过定制的滤光片(允许通过640-670nm的光)滤光片滤光的荧光材料为上转换纳米粒子，根据实施例1，上转换纳米粒子对应的是抗组蛋白抗体，含有目标检测物组蛋白，且根据图7，目标检测物组蛋白的相对荧光强度为57％。
134.针对evos light cube,cy5 2.0滤光片(第一重编码)：
135.步骤s3、选择滤光片evos light cube,cy5 2.0对应的荧光通道；
136.步骤s4、用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光；
137.步骤s5、用检测器检测经过evos light cube,cy5 2.0滤光后的结果；
138.步骤s6、检测器检测到经过evos light cube,cy5 2.0滤光后，在两种不同的激发光下都检测到了荧光，待测样本中适配于evos light cube,cy5 2.0滤光片的有两种荧光材料，判断需要进行第二重编码；
139.步骤s8、重新用紫外光、不同波长的激光、红外光激发样本上标记的荧光材料；
140.步骤s9、用检测器检测通过evos light cube,cy5 2.0滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光(紫外光、680nm的激光)(第二重编码)；
141.步骤s10、能被紫外光激发、发射光可以通过evos light cube,cy5 2.0滤光片滤光的荧光材料为qdot 705，根据实施例1，qdot 705对应的是抗β-微管蛋白抗体，含有目标检测物β-微管蛋白，且根据图7，目标检测物β-微管蛋白的相对荧光强度为36％；能被680nm
激光激发、发射光可以通过evos light cube,cy5 2.0滤光片滤光的荧光材料为alexa 680，根据实施例1，alexa 680对应的是抗sdha抗体，含有目标检测物sdha，且根据图7，目标检测物sdha的相对荧光强度为19％。
142.本发明还涉及一种荧光标志物的检测设备，所述检测设备包括激发光光源，所述激发光光源包括多个波长范围较窄的光源所产生的激发光和/或波长范围较广的光源所产生的激发光；所述激发光光源至少包括紫外光波段、可见光波段、红外光波段中的两个或两个以上。所述检测设备还包括滤光片，所述滤光片包括第二滤光片组和/或第一滤光片组；所述第二滤光片组用于对所述荧光材料的发射光进行过滤；所述第一滤光片组用于对所述波长范围较广的光源所产生的激发光进行过滤得到多个特定波长范围的激发光。所述检测设备还包括检测器，所述检测器用于检测所述荧光材料经过所述激发光激发，并经过所述第二滤光片组过滤后的发射光。
143.所述检测设备能够支持如上所述实施例所示的检测方法进行检测并实现相对应的技术效果。
144.以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

技术特征：
1.一种荧光标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和斯托克斯位移的差异进行共编码。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合包括无机荧光材料之间的组合、有机荧光材料之间的组合或所述无机荧光材料及所述有机荧光材料之间的组合。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合中，至少有一种荧光材料的斯托克斯位移与其余各种荧光材料的斯托克斯位移差值为50nm以上；和/或至少有一种荧光材料为反斯托克斯位移，区别于其余各种荧光材料的斯托克斯位移。5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述无机荧光材料至少包括量子点、上转换纳米粒子中一种或几种。6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述有机荧光材料至少包括有机荧光染料、有机小分子发光材料、有机高分子发光材料、荧光蛋白中的一种或几种。7.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述荧光材料组合为量子点、有机荧光染料、上转换纳米粒子中任意两种或三种的组合。8.如权利要求2至7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述基于荧光材料组合中各个荧光材料发射光谱峰的位置差异进行编码包括对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码，若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应一个特定的目标检测物，则进行第一重编码；若每一种可区分的发射光谱峰的位置对应至少两个特定的目标检测物，则进行第二重编码。9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述基于荧光材料组合中各种荧光材料斯托克斯位移的差异进行编码包括对发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料用不同的斯托克斯位移或不同的反斯托克斯位移或斯托克斯位移与反斯托克斯位移的差异进行第二重编码。10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述对不同荧光材料的不同发射光谱峰的位置进行第一重编码包括以下步骤：步骤s1、将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系；步骤s2、将标记有不同荧光材料的反应物与待测样本进行反应；步骤s3、根据荧光材料的种类选择对应的荧光通道，检测设备自动切换与荧光通道相对应的第二滤光片进行滤光；步骤s4、用各种激发光激发不同的荧光材料，其中，发射光谱峰的位置不可区分的荧光材料的发射光通过相同的荧光通道对应的同一第二滤光片；发射光谱峰的位置可区分的荧光材料的发射光通过不同的荧光通道对应的不同第二滤光片；步骤s5、用检测器检测通过不同的第二滤光片滤光后的发射光；步骤s6、根据检测器检测到的经过不同第二滤光片滤光后的结果，确定待测样本中适配于同一第二滤光片的一种或几种荧光材料；步骤s7、当适配于同一第二滤光片仅有一种荧光材料时，通过第一重编码即可确定所述荧光材料的种类及强度，并进一步确定所述荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的
种类及含量。11.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述对发射光谱峰的位置相同或相近的荧光材料用不同的斯托克斯位移或不同的反斯托克斯位移进行第二重编码包括以下步骤：步骤s8、对步骤s6中所述待测样本中适配于同一第二滤光片的几种荧光材料，用不同的激发光进行激发；其中，所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料为具有相同或相近发射光谱峰的位置的荧光材料；步骤s9、用检测器检测通过同一第二滤光片滤光后的发射光，并记录这些发射光所对应的激发光；步骤s10、根据不同的激发光、发射光和/或第二滤光片信息进一步确定所述适配于同一第二滤光片的几种荧光材料的种类，从而进一步确定所述荧光材料所对应的反应物以及目标检测物的种类及含量。12.如权利要求9至11任一项所述的检测方法，其特征在于，所述目标检测物包括蛋白、核酸、脂类、小分子化合物、细胞、细胞外囊泡、外泌体中的一种或几种。13.如权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述反应物包括可以与所述目标检测物发生特异性反应的抗体、核酸、配体中的一种或几种。14.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述将不同的荧光材料和不同的反应物之间建立相对应的关系包括通过化学交联、生物偶联或物理交联的方法使不同的荧光材料与相对应的反应物交联在一起。15.如权利要求9至11任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法应用于免疫组织化学和/或免疫荧光领域。16.一种荧光标志物的检测设备，其特征在于，所述检测设备包括使用如权利要求1至15任一项所述的检测方法进行检测。17.如权利要求16所述的检测设备，其特征在于，所述检测设备包括激发光光源，所述激发光光源包括多个波长范围较窄的光源所产生的激发光和/或波长范围较广的光源所产生的激发光；所述激发光光源至少包括紫外光波段、可见光波段、红外光波段中的两个或两个以上。18.如权利要求17所述的检测设备，其特征在于，所述检测设备还包括滤光片，所述滤光片包括第二滤光片组和/或第一滤光片组；所述第二滤光片组用于对所述荧光材料的发射光进行过滤；所述第一滤光片组用于对所述波长范围较广的光源所产生的激发光进行过滤得到多个特定波长范围的激发光。19.如权利要求18所述的检测设备，其特征在于，所述检测设备还包括检测器，所述检测器用于检测所述荧光材料经过所述激发光激发，并经过所述第二滤光片组过滤后的发射光。

技术总结
本发明提供了一种荧光标志物的检测方法及检测设备，所述检测方法包括基于荧光材料组合中各种荧光材料发射光谱峰的位置差异和/或斯托克斯位移的差异进行编码。该检测方法可以打破荧光编码受制于发射光谱重叠的限制，利用发射光谱以及斯托克斯位移共编码技术，实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元编码，同时该检测方法不依赖迭代顺序抗体标记和成像技术、不需要多光谱成像技术就可以实现多重免疫组织化学/免疫荧光的超多元检测，适用于常规的成像仪器、成本低、扫描速度快。扫描速度快。扫描速度快。


技术研发人员：盛滔 张亚楠
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：2022.03.11
技术公布日：2023/9/20