一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法。


背景技术：

2.皮肤长期被暴露于污染日益加剧的环境中，可能导致皮肤不稳定和功能障碍，从而导致皮肤老化、色素性皮肤病、脱发、一些免疫介导的皮肤病和结缔组织病的发生。现有的改善皮肤状况和治疗皮肤病的方法如护肤、激光、药物、手术和细胞疗法都未达到理想的皮肤修复和再生效果，并且没有在医疗恢复和美容需求之间取得令人满意的平衡。外泌体是细胞在正常或病理状态下通过胞吐作用分泌的一种囊泡，广泛存在于体液之中，其携带各种生物分子，包括蛋白质、核酸和脂质等。研究表明，干细胞外泌体免疫原性低，含有生长因子、抗炎成分等，不仅能够修复敏感肌，而且具有一定的抗炎、舒缓作用，可以促进敏感肌和衰老肌肤的修复，加快皮肤活力再生，具有促进组织再生、抗衰老和免疫调节等多种功能，可以同时实现再生医学和皮肤医学美学的双重效果。然而人体皮肤具有一定的屏障作用，活性物难以渗透到皮肤深层，这导致外泌体在经皮递送中的渗透效率一般，其治疗的有效剂量和浓度受到限制，良好的药效难以实现。
3.脂质体，由一个或多个双层膜形成的囊泡，主要成分通常是磷脂和胆固醇。由于具有良好的生物相容性、可生物降解性、低毒性以及能够包封亲水/亲脂性药物、实现药物靶向递送等优点，脂质体在化妆品、食品和制药工业中被广泛用作许多活性物质的递送载体。脂质体的磷脂双分子层结构与人体皮肤细胞相似，被称为“人工生物膜”，其可通过降低角质层脂质熔点、提高药物渗透量及提高囊泡可变形性等促进活性物质穿过皮肤屏障，渗透入更深层的皮肤，达到促渗效果。
4.因此，可结合干细胞外泌体的功效和脂质体技术在经皮递送中的应用，开发一种提高外泌体皮肤渗透效率的技术以更好地实现外泌体在皮肤病学和皮肤医学美学中的效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服外泌体在经皮递送中的不足，提供了一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法。所制得的复合物尺寸均一，分散均匀，具备良好的稳定性，同时保留了外泌体的特征蛋白。与细胞共培养时，该复合物不会影响细胞的增殖能力，具备良好的细胞相容性。在体外皮肤渗透中，该复合物可显著提高外泌体的累计渗透量。本发明的制备方法简单，制备过程无毒无害，成本低廉，制得的复合物便于储存，可显著改善外泌体的皮肤渗透效率，兼具干细胞外泌体的功效和脂质体在经皮递送中的优势，对于进一步推进外泌体制剂在皮肤渗透、皮肤修复、组织再生等皮肤性疾病及皮肤医学美学中的发展具有重大意义。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法，包括如下步骤：（1）外泌体的制备：通过超速离心法获得干细胞外泌体；（2）脂质体的制备：包括如下步骤：（a）取脂质成分溶解于有机溶剂中，水浴超声分散溶液；（b）使用旋转蒸发仪蒸发去除步骤（1）所得溶液中的有机溶剂，得到干燥的脂质膜；（c）在步骤（2）所得的脂质膜中加入pbs缓冲液以水化形成的脂质膜，然后在37 ℃恒温下振荡脂质溶液；（d）将步骤（3）所得的脂质溶液转移至离心管中，探头超声脂质溶液，即得脂质体；（3）将干细胞外泌体和脂质体按照蛋白质量:脂质质量=1:5混合，之后将混合液在37 ℃恒温摇床振荡孵育，制得干细胞外泌体脂质体复合物。
7.作为优选的，在上述的制备方法中，所述有机溶剂为甲醇和氯仿中的任意一种或两种混合。
8.作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（2）所述脂质成分为磷脂、胆固醇或功能性磷脂。
9.作为优选的，在上述的制备方法中，所述磷脂可来源于二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂（dh）、大豆卵磷脂（dd）、氢化卵磷脂和氢化大豆卵磷脂中的一种或两种；所述胆固醇来源于胆固醇及其衍生物和胆甾醇中的一种；所述功能性磷脂为dspe-mpeg、dspe-peg
2000
、dspe-peg
2000-cooh、dspe-peg
2000-mal、dspe-peg
2000-nhs、dspe-peg
2000-nh2、dspe-peg
2000-oh、dspe-peg
2000-sh、dspe-peg
2000-fa、dspe-peg
2000-biotin、dspe-peg
2000-galactose、dspe-peg
2000-mannose、dspe-peg
2000-fitc、dspe-peg
2000-rb 、中的一种或两种。
10.作为优选的，在上述的制备方法中，所述磷脂、胆固醇和功能性磷脂溶解于有机溶剂的质量体积分数分别为0.1~0.6%、0.01~0.04%、0.01~0.04%。
11.作为优选的，在上述的制备方法中，步骤（d）所述超声的条件为：功率160 w，45 khz，超声3 s，停止3 s；所述探头超声时间为3~10 min。
12.作为优选的，在上述的制备方法中，所述干细胞来源于人体的脂肪、骨髓、胎盘、脐带中的任意一种。
13.作为优选的，在上述的制备方法中，所述脂质成分为蛋黄卵磷脂（dh），溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.20%；所述探头超声时间为5 min。
14.作为优选的，在上述的制备方法中，所述胆固醇溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.02%。
15.作为优选的，在上述的制备方法中，所述dspe-peg
2000
溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.04%。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明以粒径和电位为评价指标，筛选优化磷脂种类、超声时间、磷脂浓度、胆固醇浓度，通过薄膜水化法制备具有均一粒径、良好分散性及稳定性、高透皮效率以用于经皮递送的脂质体；本发明制备的脂质体尺寸均一，分散均匀，稳定性良好，有利于储存，透皮效率高，该特性有利于改善外泌体的稳定性及皮肤渗透效率。
nh2、dspe-peg
2000-oh、dspe-peg
2000-sh、dspe-peg
2000-fa、dspe-peg
2000-biotin、dspe-peg
2000-galactose、dspe-peg
2000-mannose、dspe-peg
2000-fitc、dspe-peg
2000-rb 、中的一种或两种。
24.在一些实施方式中，所述磷脂、胆固醇和功能性磷脂溶解于有机溶剂的质量体积分数分别为0.1~0.6%、0.01~0.04%、0.01~0.04%。
25.在一些实施方式中，步骤（d）所述超声的条件为：功率160 w，45 khz，超声3 s，停止3 s；所述探头超声时间为3~10 min。
26.在一些实施方式中，所述干细胞来源于人体的脂肪、骨髓、胎盘、脐带中的任意一种。
27.在一些实施方式中，所述脂质体为蛋黄卵磷脂（dh），溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.20%；所述探头超声时间为5 min。
28.在一些实施方式中，所述胆固醇溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.02%；在一些实施方式中，所述dspe-peg
2000
溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.04%。
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅在于说明本发明而决不限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1：探究不同因素对脂质体粒径电位的影响（1）磷脂种类：分别按照质量体积分数0.2%、0.02%取蛋黄卵磷脂（dh）或大豆卵磷脂（dd）或二棕榈酰磷脂酰胆碱软磷脂（dppc）10 mg、胆固醇1mg溶解于5 ml甲醇中，水浴超声30 min分散溶液；使用旋转蒸发仪蒸发去除所得溶液中的有机溶剂，得到干燥的脂质膜；在所得的脂质膜中加入5 ml pbs缓冲液以水化形成的脂质膜，以120 rpm/min的速度在37 ℃恒温振荡脂质溶液30 min；将所得的脂质溶液转移至离心管中，探头超声所得脂质溶液，超声条件为：功率160 w，45 khz，超声3 s，停止3 s，共超声5 min，即得脂质体。检测不同磷脂制备的脂质体的粒径、电位及稳定性。
31.表1 不同种类的磷脂制备的脂质体的粒径电位磷脂种类size（nm）pdiζ（mv）dh96.19
±
1.500.40
±
0.10-9.78
±
1.20dd100.69
±
3.300.52
±
0.05-3.73
±
0.60dppc147.10
±
8.400.50
±
0.01-1.40
±
1.30表1表明，dh所制备的脂质体的平均粒径值更小，且pdi较小。同时，图1和图2结果表明dh制备的脂质体在37 ℃和4 ℃条件下的粒径与pdi都较dppc与dd制备的脂质体表现出更好的稳定性，且粒径的大小符合透皮性能的小粒径特征，并且37 ℃的稳定性说明其在经皮渗透时即接触皮肤温度下保持稳定，因此，可以确定dh作为制备用于经皮递送的脂质体的最佳磷脂成分。
32.（2）超声时间：在（1）的基础上，确定蛋黄卵磷脂作为磷脂成分，改变探头超声时间，检测不同探头超声时间制备的脂质体的粒径及电位。
33.表2 不同超声时间制备的脂质体的粒径电位超声时间（min）size（nm）pdiζ（mv）
379.20
±
5.100.22
±
0.02-11.87
±
1.59582.59
±
1.700.30
±
0.03-9.10
±
0.401096.19
±
1.500.40
±
0.10-9.80
±
1.20粒径越小，脂质体与皮肤角质层的粘附力越强，更容易透过皮肤屏障，因此由表2可知5 min为制备用于经皮递送的脂质体的最佳超声时间。
34.（3）磷脂浓度：在（1）和（2）的基础上，确定蛋黄卵磷脂和探头超声时间，改变磷脂浓度，检测不同磷脂浓度制备的脂质体的粒径及电位。
35.表3 不同磷脂浓度制备的脂质体的粒径电位磷脂浓度（w/v）质量（mg）size（nm）pdiζ（mv）0.10%5152.90
±
10.500.53
±
0.08-9.61
±
0.800.20%1082.60
±
1.700.31
±
0.03-9.06
±
0.420.40%2082.30
±
2.300.30
±
0.01-4.81
±
1.750.60%3076.51
±
2.000.36
±
0.02-6.73
±
2.01由表3可知，当磷脂浓度为0.20%时形成的脂质体粒径较小，电位绝对值较大，有利于维持稳定性，可知0.20%为制备用于经皮递送的脂质体的最佳磷脂浓度。
36.（4）胆固醇浓度：在（1）、（2）和（3）的基础上，确定蛋黄卵磷脂、探头超声时间和磷脂浓度，改变胆固醇浓度，检测不同胆固醇浓度制备的脂质体的粒径及电位。
37.表4 不同胆固醇浓度制备的脂质体的粒径电位胆固醇浓度（w/v）质量（mg）size（nm）pdiζ（mv）0.01%0.589.76
±
1.810.22
±
0.01-7.42
±
0.820.02%182.60
±
1.700.31
±
0.03-9.06
±
0.420.04%2122.03
±
2.760.15
±
0.04-8.76
±
0.18由表4可知，当胆固醇浓度为0.02%时，脂质体粒径较0.01%的胆固醇浓度形成的脂质体粒径小，且电位的绝对值更大，因此可知0.02%为制备用于经皮递送的脂质体的最佳胆固醇浓度。
38.（5）dspe-peg
2000
浓度：dspe-peg
2000
的引入有利于改善脂质体的稳定性，因此在（1）、（2）、（3）和（4）的基础上，确定蛋黄卵磷脂、探头超声时间、磷脂浓度和胆固醇浓度，在称取各组分加入甲醇中时，加入不同浓度的dspe-peg
2000
，检测不同dspe-peg
2000
浓度制备的脂质体的粒径及电位。
39.表5 不同胆固醇浓度制备的脂质体的粒径电位dspe-peg
2000
（w/v）质量（mg）size（nm）pdiζ（mv）0.02%1102.50
±
1.100.27
±
0.02-3.45
±
0.700.04%299.76
±
2.500.28
±
0.03-1.49
±
0.400.05%2.598.59
±
2.300.36
±
0.02-2.80
±
0.40由表5可知，不同浓度的 dspe-peg
2000
制备出的脂质体粒径相差不大。图3和图4结果表明当dspe-peg
2000
比例为0.04%（w/v）时，无论是在4 ℃还是37 ℃，脂质体的粒径变化都更为稳定，pdi也较小（pdi与之前未加入dspe-peg
2000
时相比也更小）可以确定0.04% 浓度作为制备用于经皮递送的脂质体的最佳dspe-peg
2000
浓度。
40.实施例2：促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备
℃恒温循环水浴。将制备好的皮肤平铺在供给池和接收池中间，用特定的夹子固定，皮肤角质层朝向供给池，皮下组织向接收池。接收池加满6 ml接收液（ph 7.2~7.4的pbs），排空气泡，37 ℃、300 r/min平衡1 h。在供给池中加入1 ml游离的罗丹明b（rb）、外泌体（exos）、脂质体（lip）和外泌体脂质体复合物（le）、醇质体/外泌体复合物，并使角质层完整成分的接触制剂。用封口膜将供给池密封以防止制剂挥发，不断搅拌接收液以确保制剂均匀分散；分别在设置的时间带点将接收液取出1 ml，每次取样后立即加入等量的新鲜接收液pbs进行补充。取出的样品进行测定和单位皮肤面积累计渗透量、累积渗透率计算。
48.结果如图9和图10所示，经过24 h的渗透实验，所有样品通过皮肤的累计渗透量和渗透率均随时间的延长而增加。24 h后，exos组的单位面积累计渗透量和累积渗透率与free组相似，表明外泌体的皮肤渗透性较差。与exos组相比，lip组和le组均显示出良好的皮肤渗透效果，两者在10 h内的单位面积累计渗透量分别达到17.8 μg/cm2、14.5 μg/cm2，累计渗透率分别达到4.0%、3.6%，说明脂质体的加入显著改善了exos的皮肤渗透效果，有利于后续外泌体的活性成分发挥作用，对进一步实现外泌体的功效具有重大意义。
49.综上所述，本发明公开了一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法。所制得的复合物尺寸均一，分散均匀，具备良好的稳定性，同时保留了外泌体的特征蛋白。与细胞共培养时，该复合物不会影响细胞的增殖能力，具备良好的细胞相容性。在体外皮肤渗透实验中，该复合物可显著提高外泌体的累计渗透量。本发明的制备方法简单，制备过程无毒无害，成本低廉，制得的复合物便于储存，可显著改善外泌体的皮肤渗透效率，兼具干细胞外泌体的功效和脂质体在经皮递送中的优势，对于进一步推进外泌体制剂在皮肤渗透、皮肤修复、组织再生等皮肤性疾病及皮肤医学美学中的发展具有重大意义。

技术特征：
1.一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）外泌体的制备：通过超速离心法获得干细胞外泌体；（2）脂质体的制备：包括如下步骤：（a）取脂质成分溶解于有机溶剂中，水浴超声分散溶液；（b）使用旋转蒸发仪蒸发去除步骤（1）所得溶液中的有机溶剂，得到干燥的脂质膜；（c）在步骤（2）所得的脂质膜中加入pbs缓冲液以水化形成的脂质膜，然后在37 ℃恒温下振荡脂质溶液；（d）将步骤（3）所得的脂质溶液转移至离心管中，探头超声脂质溶液，即得脂质体；（3）将干细胞外泌体和脂质体按照蛋白质量:脂质质量=1:5混合，之后将混合液在37 ℃恒温摇床振荡孵育，制得干细胞外泌体脂质体复合物。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇和氯仿中的任意一种或两种混合。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述脂质成分为磷脂、胆固醇或功能性磷脂。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂可来源于二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂和氢化大豆卵磷脂中的一种或两种；所述胆固醇来源于胆固醇及其衍生物和胆甾醇中的一种；所述功能性磷脂为dspe-mpeg、dspe-peg
2000
、dspe-peg
2000-cooh、dspe-peg
2000-mal、dspe-peg
2000-nhs、dspe-peg
2000-nh2、dspe-peg
2000-oh、dspe-peg
2000-sh、dspe-peg
2000-fa、dspe-peg
2000-biotin、dspe-peg
2000-galactose、dspe-peg
2000-mannose、dspe-peg
2000-fitc、dspe-peg
2000-rb 、中的一种或两种。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于， 所述磷脂、胆固醇和功能性磷脂溶解于有机溶剂的质量体积分数分别为0.1~0.6%、0.01~0.04%、0.01~0.04%。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（d）所述超声的条件为：功率160 w，45 khz，超声3 s，停止3 s；所述探头超声时间为3~10 min。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞来源于人体的脂肪、骨髓、胎盘、脐带中的任意一种。8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脂质成分为蛋黄卵磷脂，溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.20%；所述探头超声时间为5 min。9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述胆固醇溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.02%。10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述dspe-peg
2000
溶解于有机溶剂的质量体积分数为0.04%。

技术总结
本发明公开了一种促进皮肤渗透的干细胞外泌体脂质体复合物的制备方法，通过孵育法将其与外泌体进行膜融合，制得所述复合物。所制得的复合物尺寸均一，分散均匀，具备良好的稳定性，同时保留了外泌体的特征蛋白。与细胞共培养时，该复合物不会影响细胞的增殖能力，具备良好的细胞相容性。在体外皮肤渗透中，该复合物可显著提高外泌体的累计渗透量。本发明的制备方法简单，制备过程无毒无害，成本低廉，制得的复合物便于储存，可显著改善外泌体的皮肤渗透效率，兼具干细胞外泌体的功效和脂质体在经皮递送中的优势，对于进一步推进外泌体制剂在皮肤渗透、皮肤修复、组织再生等皮肤性疾病及皮肤医学美学中的发展具有重大意义。及皮肤医学美学中的发展具有重大意义。及皮肤医学美学中的发展具有重大意义。


技术研发人员：刘杰 程利利 傅子文
受保护的技术使用者：广州艾万生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/9/20