一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法

1.本发明属于中药活性物质提取技术领域，具体涉及一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法。


背景技术：

2.桑黄为珍贵的药用真菌，主要寄生于桑树、杨树等树干上。现代研究表明，不同来源的桑黄所含的有效成分的含量具有较大差异，其中桑树桑黄所含有的有效成分最为丰富。桑黄中所含的活性成分具有优良的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等功效，而多糖是活性物质中含量最为丰富的。
3.桑黄多糖大多存在于细胞质和细胞壁中，在提取桑黄多糖之前必须对细胞壁进行破碎，增加桑黄多糖的溶出率。目前，提取桑黄多糖的方法有很多，主要有：热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法、微波辅助提取法、超声波提取法、减压提取法、双水相提取法等，以上提取方法不仅仅能单一利用，还可以组合进行提取，以增加提取率。例如中国专利cn114774493a将热水浸提法和超声波提取法组合提取桑黄多糖，在较大程度上提高了桑黄多糖的提取率，但热水浸提法的温度一般在80-110℃之间，而且提取时间较长，会严重影响桑黄多糖的活性。该研究也涉及到了桑黄多糖的提纯，在除色素方面利用过氧化氢法，该方法通过过氧化氢的强氧化作用除色素，但在氧化色素的同时也容易使多糖被分解。又如在中国专利cn103059155a中，利用高能纳米冲击磨将桑黄粉末进一步粉碎，得到平均粒度为100-500纳米的桑黄纳米粉末，再利用热水浸提法提取桑黄多糖，该方法仅在一定程度上提高了桑黄多糖的提取率，并没有涉及桑黄多糖的纯度和活性相关的问题。在宋红志等人的研究中(桑黄菌丝体的液体发酵培养及多糖提取和抗氧化活性测定[j].蚕业科学,2016,42(04):700-710)，利用超声波辅助复合酶解法来提取桑黄多糖，该提取方法利用复合酶来酶解破坏桑黄细胞壁，再用超声波强大的剪切力使桑黄细胞壁破裂，能够更加高效的使桑黄多糖溶出。但在该方法中，酶的价格较高，使用条件苛刻，而且超声波强大的剪切力还会破坏桑黄多糖的结构，使其失去活性。如今，大多数的研究都集中于如何提高桑黄多糖的提取率，却忽视了提取方法对桑黄多糖的活性的影响。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法，以克服现有技术中存在的桑黄多糖得率低、纯度低、活性低的缺陷。
[0005]
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)将桑黄子实体切成1
×
1-3
×
3cm2的块状，利用普通粉碎机粉碎，过20目筛网，得到桑黄粗粉。将其进行干燥，之后加入到流化床对撞式气流超微粉碎机中进一步粉碎，得到2.3-9.8μm的桑黄超微粉末。
[0008]
(2)把步骤(1)得到的桑黄超微粉末加入到含水量为20-40％的低共熔溶剂中，充
分混合均匀，超声辅助萃取，然后进行离心，静置，取上清液，得到桑黄粗多糖提取液。
[0009]
(3)向步骤(2)中所得的桑黄粗多糖提取液中加入无机盐，充分混匀，待无机盐完全溶解后，静置，离心，最后形成双水相萃取体系。
[0010]
(4)取步骤(3)所制备的双水相萃取后的上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到低共熔溶剂，并将其回收；取下相，得到初步纯化的桑黄多糖提取液，之后进行除色素、脂类处理，利用大孔树脂脱色的方法，除去色素，向脱色素后的多糖样品中加入石油醚，离心，吸取并除去石油醚，重复2-3次，除去脂类物质，得到除色素、脂类的多糖溶液。
[0011]
(5)取步骤(4)中的除色素、脂类的多糖溶液，用8000-10000d的透析袋透析，得到纯化后的桑黄多糖溶液，经冷冻干燥，最终得到纯化后的桑黄多糖。
[0012]
所述的低共熔溶剂优选由氯化胆碱和丙三醇按照摩尔比为1：(2-3)的比例混合，在温度为90-100℃的条件下，加热搅拌至清澈透明的溶液，冷却至室温得到低共熔溶剂；低共熔溶剂含水量优选为30％；无机盐优选为磷酸氢二钾；透析袋优选为9000d的透析袋。
[0013]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0014]
本发明在对桑黄细胞壁进行破壁处理中选择了流化床对撞式气流超微粉碎技术，该技术相较于普通破碎技术而言，具有破壁彻底、可提高多糖提取率等优势。在浸提桑黄粗多糖的过程，本发明选用的是超声辅助低共熔溶剂双水相体系浸提，本发明将超声提取法作为辅助提取方案，相较于单一超声提取法来说，其超声功率、超声时间都会在不同程度上减小。减少了高功率、长时间作用对桑黄多糖结构产生的破坏，从而保存更多桑黄多糖的活性。其次，该萃取体系具有绿色环保，成本低廉，成相快速，萃取温度低，萃取效率高等优势。此外，在萃取过程中，该溶剂可使多糖与蛋白质分离，避免了在后续纯化中的除蛋白这一步骤，减少了试剂的使用。在除色素步骤中，选用大孔树脂吸附的方法，排除了过氧化氢的强氧化性对桑黄多糖活性的影响，最大程度的保证了桑黄多糖的活性。
具体实施方式
[0015]
下面结合具体实施例来对本发明的技术方案作进一步的阐述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0016]
实施例1
[0017]
一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法，包括以下步骤：
[0018]
步骤(1)：取流化床对撞式气流超微粉碎机粉碎后的桑黄超微粉末2g，加入含水量为30％氯化胆碱-丙三醇低共熔溶剂50ml，充分混合均匀，在50℃下超声提取10min，4000rad/min离心10min，取上清液，得到桑黄粗多糖提取液。
[0019]
步骤(2)：向步骤(1)所得的桑黄粗多糖提取液中加入磷酸氢二钾15g，待磷酸氢二钾完全溶解后，静置90min，将溶液以3000rad/min离心20min，形成双水相体系，其中上相为氯化胆碱-丙三醇低共熔溶剂相，下相为含多糖的磷酸氢二钾相。
[0020]
步骤(3)：取步骤(2)萃取后的上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到低共熔溶剂，并将其回收；取下相，得到初步纯化的桑黄多糖提取液，利用大孔树脂吸附的方法除去色素，向脱色素后的多糖样品中加入10ml石油醚，2000rad/min离心10min，吸取并除去石油醚，重复两次，除去脂类物质，最后透析，所用透析袋分子截留量为9000d，然后冷冻干燥，得到纯化后的桑黄多糖。
[0021]
计算桑黄多糖得率及纯度数值，计算方法及结果如下：
[0022]
提取率(g/g)＝桑黄粗多糖/桑黄超微粉量
×
100％；采用苯酚-硫酸法测定桑黄多糖含量，进而得出桑黄粗多糖纯化后的多糖含量。
[0023]
本实施例中桑黄多糖得率为6.14-6.91％，桑黄多糖纯度72.6-77.3％。
[0024]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将桑黄子实体切成1
×
1-3
×
3cm2的块状，利用普通粉碎机粉碎，过20目筛网，得到桑黄粗粉；将桑黄粗粉进行干燥，并加入到流化床对撞式气流超微粉碎机中进一步粉碎，得到2.3-9.8μm的桑黄超微粉末；(2)把步骤(1)得到的桑黄超微粉末加入到含水量为20-40％的低共熔溶剂中，充分混合均匀，超声辅助萃取，然后进行离心，静置，取上清液，得到桑黄粗多糖提取液；(3)向步骤(2)中所得的桑黄粗多糖提取液中加入无机盐，充分混匀，待无机盐完全溶解后，静置，离心，最后形成双水相萃取体系；(4)步骤(3)所制备的双水相萃取体系的上相为低共熔溶剂，下相为初步纯化的桑黄多糖提取液；取上相，冷冻干燥至恒重并将其回收；取下相，作进一步除色素、脂类处理；利用大孔树脂脱色的方法，除去色素，向脱色素后的桑黄多糖样品中加入石油醚，离心，吸取并除去石油醚，重复2-3次，除去脂类物质，得到除色素、脂类的桑黄多糖溶液；(5)取步骤(4)中的除色素、脂类的多糖溶液，用8000-10000d的透析袋透析，得到纯化后的桑黄多糖溶液，经冷冻干燥，最终得到纯化后的桑黄多糖；所述的低共熔溶剂优选由氯化胆碱和丙三醇按照摩尔比为1：(2-3)的比例混合，在温度为90-100℃的条件下，加热搅拌成清澈透明的溶液，冷却至室温得到低共熔溶剂；低共熔溶剂含水量优选为30％；无机盐优选为磷酸氢二钾；透析袋优选9000d的透析袋。

技术总结
本发明公开了一种提取及提纯活性桑黄多糖的方法。其特征是首先将桑黄子实体切成的块状，利用普通粉碎机粉碎，过20目筛网，将过筛后的粉末进行干燥处理，之后加入到流化床对撞式气流超微粉碎机中进一步粉碎，得到平均粒度为2.3-9.8μm的桑黄超微粉末，然后利用超声波辅助低共熔溶剂双水相体系浸提，得到初步纯化的桑黄多糖，对其进行除色素、脱脂类处理，最后，进行透析处理、纯化，得到高活性、高纯度的桑黄多糖。与现有技术相比，本发明利用的流化床对撞式气流超微粉碎技术能够将细胞破壁彻底，最大程度上将桑黄多糖提取出来。超声波辅助低共熔溶剂双水相体系浸提，较以往的浸提方法对桑黄多糖的活性损坏最小。最后通过除杂和纯化处理，得到高纯度、高活性的桑黄多糖。高活性的桑黄多糖。


技术研发人员：刘勇 赵家乐 刘轩 唐萍
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/9/20