SHP2抑制剂联合肿瘤治疗药物在肿瘤耐药中的应用

shp2抑制剂联合肿瘤治疗药物在肿瘤耐药中的应用
一、技术领域
1.本发明是涉及shp2抑制剂联合肿瘤治疗药物在肿瘤耐药中的应用，属于医药用途的技术领域。
二、

背景技术：

2.肿瘤的治疗从化疗到靶向治疗是肿瘤治疗发展的一个重要飞跃，也是精准医学的一个重要体现。靶向治疗在精准地“杀灭肿瘤”的同时，在治疗后肿瘤细胞往往会耐药性，导致治疗不敏感且治疗后易复发。就常见的生长因子受体egfr而言，2003年第一款egfr抑制剂吉非替尼诞生，自egfr抑制剂诞生至今，共20年经历过三个迭代，虽然目前第三代抑制剂奥西替尼取得了良好的临床效果，但依然有新的耐药产生，且机制更为复杂，进一步导致肿瘤无限制地增殖，最终无法控制。因此亟需开发新的联合治疗方案以改善治疗效果。
3.因此，针对目前肿瘤治疗耐药性普遍的问题，深入阐明肿瘤耐药的分子机制，发现新的治疗靶点，开发新的药物联合治疗方案，有效改善耐药患者的预后，是目前亟需解决的问题。
4.shp2是非受体型酪氨酸磷酸酶，可以催化底物去磷酸化，从而调控下游信号，shp2是ptp家族中唯一被证实的原癌蛋白，在肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药等方面发挥重要调控作用。shp2是ras/mapk信号通路活化的必需调控因子，以往的研究表明shp2是一个理想的癌症治疗靶标，shp2抑制剂有望成为肿瘤治疗的又一重磅药物。因此shp2抑制剂有望解决目前临床治疗出现的普遍耐药现象。
三、

技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的是在于提供一种shp2抑制剂联合肿瘤治疗药物来解决肿瘤治疗普遍耐药的问题。
6.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了shp2变构抑制剂jc-010a联合肿瘤治疗药物在肿瘤耐药中的应用。
7.根据本发明提供的所述shp2抑制剂为jc-010a。
8.本发明提供了一种新的ret融合型肿瘤耐药的联合药物治疗策略，所述联合药物为jc-010a与ret抑制剂普拉替尼。
9.本发明提供了一种新的解决慢性粒细胞白血病耐药的治疗策略，所述策略为破坏hsp90、bcr-abl、shp2的两两相互作用以及引起hsp90剪切而降解bcr-abl，克服abl t315i突变导致的伊马替尼耐药；此外jc-010a对细胞自噬的抑制作用也是其抑制耐药的一个方面。
10.本发明提供了kras突变型肿瘤耐药的联合药物治疗策略，所述联合药物为jc-010a与mek抑制剂司美替尼。
11.本发明提供了egfr突变型肿瘤耐药的药物治疗策略，所述策略为jc-010a单药治疗egfr t790m/c797s突变型耐药。
12.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
13.本发明提供了一种shp2抑制剂联合肿瘤治疗药物来解决肿瘤治疗普遍耐药的问题。
14.所述联合肿瘤治疗的药物包括kras抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，免疫检查点抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂中的至少一种。所述shp2抑制剂为吡嗪并噻唑类化合物及其衍生物或其药理上容许的盐中的至少一种。
15.优选地，所述shp2抑制剂为jc-010a。
16.优选地，所述联合肿瘤治疗为药物：普拉替尼、司美替尼和伊马替尼。
17.本发明还提供了所述的药物联合在肿瘤耐药中的应用。
18.优选地，所述肿瘤为耐药型肿瘤疾病。
19.优选地，所述耐药型肿瘤疾病为：含有egfr t790m/c797s突变的非小细胞肺癌、met高表达的非小细胞肺癌、含t315i突变的慢性粒细胞白血病细胞、met高表达的ret重排细胞和rtk激活的胰腺癌细胞。
20.进一步的，所述药物为口服药或注射药。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明的药物联合包括shp2变构抑制剂以及现有的临床治疗药物，能有效克服临床治疗药物导致的耐药问题。本发明的shp2变构抑制剂单独治疗效果佳，与临床治疗药物联用后能够增加治疗药物的敏感性，有效治疗肿瘤耐药，进而具有广阔的临床应用前景和意义。
四、附图说明
23.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性试验例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
24.图1表明本发明中jc-010a的化学结构及jc-010a是一个shp2变构抑制剂。
25.图2表明本发明中jc-010a能够抑制ret重排细胞中met高表达导致的耐药，与ret抑制剂普拉替尼联用后能够协同抑制肿瘤增殖。
26.图3表明jc-010a在慢性粒细胞白血病中因破坏hsp90、bcr-abl、shp2的两两相互作用以及引起hsp90剪切而降解bcr-abl进而克服abl t315i突变导致的伊马替尼耐药，此外jc-010a抑制细胞自噬介导的细胞耐药，与伊马替尼联用呈现良好协同作用。
27.图4表明jc-010a在kras突变细胞中能够逆转对mek抑制剂司美替尼引起的适应性耐药，jc-010a的抗肿瘤效果及与靶向药联用效果优于shp099，且jc-010a的抗肿瘤效果是由于对shp2的抑制作用。
28.图5表明jc-010a减轻非小细胞肺癌细胞中egfr t790m/c797s突变导致的对egfr抑制剂的耐药。
29.图6表明jc-010a体内具有显著的抗肿瘤作用，且能够增强普拉替尼的治疗疗效，克服因met高表达导致的耐药，体内呈现良好的安全性和有效性。
五、具体实施方式
30.下面结合附图和试验例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
31.试验例1
32.探究了jc-010a对shp2-ptp、shp1、ptp1b的酶活抑制作用，并对jc-010结合shp2的模式进行了验证。
33.药品和试剂：pbs、咪唑、dtt、na3vo4、tris、pnpp、酵母粉、蛋白胨、氯化钠。
34.细菌：bl21(de3)。
35.仪器：37℃恒温摇床(zhicheng公司，中国)；酶标仪(bio-tek公司，美国)；超净工作台(haier公司，中国)。
36.实验方法蛋白表达纯化：将shp2的237-529的序列，shp1和ptp全长克隆至pet-28a载体，将重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)进行高效表达。将重组的bl21在lb培养基中进行扩大培养，加入iptg诱导表达。收集并离心，并用裂解缓冲液进行超声破碎，最终将上清液进行分离纯化。
37.试验结果图1表明，jc-010a(图1a)对shp2-ptp结果没有明显抑制作用(图1b)，说明jc-010a是一个shp2的选择性变构抑制剂。
38.试验例2
39.探究了jc-010a对ret重排细胞中met高表达耐药的逆转作用，与ret抑制剂blu-667联用后是否能够协同抑制肿瘤增殖。
40.细胞：baf3/ki5b-ret、baf3/ccdc6-ret(中科院上海药物所耿美玉研究员馈赠)、baf3/ki5b-ret/c-met细胞(实验室构建).
41.试剂：jc-010a；mtt；1640干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；结晶紫；pei。
42.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(haier公司，中国)；高速冷冻离心机(healforce，中国)，蛋白电泳液；转膜液；mtt(上海索莱宝生物科技有限公司)；1
×
loading buffer；4
×
上层浓缩胶缓冲液；4
×
下层分离胶缓冲液。
43.实验方法c-met高表达细胞构建：将pcdh-cmv-mcs-ef1-hygro表达载体线性后将c-met的cdna利用同源重组的方法克隆至线性载体上，转化后将单克隆进行测序验证。慢病毒感染构建met高表达的baf3/kif5b-ret细胞。
44.实验方法mtt法：取对数生长期的细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的jc-010a、blu-667或者两者联合，对照组加入等比稀释的dmso。将96孔板置于37℃，co2培养箱中培养72h。培养结束后每孔中加20μl mtt溶液，置于培养箱中孵育4h。最后加入100μl三联液，于37℃的烘箱中过夜孵育。用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(od)值并计算细胞活力，利用软件计算jc-010a与blu-667联用后的ci值。
45.实验方法软琼脂克隆法：配置下层琼脂和上层琼脂，将1640培养基和下层琼脂1:1的等比混合后取2ml加入六孔板。待下层凝固后，将细胞、jc-010a、blu-667和上层琼脂进行混合，琼脂体积为500μl，剩余细胞和药物500μl，混匀后加入6孔板中形成双层琼脂。待琼脂凝固后置于37℃，co2培养箱中培养10-14d，每3d补充一次培养基，最后用结晶紫进行染色并拍照。
46.实验方法western blotting法：将对数生长期的baf3/ki5b-ret细胞接种在六孔板中，并用blu-667处理不同时间，或者用jc-010a、blu-667单独或联合处理。收集细胞，4℃条件下1000rpm离心5min。pbs洗涤后，1
×
loading buffer在4℃裂解45min。变性10min。在
6-12％sds-page胶电泳分离蛋白样品，依次经转膜、封闭后用相应一抗进行孵育过夜，然后室温下二抗孵育1h，最后通过显影仪进行化学发光检测。
47.试验结果图2表明，jc-010a与blu-667联合抑制信号通路反弹且两者具有协同作用(图2a-d)。该细胞过表达c-met后，同样地，jc-010a与blu-667联用后能够协同抑制细胞增殖(图2e，f)。以上结果表明，jc-010a能够抑制c-met高表达而导致ret重排细胞对ret抑制剂blu-667的耐药，且jc-010a与blu-667联用后，能够增加blu-667的治疗疗效，进而发挥协同抗肿瘤效果。
48.试验例3
49.探究了jc-010a在慢性粒细胞白血病(cml)中是否能够克服abl t315i突变导致的对伊马替尼耐药。
50.细胞：baf3/p210
wt
、baf3/p210
t315i
购自南京科佰生物科技有限公司。
51.试剂：jc-010a；mtt；1640干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；结晶紫；琼脂糖珠；ip裂解液；蛋白电泳液；转膜液；mtt(上海索莱宝生物科技有限公司)；1
×
loading buffer；4
×
上层浓缩胶缓冲液；4
×
下层分离胶缓冲液。
52.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(haier公司，中国)；高速冷冻离心机(healforce，中国)。
53.实验方法mtt法：取对数生长期的细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的jc-010a或伊马替尼，对照组加入等比稀释的dmso。将96孔板置于37℃，co2培养箱中培养72h。培养结束后每孔中加20μl mtt溶液，置于培养箱中孵育4h。最后加入100μl三联液，于37℃的烘箱中过夜孵育。用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(od)值并计算细胞活力。
54.实验方法软琼脂克隆法：配置下层琼脂和上层琼脂，将1640培养基和下层琼脂1:1的等比混合后取2ml加入六孔板。待下层凝固后，将细胞、jc-010a和上层琼脂进行混合，琼脂体积为500μl，剩余细胞和药物500μl，混匀后加入6孔板中形成双层琼脂。待琼脂凝固后置于37℃，co2培养箱中培养10-14d，每3d补充一次培养基，最后用结晶紫进行染色并拍照。
55.实验方法western blotting法：将对数生长期的cml细胞接种于六孔板中，jc-010a处理不同时间。收集细胞，4℃条件下1000rpm离心5min。pbs洗涤后，1
×
loading buffer在4℃裂解45min。变性10min。在6-12％ sds-page电泳分离蛋白样品，依次经转膜、封闭后用相应一抗进行孵育过夜，然后室温下二抗孵育1h，最后通过显影仪进行化学发光检测。
56.试验结果图3表明，jc-010能够抑制cml细胞的增殖，且在伊马替尼敏感细胞与耐药细胞中呈现相同的抑制趋势(图3a)，说明jc-010a能够抑制伊马替尼耐药。实验结果还表明jc-010a能够促进bcr-abl的降解(图3b)进一步分析表明jc-010a破坏了shp2、abl、hsp90两两之间的相互作用(图3c)，而bcr-abl作为hsp90的客户蛋白，两者间相互作用的破坏势必会影响bcr-abl的稳定性。除abl t315i突变介导的细胞耐药外，细胞自噬也是tkis耐药的原因之一，结果表明jc-010a能够抑制细胞自噬现象(图3d)。此外，实验结果还表明jc-010a相较于shp099具有更好的活性(图3e)，且jc-010a与伊马替尼呈现出较好的协同作用(图3f)。以上结果表明，jc-010a能够抑制abl t315以及细胞自噬介导的对伊马替尼耐药的作用。
57.试验例4
58.探究jc-010a在kras突变细胞中是否能够逆转对mek抑制剂引起的适应性耐药。
59.细胞：人非小细胞肺癌细胞h358细胞购自atcc。
60.试剂：jc-010a；mtt；1640干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；结晶紫；蛋白电泳液；转膜液；mtt(上海索莱宝生物科技有限公司)；1
×
loading buffer；4
×
上层浓缩胶缓冲液；4
×
下层分离胶缓冲液。
61.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(haier公司，中国)；高速冷冻离心机(healforce，中国)。
62.实验方法mtt法：取对数生长期的细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的jc-010a或司美替尼(selumetinib)，对照组加入等比稀释的dmso。将96孔板置于37℃，co2培养箱中培养72h。培养结束后每孔中加20μl mtt溶液，置于培养箱中孵育4h。最后加入100μl dmso，用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(od)值并计算细胞活力并计算协同指数ci。
63.实验方法平板克隆法：取对数生长期的细胞种入6孔板中，并置于培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，用不同浓度的selumetinib、jc-010a、shp099，或jc-010a与shp099与selumetinib联合，并孵育10-14天。药物作用结束后，弃去上层培养基，加入pbs清洗细胞。随后加入甲醇固定10min，弃去甲醇后加入结晶紫染液染色15min。最后，对染色结果进行拍照并对克隆进行计数。
64.实验方法western blotting法：将对数生长期的细胞接种于六孔板中，jc-010a、selumetinib单独或联合处理不同时间。收集细胞，4℃条件下1000rpm离心5min。pbs洗涤后，1
×
loading buffer在4℃裂解45min。变性10min。在6-12％ sds-page电泳分离蛋白样品，依次经转膜、封闭后用相应一抗进行孵育过夜，然后室温下二抗孵育1h，最后通过显影仪进行化学发光检测。
65.实验方法基因敲低法：plko.1-shshp2质粒进行慢病毒包装，病毒上清感染h358细胞，构建稳转株。
66.试验结果图4表明，jc-010a处理后能够抑制h358细胞中selumetinib引起的信号通路反弹现象(图4a)，将两药联用后呈现出良好的协同作用(图4b)。此外，将shp2敲低后，shp2对ras/mapk信号通路的抑制作用减弱(图4c)，且jc-010a不能抑制h358细胞中平板克隆的形成(图4d)。以上表明，jc-010a能够逆转kras突变细胞中对mek抑制剂引起的适应性耐药，且是通过抑制shp2实现的。
67.试验例5
68.探究jc-010a是否能够减轻非小细胞肺癌细胞中因egfr t790m/c797s突变或met高表达导致的对egfr抑制剂的耐药。
69.细胞：人非小细胞肺癌细胞pc-9细胞购自atcc，pc-9/gr细胞购自上海雅吉生物。
70.试剂：jc-010a；mtt；1640干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；蛋白电泳液；转膜液；mtt(上海索莱宝生物科技有限公司)；1
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loading buffer；4
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上层浓缩胶缓冲液；4
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下层分离胶缓冲液。
71.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(haier公司，中国)；高速冷冻离心机(healforce，中国)。
72.实验方法mtt法：取对数生长期的细胞接种到96孔板中，实验组加入不同浓度的
jc-010a，对照组加入等比稀释的dmso。将96孔板置于37℃，co2培养箱中培养72h。培养结束后每孔中加20μl mtt溶液，置于培养箱中孵育4h。最后加入100μl dmso，用酶标仪在570nm的波长下测定其吸光度(od)值并计算细胞活力。
73.实验方法重叠延伸pcr定点突变egfr法：将egfr
wt
cdna克隆至pet-28a质粒，设计t790m和c797s突变引物，经过3轮pcr得到egfr双突变的pcr产物，将pcr产物进行纯化后，克隆至pcdh-cmv-mcs-ef1-hygro质粒。经测序验证后，慢病毒包装并感染pc-9细胞，筛选后得到稳转细胞。
74.试验结果图5表明，jc-010a对egfr突变细胞株和非突变细胞株表现出相同的敏感性(图5a)，说明jc-010a能够抑制由于egfr突变产生的对egfr tki的耐药。egfr tki耐药的另一个机制是旁路激活，pc-9/gr细胞是由于met高表达而介导了对吉非替尼的耐药，结果表明，jc-010a能够以相同的趋势抑制pc-9以及pc-9/gr说明jc-010a能够克服由于met高表达而导致的细胞耐药(图5b)。以上结果表明，jc-010a能够抑制由于egfr突变以及met高表达引起的对egfr抑制剂的耐药。
75.试验例6
76.探究jc-010a体内是否具有抗肿瘤作用及与blu-667联用后的治疗疗效。
77.细胞：baf3/kif5b-ret/met。
78.动物：balb/c-nu(4-6周龄)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
79.试剂：jc-010a；1640干粉培养基(gibco公司，美国)；pbs；蛋白电泳液；转膜液；1
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loading buffer；4
×
上层浓缩胶缓冲液；4
×
下层分离胶缓冲液。
80.仪器：co2培养箱(heraeus公司，德国)；倒置显微镜(奥林巴斯公司，日本)；超净工作台(haier公司，中国)；高速冷冻离心机(healforce，中国)。
81.实验方法裸鼠异种移植瘤建立法：将对数生长期的细胞收集，以5
×
106/只的数目接种于小鼠右侧腋下，碘伏消毒后放回笼中常规饲养，随时观察裸鼠健康状况，观察肿瘤生长情况，每隔一天测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积(1/2
×
长径
×
短径2)。将小鼠分为溶剂对照组、jc-010a、blu-667(、jc-010a+blu-667、shp099给药组，连续给药12d，实验结束后处死小鼠，取下肿瘤，称重并测量其大小。
82.试验结果图6表明，met基因高表达后，相较于文献报道的敏感细胞株baf3/kif5b-ret，blu-667的敏感性大大下降，说明在体内同样的met高表达导致了对blu-667的耐药(图6a，b)。jc-010a单药治疗能够显著地抑制肿瘤生长，与blu-667联用后肿瘤抑制效果加强(图6a，b)。以上结果表明jc-010a体内具有显著地抗肿瘤作用，且jc-010a能够显著增强blu-667的治疗疗效，两者在体内能够协同抑制肿瘤生长，进而抑制由于met高表达导致的肿瘤耐药。
83.本文中应用多个试验例对本发明的公开实施方案进行了详细的阐述，但是不能理解或作为对于本发明内容的限制。同时需要指出，虽然本文中已经对于优选的具体个例进行了详细的阐述，但仍需强调的是，本发明不应局限于这些具体的试验例。事实上，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其它改进来获取本发明的措施，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.shp2抑制剂联合肿瘤治疗药物在肿瘤耐药中的应用，其特征在于，包括吡嗪并噻唑类化合物和用于治疗或辅助治疗的肿瘤药物。2.根据权利要求1所述抑制剂，其特征在于，所述吡嗪并噻唑类化合物含有下述结构通式所示的化合物及其衍生物或其药理上容许的盐中的至少一种，为shp2变构抑制剂。r1和r2中的一个为h，另一个为-n(r
1-1
)(r
1-2
)：r
1-1
和r
1-2
独立地为h、甲基或nh2ch
2-；r
2-1
和r
2-2
独立地为h、甲基、nh
2-或nh2ch
2-。3.根据权利要求2所述shp2变构抑制剂，优选地，所述shp2变构抑制剂为jc-010a。4.根据权利要求3所述，所述jc-010a，其特征在于，jc-010a单药治疗具有抗肿瘤作用。
5.根据权利要求1所述联合肿瘤治疗药物，其特征在于，所述联合肿瘤治疗的药物包括但不限于kras抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，免疫检查点抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；优选地，所述联合治疗肿瘤的药物为普拉替尼、司美替尼和伊马替尼。6.如权利要求1所述药物联合，其特征在于，所述药物联合物包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型和直肠给药剂型；优选地，所述药物组合物可以是口服的片剂、粉剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液或悬浮液。7.一种肿瘤治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括采用权利要求1-3任一项所述化合物或权利要求5任一项所述药物联合进行治疗。8.如权利要求7所述肿瘤治疗方法，其特征在于，所述肿瘤为耐药型肿瘤疾病，优选地，包括但不限于耐药型非小细胞肺癌、耐药型慢性粒细胞白血病。9.如权利要求8所述肿瘤，其中所述肿瘤选自以下：含有egfr t790m/c797s突变的非小细胞肺癌、met高表达的非小细胞肺癌、含t315i突变的慢性粒细胞白血病细胞、met高表达的ret重排细胞。

技术总结
SHP2抑制联合肿瘤治疗药物对于一线治疗产生的肿瘤耐药具有独特的优势，能够克服多种肿瘤耐药且增加肿瘤治疗药物的敏感性，从而达到抑制肿瘤增殖，促进癌细胞凋亡。本发明提供的吡嗪并噻唑类化合物可单独或联合用药，其作为SHP2变构抑制剂，可用于多种肿瘤耐药的治疗。此外，本发明提供了一种新的用于治疗或辅助治疗肿瘤耐药的联合药物治疗方案，可达到有效治疗或辅助治疗肿瘤耐药的目的，为肿瘤耐药患者开辟了一种新的治疗途径。患者开辟了一种新的治疗途径。患者开辟了一种新的治疗途径。


技术研发人员：刘明 卢绪秀 李振
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.07.03
技术公布日：2023/9/20