利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法与流程

1.本发明属于微生物制品技术领域，具体涉及一种利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法。


背景技术：

2.酿酒过程不可避免会产生大量的废水。酒精蒸馏釜底液是典型的高浓度、高温度、高悬浮物的有机废水。废液中的废渣含有粉碎后的发酵原料植物皮、根茎等粗纤维，构成废水不溶性化学需氧量(chemical oxygen demand，简称cod)；发酵原料中的纤维素和半纤维素等多糖类物质，在酒精发酵中不能被酵母菌利用，残留在废液中，表现为溶解性cod，这些物质增加了废水处理的难度。如果未得到有效处理，将会造成巨大的环境问题，如污染地下水和地表水、破坏植被和产生异味等。事实上，由于白酒工业的快速发展，酿酒废液已经成为轻工业对水生环境的第二大污染源。
3.白酒酿造底锅水中污染物主要来源是漏入锅底的酒醅、糟醅、料醅、蒸馏回流的高沸点酸类、酯类、糖类、醇类和复蒸的酒尾；其成分包括多元醇(戊五醇、己六醇)、氨基酸酯类化合物(缬氨酸乙酯、亮氨酸乙酯、苯丙氨酸乙酯)、以及具有生物活性的γ-氨基丁酸、环(脯氨酸-亮氨酸)、环(脯氨酸-苯丙氨酸)、四甲基吡嗪、阿魏酸等。因此利用营养丰富且具备生物活性的白酒酿造底锅水生产高附加值生物活性物质具有应用潜力。
4.在底锅水的处理方法中，国内主要处理方法为厌氧-好氧生化组合工艺，针对消化条件、共消化、动力学建模、反应器优化等进行了一系列研究。近年来一些物化方法被开发用于与厌氧消化联合或独立使用，如增压空气氧化、电絮凝、光催化降解等。这些物化方法的共同缺点是高能耗与高成本，且未实现“变废为宝”。主流厌氧技术也存在产气量小，回收利用困难，且需脱硫后方可使用的不理想。
5.小球藻(chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径4～9μm，是一种高效的光合植物，不仅可以以光合自养生长繁殖，还可以利用有机碳源实现异养培养，分布极广。小球藻中含有丰富的营养物质，如不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、食物纤维、核酸、叶绿素及铁、锌、钙矿物质等。此外，小球藻内含有一种珍贵的生长因子(chlorella growth factor，简称cgf)，其可促进动植物机体，特别是儿童及老年人体质的增强，可缓解疼痛炎症，提高免疫功能。
6.小球藻生长因子目前是由人工无机培养基(如se、bg11、basal培养基)培养小球藻后，经破壁、分离提取干燥制得的具有很高药用和营养价值的生物活性因子，是至今为止只在小球藻中发现的活性物质，具有促进小球藻繁殖的作用，加快小球藻生长，其可以使得小球藻的数量在20h内增长4倍，是小球藻独有的生长因子。小球藻生长因子中含有丰富的核蛋白、核糖核酸、脱氧核糖核酸、多种维生素、氨基酸、多糖、蛋白质、酵素、糖蛋白、多种植物荷尔蒙，因此获得科学界的广泛关注与研究。此外，其还在抗菌、抗氧化、促进细胞增殖、促进植物生长、加快皮肤愈合和人体保健方面有重要作用，具有重要的科研意义和市场价值。
7.cn201910195807公开了一种利用啤酒废水培养小球藻的方法，其将啤酒废水进行
厌氧发酵，得到发酵液；再向发酵液中添加mgso
4 0.075～0.15g/l和edta-na
2 0.01～0.05g/l，以此溶液作为培养基培养小球藻。但该方法需要进行厌氧培养，限制了其应用范围，且培养时间长，效率偏低；同时其需要额外添加营养剂，调整营养比例，对啤酒废水利用率偏低；还需要光照培养，能耗偏高；此外，该方法只能得到小球藻生物质，且生物量偏低，其应用范围有限。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种利用白酒酿造底锅水培养小球藻，在处理废水的同时生产小球藻生长因子的方法，该方法以底锅水cod可生化部分为有机碳源，以异养的方式使小球藻生长繁殖；再通过热提取法破碎细胞，经离心、冷冻干燥后制成小球藻cgf干粉，并且发现其具备更优异的生物活性。
9.本发明提供了一种利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其包括以下步骤：
10.a、将小球藻接种于白酒酿造底锅水溶液中，置于摇床条件下培养3～7天，得小球藻培养液；
11.b、将小球藻培养液进行离心分离，收集含有小球藻细胞和底锅水悬浮固体的沉淀；
12.c、将沉淀悬浮于水中，加热，破碎细胞得小球藻混合液；
13.d、将小球藻混合液进行离心分离，取含有小球藻生长因子的上清液；
14.e、将上清液用滤膜过滤，经冷冻和冻干，得小球藻生长因子干粉。
15.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述小球藻先采用se培养基进行活化，其操作为：将小球藻种子液接种于se培养基中，在光照摇床中培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得一级种子液；将一级种子液以5～20％的接种量接种于se培养基中，在光照摇床中扩大培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得二级种子液；二级种子液以3000～5000rpm转速无菌离心3～5min，弃上清，沉淀经洗涤，即得活化后的小球藻。
16.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液为白酒酿造底锅水质量浓度为25～100％的水溶液。
17.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液为白酒酿造底锅水质量浓度为100％的水溶液。
18.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液的ph为6～7。
19.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液经115～121℃灭菌15～30分钟。
20.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液经121℃灭菌30分钟。
21.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述小球藻的接种量为0.1～0.2g小球藻/l白酒酿造底锅水溶液。
22.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤a中，所述培养的条件为：培养温度25～35℃，摇床转速120～180rpm。
23.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤b中，所述离心分离的转速为5000～8000rpm。
24.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤b中，所述离心分离的转速为5000～6000rpm。
25.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤b中，所述离心分离的时间为5～10min。
26.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤b中，所述离心分离的时间为6～8min。
27.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤c中，所述水的加入量为80～120ml水/1g步骤b所得沉淀。
28.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤c中，所述加热的温度为100～150℃。
29.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤c中，所述加热的温度为110～120℃。
30.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤c中，所述加热的时间为30～60min。
31.优选的，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤c中，所述加热的时间为30～40min。
32.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤d中，所述离心分离的转速为10000～12000rpm；所述离心分离的时间30～40min。
33.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤e中，所述滤膜的孔径为0.22～0.45μm。
34.其中，上述利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，步骤e中，所述冷冻的温度为-40～-18℃。
35.本发明的有益效果：
36.本发明以白酒酿造底锅水作为廉价培养基培养小球藻，以处理废水后的小球藻为原料提取小球藻生长因子，首先异养小球藻，使其处理废水的同时进行生长，将废水中的碳源转化为小球藻生物质及其生理活性物质，然后采用离心的方法分离藻泥，通过热提取法破碎小球藻细胞，再利用离心使细胞内核蛋白、核酸、多糖、蛋白质等成分沉淀，得到含有cgf的上清液，冷冻后放入冻干机中进行干燥，从而得到最终cgf产物。
37.本发明针对白酒副产物的生态利用技术开发，将普通物化技术难处理的废水用小球藻生化处理且生产小球藻生长因子，并充分利用白酒酿造所产生的生物活性物质增效cgf活性。在该处理方法中，有效实现了废水的有效处理与二次高值化利用，处理与生产过程清洁节能，操作便捷，对环境无污染；并且生产生物附加值很高的小球藻生产因子，经试验，其对小鼠成纤维细胞l929细胞增殖具有更为显著的影响(低浓度促进，高浓度会抑制)，在环保和生物技术领域都具有重大意义。
附图说明
38.图1为化学需氧量的标准曲线图。
39.图2为小球藻在不同稀释度白酒酿造底锅水中培养的废水cod浓度变化趋势和废水cod去除率图；其中，a为废水cod浓度变化趋势图，b为废水cod去除率图，ww代表白酒酿造底锅水质量浓度。
40.图3为小球藻在不同浓度废水中的细胞沉淀干重变化图。
41.图4为本发明cgf和control普通cgf对小鼠成纤维细胞l929细胞增值的影响图。
具体实施方式
42.具体的，一种利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，包括以下步骤：
43.a、将小球藻接种于白酒酿造底锅水溶液中，置于摇床条件下培养3～7天，得小球藻培养液；
44.b、将小球藻培养液进行离心分离，收集含有小球藻细胞和底锅水悬浮固体的沉淀；
45.c、将沉淀悬浮于水中，加热，破碎细胞得小球藻混合液；
46.d、将小球藻混合液进行离心分离，取含有小球藻生长因子的上清液；
47.e、将上清液用滤膜过滤，经冷冻和冻干，得小球藻生长因子干粉。
48.本领域内，小球藻种子液一般都需要先进行活化再使用。本发明步骤a中，所述小球藻先采用se培养基进行活化，其操作为：将小球藻种子液接种于se培养基中(制备一级种子液时，常使用平板保存单菌落或冻存液，无接种量)，在光照摇床中培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得一级种子液；将一级种子液以5～20％的接种量接种于se培养基中，在光照摇床中扩大培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得二级种子液；二级种子液以3000～5000rpm转速无菌离心3～5min，弃上清，沉淀经洗涤(一般采用无菌生理盐水洗涤)，即得活化后的小球藻。
49.经试验，本发明中，小球藻对白酒酿造底锅水的cod去除率未受废水浓度的显著影响，不同浓度底锅水中小球藻干重与处理废水前相比具有显著性增长，且随培养时间的增加而增长，因此本发明可采用白酒酿造底锅水质量浓度为25～100％的水溶液培养小球藻。此外，在未稀释的原废水浓度下，cod去除量最大，且小球藻干重提升更为显著，同时对废水利用率更高，无需额外营养成分，降低成本，因此本发明优选采用白酒酿造底锅水质量浓度为100％的水溶液培养小球藻。
50.本发明中，原废水本身偏酸性，ph约3.8，本发明将白酒酿造底锅水溶液ph调至6～7；一般采用1n naoh进行调节。
51.本发明步骤a中，所述白酒酿造底锅水溶液经115～121℃灭菌15～30分钟；优选经121℃灭菌30分钟。
52.本发明步骤a中，所述小球藻的接种量为0.1～0.2g小球藻/l白酒酿造底锅水溶液。
53.本发明步骤a中，所述培养的条件为：培养温度25～35℃，摇床转速120～180rpm。在无光照条件下进行培养，不需要额外能耗，降低生产成本。
54.本发明步骤b中，所述离心分离的转速为5000～8000rpm；优选为5000～6000rpm。
55.本发明步骤b中，所述离心分离的时间为5～10min；优选为6～8min。
56.本发明步骤b所得沉淀若未能及时进行后续细胞破碎、提取等操作，可样品在低温冷冻环境中暂存，以避免活性损失、变质等问题。
57.本发明对cgf提取工艺进行优化：步骤c中，控制水的加入量为80～120ml水/1g步骤b所得沉淀，加热的温度为100～150℃，加热的时间为30～60min，破碎细胞得小球藻混合液；优选的，步骤c中，所述加热的温度为110～120℃，所述加热的时间为30～40min。由于cgf提取过程使用≥100℃高温，出于安全因素考虑，实验室手工操作建议冷却至室温后再进行后续离心等一系列操作；若在工业放大后管道输送时，则不需要夹套降温至室温，因而不需额外耗能。
58.本发明步骤d中，所述离心分离的转速为10000～12000rpm；所述离心分离的时间30～40min。本发明步骤e中，所述滤膜的孔径为0.22～0.45μm。本发明步骤e中，所述冷冻的温度为-40～-18℃。
59.下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明保护范围限制在所述的实施例范围之中。本发明实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
60.本发明中，若无特殊说明，所需制备的原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
61.小球藻种子：采购于中国科学院淡水藻种库(freshwater algae culture collection at the institute of hydrobiology，fachb)。
62.白酒酿造底锅水：来源于宜宾五粮液股份有限公司。
63.se培养基：nano
3 0.25g/l，k2hpo4·
3h2o 0.075g/l，mgso4·
7h2o 0.075g/l，cacl2·
2h2o0.025g/l，kh2po
4 0.175g/l，nacl 0.025g/l，soil extract(土壤提取液)40ml/l，fecl3·
6h2o0.005g/l，fe-edta 1ml/l，a5 solution 1ml/l，distilled water(蒸馏水)958ml/l；
64.edta-fe的配置方法：a液：na2edta 1g，distilled water 50ml；b液：fecl3·
6h2o 81mg，hcl(0.1n)50ml，分别配置a、b液，充分搅拌溶解后，将a、b液混合搅拌均匀即可；
65.a5溶液配制方法：h3bo
3 286mg，znso4·
7h2o 22mg，mncl2·
4h2o 181mg，cuso4·
5h2o7.9mg，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 3.9mg，按上述称量药品，溶于100ml水即可。
66.高糖dmem培养基：采购于赛默飞，gibco
tm
。
67.胎牛血清：采购于赛默飞，gibco
tm
。
68.实施例1
69.实验步骤：
70.小球藻活化：
71.小球藻种子液活化采用se培养基；将藻种单菌落接种于se培养基中，在光照摇床中(温度25℃，光照强度4000lux，光照周期14：10，转速120rpm)中培养7d，得一级种子液；将一级种子液以10％(v/v)的接种量接种于se培养基扩大培养，在光照摇床(温度25℃，光照强度4000lux，光照周期14：10，转速120rpm)中培养7d，得二级种子液；将二级种子液，无菌离心(5000rpm，5min)，弃上清，无菌生理盐水(0.9％ nacl)洗涤三次，得活化小球藻。
72.小球藻培养：
73.以0.1～0.2g/l的接种水平，将活化小球藻分别接种至含底锅水培养基中；底锅水培养基包括：100wt％底锅水培养液、75wt％底锅水培养液、50wt％底锅水培养液、25wt％底锅水培养液；底锅水培养基ph 7，121℃灭菌30分钟后使用；在摇床(温度30℃，光照周期14：10，转速150rpm)中培养7d，得小球藻培养液。
74.cgf提取：
75.将小球藻培养液离心(7000rpm，7min)，收集藻泥，置于-20℃冰箱中待用；取-20℃冰箱中冷冻藻泥2g，溶于200ml蒸馏水中，在油浴中110℃加热35min，反应结束后样品冷却至室温，在11000rpm、30min的条件下离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤，于-40℃冰箱冷冻过夜，次日于冻干机中冻干，制得cgf。
76.废水cod去除率测试：
77.小球藻在不用浓度废水的培养过程中每日取样，采用hach cod预制管操作方法进行废水样cod的测定，操作如下：
78.1、标准曲线的绘制：称取0.8502g邻苯二甲酸氢钾(基准试剂)用重蒸水溶解后，转移至l000ml容量瓶中，用重蒸水稀释至标线。此贮备液cod值为1000mg/l。分别取上述贮备液5ml，10ml，20ml，40ml，60ml，80ml于l00ml容量瓶中，加水稀释至标线，可得到cod值分别为50mg/l，100mg/l，200mg/l，400mg/l，600mg/l，800mg/l及原液为1000mg/l标准使用液系列。然后按hach cod预制管样品添加要求加样并进行消解。消解完毕，冷却后，在600nm处以试剂空白为参比，读取吸光度。绘制标准曲线，并求出回归方程式，结果如图1。
79.2、将样品经适宜稀释后加入cod预制管，置于消解仪中进行消解，消解后的操作与标准曲线绘制的操作相同，进行测量，读取吸光度，按下式计算cod值。
80.cod(o2，mg/l)＝a
·f·k81.式中：a为样品的吸光度；f为稀释倍数；k为曲线的斜率，即a＝1时的cod值。
82.3、cod去除率的计算：cod去除率＝(第0天cod值-第7天cod值)/第0天cod值
×
100％。结果如图2所示。
83.结果讨论：
84.所有实验组中，废水cod浓度都培养时间的增加而稳定下降，采用100％废水、75％废水、50％废水、25％废水作为培养基的实验组cod去除量分别为5363mg/l、3932mg/l、2843mg/l、1719mg/l；可见，在不同浓度的废水中，小球藻对其cod的降解均发挥了积极作用。
85.在培养基为75％、50％、25％废水实验组中，微藻生长去除cod的效率与初始cod浓度呈负相关；在稀释率为25％的废水中(即初始cod浓度为2133mg/l)，cod去除率最高，可达到79.58％，而在废水浓度升高为50％、75％的实验组中(即初始cod浓度分别为3795mg/l、5325mg/l)，cod去除率逐步降低，分别可达74.53％、72.35％。在以100％废水为培养基(即cod浓度为7207mg/l)的高cod浓度实验组中，其cod去除率为74.41％。
86.与各实验组废水cod初始浓度相比，经小球藻处理7天后，由以100％废水～25％废水作为培养基，其cod最终浓度分别为1844mg/l、1524mg/l、956mg/l、425mg/l，去初始浓度相比，去除效果明显(p《0.05)。总体而言，小球藻对白酒酿造底锅水的cod去除率未受废水浓度的显著影响。
87.小球藻在不同浓度废水中的生长情况：
88.如图3所示，所有实验组中，底锅水中小球藻干重随培养时间的增加而增长，在100％、75％、50％、25％废水体系中，小球藻生物质沉淀由day0的3566.67mg/l、2490mg/l、1833.33mg/l、1723.33mg/l增长至day7时12293.33mg/l、8503.33mg/l、6153.33mg/l、5320mg/l，与处理废水前相比具有显著性增长(p《0.05)，成功实现了利用难处理的废水生成高附加值的微藻生物质；并且采用原废水浓度培养小球藻，小球藻干重提升更为显著，增长了8.7g/l。
89.总体而言，废水对小球藻的生长未表现出抑制作用。在未稀释的原废水浓度下，cod去除量最大，生长最优。因此，以原废水浓度培养小球藻是可行之策。
90.cgf活性检测(mtt实验)：
91.1、培养小鼠成纤维细胞l929(采用含10％牛血清的高糖dmem培养基)至最佳状态；
92.2、利用0.5％胰酶将细胞消化成浓度为105个/ml的细胞液，于96孔板中加入100μl(每孔)细胞悬液培养过夜；
93.3、细胞贴壁后(通常需要24h)去除上清，加入用高糖dmem培养基稀释的一定浓度梯度(5mg/ml，4mg/ml，3mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml)的cgf(100wt％底锅水培养液培养所得)溶液按200μl/孔加入96孔板中，每个浓度设置6个复孔，37℃，培养24h；
94.4、取出96孔板，然后向每个孔中加入20μl(5mg/ml)mtt，37℃孵育4h；
95.5、孵育完成后，离心机2500rpm离心10min，吸出上清液，每孔加入150μl的dmso溶液，震荡混匀10min；
96.6、在酶标仪上检测490nm波长处的吸收值，计算细胞存活率，细胞存活率＝实验组od
490
/对照组od
490
。
97.结果如图4所示。图4中，普通cgf为在其他条件相同的情况下，采用人工培养基(se培养基+10g/l葡萄糖)替换废水溶液，培养小球藻所制得cgf。
98.由图4可知，l292细胞的存活率随cgf浓度的增长表现为先增后降，在浓度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml时，与其相对应的细胞存活率为138.8％、132.6％、131.3％、126.1％、121.3％、109.2％、90.9％、71.5％、64.9％；在cgf浓度为0.2mg/ml时，cgf对细胞的生长起到显著的促进作用(p《0.05)，细胞存活率达到峰值138.8％；在浓度为5mg/ml时cgf对细胞的生长起显著的抑制作用(p《0.05)，细胞存活率达到最低点64.9％。
99.本实验证明，cgf具有低浓度促进细胞生长，高浓度抑制细胞生长的特性，可以得出结论，利用小球藻处理白酒酿造底锅水进行生物质转化后提取得到的cgf具有生理活性，实现了对白酒酿造底锅水再利用生产高附加值提取物的目标。

技术特征：
1.利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、将小球藻接种于白酒酿造底锅水溶液中，置于摇床条件下培养3～7天，得小球藻培养液；b、将小球藻培养液进行离心分离，收集含有小球藻细胞和底锅水悬浮固体的沉淀；c、将沉淀悬浮于水中，加热，破碎细胞得小球藻混合液；d、将小球藻混合液进行离心分离，取含有小球藻生长因子的上清液；e、将上清液用滤膜过滤，经冷冻和冻干，得小球藻生长因子干粉。2.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤a中，所述小球藻先采用se培养基进行活化，其操作为：将小球藻种子液接种于se培养基中，在光照摇床中培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得一级种子液；将一级种子液以5～20％的接种量接种于se培养基中，在光照摇床中扩大培养7～14d，培养条件：温度25～30℃，光照强度3000～8000lux，光照周期12：12～24：0，转速100～150rpm，得二级种子液；二级种子液以3000～5000rpm转速无菌离心3～5min，弃上清，沉淀经洗涤，即得活化后的小球藻。3.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤a中，至少满足下列的一项：所述白酒酿造底锅水溶液为白酒酿造底锅水质量浓度为25～100％的水溶液；优选质量浓度为100％；所述白酒酿造底锅水溶液的ph为6～7；所述白酒酿造底锅水溶液经115～121℃灭菌15～30分钟；优选121℃灭菌30分钟。4.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤a中，所述小球藻的接种量为0.1～0.2g小球藻/l白酒酿造底锅水溶液。5.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤a中，所述培养的条件为：培养温度25～35℃，摇床转速120～180rpm。6.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤b中，至少满足下列的一项：所述离心分离的转速为5000～8000rpm；优选为5000～6000rpm；所述离心分离的时间为5～10min；优选为6～8min。7.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤c中，至少满足下列的一项：所述水的加入量为80～120ml水/1g步骤b所得沉淀；所述加热的温度为100～150℃；优选为110～120℃；所述加热的时间为30～60min；优选为30～40min。8.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤d中，所述离心分离的转速为10000～12000rpm；所述离心分离的时间30～40min。9.根据权利要求1所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤e中，所述滤膜的孔径为0.22～0.45μm。10.根据权利要求1～9任一项所述的利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，其特征在于：步骤e中，所述冷冻的温度为-40～-18℃。

技术总结
本发明公开了一种利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，属于微生物制品技术领域。本发明提供了一种利用白酒酿造底锅水生产小球藻生长因子的方法，包括：将小球藻接种于白酒酿造底锅水中，培养3～7天；离心分离，收集沉淀；将沉淀冷冻后，溶于水中，加热，得小球藻混合液；离心分离，取上清液；滤膜过滤，经冷冻和冻干，即得。本发明以白酒酿造底锅水作为廉价培养基培养小球藻，以废水资源化所得小球藻为原料提取小球藻生长因子，利用小球藻处理废水的同时使其生长，最终得到CGF产物；实现了废水的有效处理与二次高值化利用，所得CGF对小鼠成纤维细胞L929细胞增殖具有显著影响。小鼠成纤维细胞L929细胞增殖具有显著影响。小鼠成纤维细胞L929细胞增殖具有显著影响。


技术研发人员：谢通慧 赵东 姜翰达 郑佳 王洪
受保护的技术使用者：宜宾五粮液股份有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/20