一种具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6A12突变体及其应用

一种具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体及其应用。


背景技术：

2.功能性结构脂质是通过化学法或酶法对天然油脂中的脂肪酸组成及其在甘油骨架上的位置分布进行调整，合成具有特定营养功能的脂质分子(journal of oleo science，2022,71(12):1697-1709)。采用脂肪酶对脂质进行改性，富集人体必需的不饱和脂肪酸到甘油三酯的骨架上，能够进一步提高脂质的营养和经济价值，同时反应过程绿色且高效。然而，目前工业上常用的脂肪酶在催化反应过程中均没有长链选择性，如novozym435、rm im、tl im和ls-20等，novozym435不具备位置专一性和链长专一性，rm im、tl im和ls-20是sn-1.3位专一性的脂肪酶(food chemistry，2015,173:1030-1036)。自然界中具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶大多是一些微生物来源的脂肪酶，此类脂肪酶的催化活力不高，难以应用于生产实际。因此，亟需筛选可以富集不饱和脂肪酸的脂肪酶，并基于分子改良手段提升其催化活力。
3.目前，富集不饱和脂肪酸的脂肪酶筛选方法包括透明圈法、颜色反应法、氟素底物法、酶活测定法等(cn102191232a)。同时，随着计算机技术的发展，在ncbi和pdb蛋白数据库进行基因挖掘，进而诱导表达和筛选具有高催化活力的脂肪酶突变体也是一大热点。此外，针对脂肪酶底物特异性的相关研究表明，geobacillus来源的细菌中存在多种具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶(cn115044503a)。例如，以geobacillus来源的脂肪酶(gtl)为研究对象，分别采用两种不同链长的底物与gtl进行对接，寻找脂肪酶与底物相互作用的氨基酸位点并进行定点突变，构建出具有富集ω-3多不饱和脂肪酸能力的gtl突变体(dm-gtl)(plos one，2020,15(4):e0231177)。得益于geobacillus表达的脂肪酶具有良好的稳定性，其在工业生产中具有广泛的应用前景。因此，具有底物特异性的geobacillus来源的脂肪酶有望在结构脂质的制备过程中选择性富集营养价值更高的多不饱和脂肪酸。
4.综上，本发明以从pdb数据库中筛选到的geobacillus来源的具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12为模板，模拟并分析其蛋白质的三维结构，依据计算机辅助设计系统，以提高脂肪酶催化活性为目的，通过理性设计和分子动力学模拟等方式筛选脂肪酶6a12的突变位点，获得催化活性增强的一种脂肪酶突变体k100f。以脂肪酶突变体k100f为催化剂改性蚕蛹油制备结构脂质，获得产物的sn-1,3位α-亚麻酸占比高达85％。


技术实现要素：

5.解决的技术问题：本发明提供一组具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体及其应用。改组突变体来源于真菌geobacillus中的脂肪酶6a12，通过分子动力学模拟的手段筛选突变位点，理性设计定向改良脂肪酶6a12的催化活性，使其适用于高效制备富含
不饱和脂肪酸的结构脂质。
6.技术方案：一组具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体，所述突变体为k100f；所述突变体k100f的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.突变体k100f的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.一种重组载体，含有上述核苷酸序列。
9.一种重组菌株，含有上述重组载体。
10.上述脂肪酶6a12突变体在油脂酶法改性中的应用。
11.上述重组菌株在油脂酶法改性中的应用。
12.上述具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体的构建方法，包括以下步骤：
13.1)选择脂肪酶6a12为出发材料，通过多序列比对和结构分析设计单点突变，筛选可能影响脂肪酶6a12催化活性的关键氨基酸位点，设计并构建引物序列；
14.2)采用over-lap pcr的方法扩增脂肪酶6a12突变体的序列片段；
15.3)将脂肪酶6a12突变体的序列片段克隆到表达载体pet28a的ecor i和not i限制性酶切位点之间，获得重组载体；
16.4)将突变体重组载体转化大肠杆菌bl21中，诱导表达，获得突变菌株；
17.5)培养突变菌株，诱导脂肪酶6a12突变体表达并筛选；
18.6)回收并纯化所表达的脂肪酶6a12突变体。
19.有益效果：本发明提供一种具有富集不饱和脂肪酸能力的、高催化活力的、适合于脂质酶法改性的脂肪酶6a12突变体。该突变体的相对活性分别是野生型的360.57
±
2.13％。在改性结构脂质的应用方面，以突变体k100f做为催化剂，采用磁响应微流场固定化该脂肪酶催化改性蚕蛹油制备富含α-亚麻酸的蚕蛹油结构脂质，2min内能够富集85％的α-亚麻酸到蚕蛹油甘油三酯的sn-1,3位上，与商业化脂肪酶aspergillus niger lipase(sn-1,3位α-亚麻酸占比62％，p《0.05)相比，其对不饱和脂肪酸α-亚麻酸的富集能力提升了37.1％。
附图说明
20.图1为脂肪酶6a12突变体(以k100f为例)与野生型的蛋白纯化。
具体实施方式
21.以下将结合附图及实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。给予本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例1脂肪酶6a12突变体构建及表达
23.以pdb中筛选的geobacillus来源的具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12为模板，通过分子动力学模拟筛选脂肪酶6a12的突变位点并设计突变引物，表达突变体。突变方法以及克隆方法参考文献(you，et al.,2016)。
24.所用引物序列如表1所示：
25.表1引物合成清单
[0026][0027]
采用ni-ted 2000packed column色谱柱纯化表达的脂肪酶突变体，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析突变体的蛋白质分子量大小。如图1所示，突变体k100f的条带约为43kda，与脂肪酶6a12野生型的大小(43kda)一致，由于脂肪酶6a12野生型和突变体之间仅一个氨基酸位点不同，因此两者的大小没有差异。
[0028]
实施例2
[0029]
以棕榈酸对硝基苯酯为底物，在ph 9、温度50℃的条件下测定各突变体的催化活性，脂肪酶6a12的催化活性为100％，筛选出催化活性显著提升的脂肪酶突变体k100f，其催化活性是野生型的360.57
±
2.13％。由于部分位点突变后，氨基酸的尺寸、亲水、疏水以及带电性等性质发生改变，整个蛋白质构象以及酶的活性中心可能会受到影响，从而导致脂肪酶的催化活性发生相应的变化。该结果表明，筛选的这几个突变位点是影响脂肪酶催化活性的关键位点。
[0030]
实施例3
[0031]
测定分析突变体k100f的动力学参数。如表3所示，其对c16底物和c18底物的结合度(km)分别为0.53mol/l和0.22mol/l，表明其与c18底物的之间的亲和力强，而对c16底物的结合力较弱。其催化水解这两种底物的转化数(k
cat
)分别为570s-1
和1013s-1
，表明脂肪酶k100f催化水解c18底物时，其催化产物的释放速度更快。同时，脂肪酶k100f催化水解c16底物和c18底物的催化效率(k
cat
/km值)分别是1075ml/s/mg和4604ml/s/mg，其以c18底物为底物时的催化效率显著高于其以c16底物为底物时的催化效率，相比提高3.3倍。因此，脂肪酶突变体k100f有望在酶法改性油脂制备结构脂质的过程中富集更多的不饱和脂肪酸，提高结构脂质的营养价值。
[0032]
表3脂肪酶k100f及6a12水解两种底物的动力学参数
[0033][0034]
实施例4
[0035]
本实施例中以突变体k100f作为催化剂，构建磁响应微流场固定化突变体k100f改性蚕蛹油催化系统，探究底物比、温度以及进样流速对蚕蛹油结构脂质中α-亚麻酸在甘油三酯骨架上分布的影响，结果见表3-5。在尔比(spo:ala)1:6，反应温度50℃以及进样流速为8μl/min的条件下，突变体k100f进行催化改性蚕蛹油制备的结构脂质sn-1,3位α-亚麻酸相对含量达到85.14
±
0.56％。与已报道的采用lipozyme rm im进行脂质改性的微流场固定化酶催化工艺相比(结构脂质产品中sn-1,3位α-亚麻酸占比19.8％)(bioresource technology,2016,220:132-141)，脂肪酶k100f对α-亚麻酸的富集能力更强，相比提高了
3.3倍。
[0036]
表3底物比对蚕蛹油结构脂质sn-1,3和sn-2处α-亚麻酸相对含量的影响
[0037][0038]
表4应温度对蚕蛹油结构脂质sn-1,3和sn-2处α-亚麻酸相对含量的影响
[0039][0040]
表5进样流速对蚕蛹油结构脂质sn-1,3和sn-2处α-亚麻酸相对含量的影响
[0041][0042]
综上所述，本发明构建的一组脂肪酶6a12突变体相较于野生型，其相对活性提高均超过250％。此外，以突变体k100f为催化剂酶法改性蚕蛹油富集不饱和脂肪酸，基于磁响应微流场固定化酶催化系统，该突变体能够在2min内富集85％的α-亚麻酸于蚕蛹油甘油三酯的sn-1,3位(蚕蛹油sn-1,3位α-亚麻酸占比30％)。表明本发明所构建的这一组脂肪酶突变体具有高效催化富集不饱和脂肪酸的能力。

技术特征：
1.一组具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体，其特征在于，所述突变体为k100f；所述突变体k100f的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述一组具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6a12突变体，其特征在于，突变体k100f的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.一种重组载体，含有权利要求2所示核苷酸序列。4.一种重组菌株，含有权利要求3所述重组载体。5.权利要求1或2所述脂肪酶6a12突变体在油脂酶法改性中的应用。6.权利要求4所述重组菌株在油脂酶法改性中的应用。

技术总结
一种具有富集不饱和脂肪酸能力的脂肪酶6A12突变体及其应用，所述突变体为K100F；所述突变体K100F的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该突变体的相对活性分别是野生型的360.57


技术研发人员：王俊 吴成坤 王金正 游帅 徐远志
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/20