一种野黄芩素提取物及其制备方法

1.本发明涉及一种中药有效成分提取物，特别是从灯盏细辛(短葶飞蓬)中提取野黄芩素提取物及其制备方法。


背景技术：

2.野黄芩素(scutellarein)为灯盏乙素(野黄芩苷)的苷元，灯盏乙素可在体内酶解、酸解或肠道菌群作用下代谢为灯盏乙素苷元(活性代谢物)，即野黄芩素，其生物活性更强，口服比灯盏乙素更易吸收，有更好的生物利用度(张培培等，灯盏乙素和苷元的理化性质及体内外稳定性研究现状，云南中医中药杂志，2019，40(10)：77)。文献报道大鼠灌胃给与等量灯盏乙素苷元和灯盏乙素，结果表明灯盏乙素苷元口服易于吸收，与灯盏乙素相比，其相对生物利用度为301.8％(车庆明等，灯盏乙素苷元不同给药剂量的大鼠药动学比较，中国新药杂志，2006，15(18)：1557)。药效学试验显示，(1)灯盏乙素苷元对大鼠实验性脑缺血模型具有保护作用，疗效优于灯盏花乙素(宋艳等，灯盏花乙素苷元对实验性脑缺血的保护作用，中国新药杂志，2009，18(21)：2061)；(2)灯盏乙素苷元具有抗血栓形成、抗血小板聚集、改善血液流变学指标的作用，疗效优于灯盏花乙素(宋艳等，灯盏花乙素苷元对大鼠血栓形成和血液流变学的影响，中国新药杂志，2011，20(15)：1446)。
3.野黄芩素(灯盏乙素苷元)的天然来源较为稀缺，仅存在少数几种植物中，且含量很低，难以实现大规模生产。目前已有化学方法全合成野黄芩素，但合成步骤较长，收率偏低。灯盏乙素(野黄芩苷)在一些植物中含量较高，如短葶飞蓬(灯盏细辛)、多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬等，可以从这些植物中大量获取，通过化学或生物方法可将灯盏乙素水解或酶解转化为野黄芩素，但也存在诸多缺陷和不足，如酸水解法往往对苷元结构造成破坏，分离纯化困难，且转化率低，造成酸排放污染；生物转化法存在底物浓度不高，生产得率低等问题。


技术实现要素：

4.为了克服目前现有野黄芩素制备方法的不足，本发明提供了一种野黄芩素提取物及其制备方法，可以满意地解决上述问题。
5.申请人通过深入的研究，意外地发现，废弃的黄芩地上部分——黄芩茎叶的水提取液，能高效地将菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液中的灯盏乙素(野黄芩苷)酶解转化为灯盏乙素苷元(野黄芩素)。
6.申请人研究还发现，黄芩生长过程中，不同采收期(如6-12月)采收的黄芩地上部分(黄芩茎叶、黄芩茎或黄芩叶)具有相似的酶活性(经酶解反应转化灯盏乙素为野黄芩素)，而且，采收地上部分(黄芩茎叶)对地下部分黄芩根茎无明显不利的影响。
7.据此，本发明提供了一种野黄芩素提取物的制备方法，将菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液合并反应，收集沉淀物，得到野黄芩素提取物。
8.所述菊科飞蓬属植物选自短葶飞蓬、多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬中的任意一种或多种。灯盏细辛为2020年版中国药典收载的菊科飞蓬属植物短亭飞蓬(erigeron breviscapus(vant.)hand.-mazz.)的干燥全草，在本发明中，可以用灯盏细辛表达短葶飞蓬的干燥全草；灯盏细辛的同属植物多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬等与灯盏细辛相似均含有较高含量的灯盏乙素，可以作为提取野黄芩素的起始原料。
9.所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液的制备方法是：将菊科飞蓬属植物的干燥全草加水煎煮得到水提取液；所述乙醇提取液除去乙醇后的水溶液的制备方法是：将菊科飞蓬属植物的干燥全草用乙醇溶液回流提取，然后收集乙醇提取液，除去乙醇后加水稀释。
10.本发明上述方法中，采用现行常规的方法，以水或含水的乙醇溶液提取菊科飞蓬属植物中灯盏乙素成分，包括菊科飞蓬属植物的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，如现行版中国药典“灯盏细辛注射液”项下灯盏细辛采用水煎煮提取，“灯盏细辛颗粒”项下灯盏细辛采用75％乙醇回流提取。
11.根据本发明的优选技术方案，所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液的制备方法是：向菊科飞蓬属植物的干燥全草加8-15倍重量-体积比(g/ml)的水或者沸水，煎煮提取2-3次，每次提取时间1-2小时，收集水提取液；所述乙醇提取液除去乙醇后的水溶液的制备方法是：向菊科飞蓬属植物的干燥全草加8-15倍重量-体积比的浓度为30％-80％的乙醇溶液，回流提取2-3次，每次提取时间1-2小时，收集乙醇提取液，除去乙醇后加水调节水溶液浓度为0.1-1g生药/ml。此处的生药或原料以干草进行重量计算，所述的乙醇溶液系乙醇-水溶液(下同)。
12.本发明通常建议采用菊科飞蓬属植物干草全草进行提取，但一些特殊工艺要求条件下，也可以选择菊科飞蓬属植物干草局部(如茎或叶)进行提取，或者利用菊科飞蓬属植物生草进行提取，这并不构成对本发明的限制。
13.所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液(水溶液)的制备方法是：黄芩茎和/或黄芩叶粉碎，加水搅拌提取，收集水提取液即为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液经膜浓缩后调节ph3-5，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎叶的水溶液。本说明书所述的黄芩茎和/或黄芩叶系指黄芩茎叶(即地上部分)、黄芩茎或黄芩叶，具有相似的酶活性。
14.黄芩茎和/或黄芩叶用水可以在0-50℃的条件下提取其水溶液，上述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液合并，加热至温度一般不宜高于50℃，过高会影响酶的活性和酶解效果。
15.根据本发明的优选技术方案，所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液(水溶液)的制备方法是：黄芩茎和/或黄芩叶粉碎至粒径≤5目筛孔的粉粒，加8-20倍重量-体积比的水，在0-50℃的条件下搅拌提取1-3次，每次提取时间0.25-1小时，收集水提取液即为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液经膜浓缩后调节ph3-5，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液。
16.黄芩茎和/或黄芩叶可粉碎至现行中国药典规定的最粗粉、粗粉或中粉等，更有利
于黄芩茎叶酶的提取。此时，更好的提取方式，是在搅拌下进行。实验显示，虽然粉碎的粒径越细小，越有利于水提取的效率和充分性，但粒径过于细小也会增大提取后的分离操作难度，加大了生产成本、降低了生产效率，可综合平衡后确定。
17.野黄芩素提取物的制备方法中，以菊科飞蓬属植物的干燥全草和黄芩茎和/或黄芩叶的干重进行计量，所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液使用的菊科飞蓬属植物原料，与所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液使用的黄芩茎和/或黄芩叶原料的质量比为10：(0.25-5)。
18.所述菊科飞蓬属植物的干燥全草是指在人工干燥或者自然风干、晾晒干燥等条件下干燥至水分基本稳定，一般不得过12.0％，这是容易实现的。
19.黄芩茎和/或黄芩叶的干重亦可以通过自然风干、晾晒干燥或人工干燥等干燥至水分基本稳定，一般不得过12.0％。
20.野黄芩素提取物的制备方法中，所述合并反应的条件为：室温至≤50℃的条件下维持5小时以上，收集沉淀物，即得野黄芩素提取物，60％≤野黄芩素含量＜80％。
21.在前述野黄芩素提取物的基础上，本发明还可以进一步获得野黄芩素含量更高的提取物，方法是：所述野黄芩素提取物，用浓度≥70％乙醇提取，收集乙醇提取液，回收乙醇，沉淀或析晶，或进一步重复“提取-收集-回收-沉淀或析晶”操作，得到纯化精制的野黄芩素提取物，80％≤野黄芩素含量＜100％。本步骤中，乙醇回流提取的时间可选择在30分钟至1小时。乙醇回流提取后，还可以采用活性炭脱色回流提取10-30分钟；再进行过滤、减压回收乙醇。
22.野黄芩素提取物的制备方法中，与黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液合并反应前，在所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液中加入相当于所述菊科飞蓬属植物的干燥全草重量的0.2-5％的偏重亚硫酸钠或亚硫酸氢钠，以此作为抗氧化剂。
23.进一步的技术方案是，加入菊科飞蓬属植物的干燥全草重量的0.5-2％偏重亚硫酸钠和/或亚硫酸氢钠，作为抗氧化剂，可明显提高野黄芩素的转化率。
24.在本发明上述方法的基础上，还可以单独或任意组合方式采用下面这些工艺条件从而获得技术方案，并且这些方案中的灯盏细辛可以替换成多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬中的任意一种或多种，作为优选方式，这些工艺条件包括：
25.所述的灯盏细辛、黄芩茎和/或黄芩叶的原料重量份比例优选为10：(2-0.5)，黄芩茎叶酶的活力较强，适当延长酶解时间，可减少黄芩茎和/或黄芩叶用量，降低生产成本。
26.所述的灯盏细辛的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎叶的水溶液合并后，在30-50℃的条件下加热10-25小时。
27.所述的灯盏细辛的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液合并后，在ph值5-7条件下加热并维持10-25小时。
28.所述的灯盏细辛的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液合并后，在ph值5.5-6.5和40-50℃条件下维持10-25小时。
29.所述的野黄芩素提取物，进一步用70-95％乙醇按常规方法提取，优选的方法为搅拌和/或回流提取，收集乙醇提取液，减压回收乙醇、浓缩，静置、沉淀(析晶)，或进一步重复该操作(重结晶)，得到纯化精制高含量的野黄芩素提取物(精制品)，80％≤野黄芩素含量
＜100％。
30.本发明中所提及的乙醇浓度，根据普通理解，是指乙醇溶液的体积百分数。本发明中提及的其他百分比，未特别说明的情况下，系指重量百分比。
31.本发明还提供了一种野黄芩素提取物，其特征是采用上述所述的制备方法制备得到野黄芩素提取物，其中，60％≤野黄芩素含量＜100％wt％。
32.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
33.本发明利用菊科飞蓬属植物为野黄芩素制备的原料，且充分利用黄芩的茎叶，降低了生产野黄芩素的成本；
34.本发明上述制备方法所得产物中野黄芩素的含量高，生产工艺简便可行。
附图说明
35.图1为混合对照品的hplc图。
36.图2为灯盏细辛水煎液供试品的hplc图。
37.图3为酶解产物供试品的hplc图。
38.图中，峰1是野黄芩苷，峰2是野黄芩素。
具体实施方式
39.以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
40.实施例1
41.取灯盏细辛10kg，加水10倍(重量体积比kg/l，下同)，煎煮回流提取3次，每次1.5小时，收集水提取液，加入0.1kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过40目筛，称取1kg，加水10倍，于室温搅拌提取2次，每次0.5小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值6，加热至45℃并保温20小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.5％，野黄芩素含量为66.1％。野黄芩素提取物粉碎过80目筛，称取100g，加入相当于野黄芩素质量的0.15倍量(mg/ml)的80％乙醇，搅拌回流提取30分钟，过滤，乙醇提取液加入适量活性炭，加热回流25分钟，过滤，减压回收乙醇至约1/3体积，静置过夜，析出沉淀或结晶，过滤，干燥，即野黄芩素提取物精制品52.1g，野黄芩素含量为90.5％。
42.实施例2
43.取灯盏细辛10kg，加水15倍，煎煮回流提取2次，每次2小时，收集水提取液，加入0.5kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过5目筛，称取5kg，加入冰水20倍，于0-5℃搅拌提取1小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值5，加热至50℃并保温5小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.2％，野黄芩素含量为64.3％。野黄芩素提取物粉碎过60目筛，称取100g，加入相当于野黄芩素质量的0.3倍量(mg/ml)的95％乙醇，搅拌回流提取1小时，过滤，乙醇提取液加入适量活性炭，加热回流15分钟，过滤，减压回收乙醇至约1/4体积，静置过夜，析出沉淀或结晶，过滤，干燥，即野黄芩素提取物精制品48.7g，野黄芩素含量为91.5％。
44.实施例3
45.取灯盏细辛10kg，加水8倍，煎煮回流提取3次，每次1小时，收集水提取液，加入0.02kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过80目筛，称取0.25kg，加水8倍，于室温搅拌提取3次，每次0.25小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值7，加热至50℃并保温30小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.1％，野黄芩素含量为62.5％。野黄芩素提取物粉碎过40目筛，称取100g，加入相当于野黄芩素质量的0.2倍量(mg/ml)的70％乙醇，搅拌回流提取30分钟，过滤，乙醇提取液加入适量活性炭，加热回流约30分钟，过滤，减压回收乙醇至约1/3体积，静置过夜，析出沉淀或结晶，过滤，干燥，即野黄芩素提取物精制品55.4g，野黄芩素含量为88.1％。
46.实施例4
47.取灯盏细辛10kg，加30％乙醇15倍量，回流提取2次，每次2小时，收集醇提取液，减压回收除去乙醇后，加水至100l，加入0.05kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过60目筛，称取3kg，加水15倍，于30℃搅拌提取2次，每次0.5小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值6，加热至30℃并保温25小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.4％，野黄芩素含量为64.7％。野黄芩素提取物粉碎过100目筛，称取100g，加入相当于野黄芩素质量的0.1倍量(mg/ml)的80％乙醇，搅拌回流提取30分钟，过滤，乙醇提取液加入适量活性炭，加热回流约20分钟，过滤，减压回收乙醇至约1/3体积，静置过夜，析出沉淀或结晶，过滤，干燥，即野黄芩素提取物精制品55.7g，野黄芩素含量为87.6％。
48.取野黄芩素提取物精制品50g，加入相当于野黄芩素质量的0.15倍量(mg/ml)的80％乙醇，搅拌回流提取30分钟，过滤，减压回收乙醇至约1/3体积，静置过夜，析出沉淀或结晶，过滤，干燥，即高纯度的野黄芩素提取物精制品25.3g，野黄芩素含量为95.6％。
49.实施例5
50.取灯盏细辛10kg，加60％乙醇8倍量，回流提取3次，每次1小时，收集醇提取液，减压回收除去乙醇后，加水至20l，加入0.2kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过80目筛，称取0.5kg，加水12倍，于40℃搅拌提取3次，每次0.25小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值5.5，加热至40℃并保温20小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.3％，野黄芩素含量为63.9％。
51.实施例6
52.取灯盏细辛10kg，加80％乙醇10倍量，回流提取2次，每次1.5小时，收集醇提取液，减压回收除去乙醇后，加水至10l，加入0.2kg亚硫酸氢钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过40目筛，称取4kg，加水15倍，于50℃搅拌提取2次，每次0.25小时，收集水提取液(水溶液)，备用(ii)。i和ii合并，调ph值6.5，室温放置30小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.0％，野黄芩素含量为62.8％。
53.实施例7
54.取灯盏细辛10kg，加沸水15倍，煎煮回流提取2次，每次2小时，收集水提取液，加入0.1kg亚硫酸氢钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过40目筛，称取2kg，加水10倍，室温搅拌提取2次，每次0.5小时，收集水提取液，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散即得黄芩茎叶的水溶液，备用(ii)。i和ii合并，调ph值5，加热至50℃并保温10小时，析出沉淀；过滤，水洗，干
燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.1％，野黄芩素含量为68.7％。
55.实施例8
56.取灯盏细辛10kg，加沸水8倍，煎煮回流提取3次，每次1小时，收集水提取液，加入0.3kg亚硫酸氢钠，溶解，备用(i)。黄芩茎叶粉碎过60目筛，称取1kg，加水10倍，室温搅拌提取3次，每次0.25小时，收集水提取液，用纳滤膜浓缩，除去水、无机盐等小分子物质，截留生物酶，调ph值4，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散即得黄芩茎叶的水溶液，备用(ii)。i和ii合并，调ph值5.5，加热至45℃并保温25小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，收率为2.0％，野黄芩素含量为70.6％。
57.以下申请人提供部分具体的研究结果证明本发明的有益效果。
58.以野黄芩苷酶解转化率为评价指标，对酶解条件进行考察。
59.野黄芩苷酶解转化率＝m2×
m1/(m1×
m2)
60.式中，m1为野黄芩苷质量，m2为野黄芩素的实际测得量，m1为野黄芩苷的相对分子质量，m2为野黄芩素的相对分子质量。
61.黄芩茎叶粉碎过40目筛，称取0.2kg，加水10倍(第1次多加吸水率4倍，即第一次加水14倍，第二次加水10倍，下同)，于室温搅拌提取2次，每次0.25小时，收集水提取液，加水调整体积至4l(0.05g生药/ml)，即得黄芩茎叶提取液(含黄芩茎叶酶)，备用。
62.另取灯盏细辛1kg，加水10倍(第1次多加吸水率5倍)，煎煮回流提取2次，每次1.5小时，收集水提取液，加水调整体积至20l(0.05g生药/ml)，即得灯盏细辛水煎液(野黄芩苷提取液)，备用。
63.含量测定：
64.1、高效液相色谱条件
65.色谱柱:agilent eclipse xdb-c
18
(4.6
×
250mm，5μm)；柱温：30℃；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)-甲醇(b)，梯度洗脱(0～12min，40％b；12～30min，40％～55％b)；流速：1.0ml
·
min-1
；检测波长为278nm；进样量：5-10μl。理论塔板数按野黄芩素峰计算应不低于3000。色谱图见图1至图3。
66.2、对照品溶液的制备
67.精密称取野黄芩苷对照品8.16mg，野黄芩素对照品9.05mg，置于50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解定容至刻度，即得163.2μg
·
ml-1
野黄芩苷、181μg
·
ml-1
野黄芩素混合对照品溶液。
68.3、供试品溶液的制备
69.灯盏细辛水煎液供试品溶液制备：取灯盏细辛水煎液1ml至10ml量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得(测定野黄芩苷)。
70.酶解产物供试品溶液制备：黄芩茎叶提取液与灯盏细辛水煎液合并酶解，加入3倍酶解体系量乙醇终止反应，转移至50ml或100ml容量瓶中，超声处理(300w，40khz)20min，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得(测定野黄芩素)。
71.从图1至图3可以看出，灯盏细辛水煎液供试品溶液中含有野黄芩苷，而酶解产物供试品溶液中转化成为野黄芩素，表明黄芩茎叶提取液与灯盏细辛水煎液合并后进行了酶解反应，使得野黄芩苷充分转化成了野黄芩素。
72.实验1抗氧化剂种类对转化率的影响
73.取灯盏细辛水煎液10ml，分别不加抗氧化剂、加1％亚硫酸钠、1％偏重亚硫酸钠、1％亚硫酸氢钠(以灯盏细辛重量计，下同)，加入黄芩茎叶提取液1ml，于45℃水浴酶解20h(ph约为6左右，下同)。按照上述含量测定项下方法操作测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表1。
74.表1抗氧化剂对转化率的影响
[0075][0076]
实验2ph值对转化率的影响
[0077]
取灯盏细辛水煎液10ml，加1％偏重亚硫酸钠，加入黄芩茎叶提取液1ml，调节ph使酶解体系ph分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，于45℃水浴酶解20h。同上测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表2。
[0078]
表2ph值对转化率的影响
[0079][0080]
实验3酶解温度对转化率的影响
[0081]
取灯盏细辛水煎液10ml，加1％偏重亚硫酸钠，加入黄芩茎叶提取液1ml，分别于室温、40、45、50、55、60℃水浴酶解20h。同上测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表3。
[0082]
表3温度对转化率的影响
[0083][0084]
实验4酶解时间对转化率的影响
[0085]
取灯盏细辛水煎液10ml，加1％偏重亚硫酸钠，加入黄芩茎叶提取液1ml，于45℃水浴分别酶解5、10、15、20、25h。同上测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表4。
[0086]
表4酶解时间对转化率的影响
[0087][0088]
实验5抗氧化剂用量对转化率的影响
[0089]
取灯盏细辛水煎液10ml，分别加0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％偏重亚硫酸钠，加入黄芩茎叶提取液1ml，于45℃水浴酶解20h。同上测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表5。
[0090]
表5抗氧化剂用量对转化率的影响
[0091][0092][0093]
实验6黄芩茎叶用量对转化率的影响
[0094]
取灯盏细辛水煎液10ml，加1％偏重亚硫酸钠，分别加入黄芩茎叶提取液0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml，于45℃水浴酶解20h。同上测定各样品中野黄芩苷的转化率，结果见表6。
[0095]
表6黄芩茎叶用量对转化率的影响
[0096][0097]
实验7多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬提取野黄芩素提取物
[0098]
黄芩茎叶粉碎过40目筛，称取0.4kg，加水10倍(第1次多加吸水率4倍)，于室温搅拌提取2次，每次0.25小时，收集水提取液，等分成4等份，备用(i)。
[0099]
分别取多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬各1kg，加水10倍(第1次多加吸水率5倍)，煎煮回流提取2次，每次1.5小时，收集水提取液，加入0.01kg偏重亚硫酸钠，溶解，备用(ii)。
[0100]
i和ii合并，加热至约45℃并保温20小时，析出沉淀；过滤，水洗，干燥，即得野黄芩素提取物，测定野黄芩素含量，结果见表7。
[0101]
表7多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬提取野黄芩素实验
[0102][0103]
上述实施例和实验结果表明，黄芩茎叶提取的水溶液富含黄芩茎叶酶，可高效酶解灯盏细辛的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液中的野黄芩苷，转化为野黄芩素，野黄芩素难溶于水，生成沉淀，过滤，水洗，干燥，得到野黄芩素提取物(粗提物)，60％≤野黄芩素含量＜80％；进一步用浓度≥70％乙醇提取，收集乙醇提取液，回收乙醇，析出沉淀或结晶，或进一步重复该操作(重结晶)，得到纯化精制的野黄芩素提取物(精制品)，80％≤野黄芩素含量＜100％。精制纯化后的母液或滤液可继续浓缩，静置、沉淀，得到野黄芩素；根据目标产物的纯度要求，可进行多次纯化/重结晶得到高纯度的野黄芩素提取物。上述实验结果还发现，野黄芩苷的转化率与黄芩茎叶用量、酶解温度、酶解时间等密切相关，如灯盏细辛与黄芩茎叶的重量比为10：0.25时，可适当延长酶解时间(≥30h)，重量比为10：5时，可适当减少酶解时间(如5h)。黄芩茎叶酶最适酶解温度约为40-50℃左右，如在室温条件下酶解，需适合延长酶解时间或增加黄芩茎叶用量。黄芩茎叶酶最适酶解ph值为5.5-6.5(表2)，本发明所述灯盏细辛的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎叶的
水溶液合并后，其ph值约为6左右，故一般情况下无需调节ph值。不同来源的黄芩茎叶、灯盏细辛原料对转化率、收率和含量均有一定的影响，故建议实际生产中应进一步固定原料基源、产地、采收加工、酶活力、含量等要求。
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尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

技术特征：
1.一种野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，将菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液合并反应，收集沉淀物，得到野黄芩素提取物；其中，所述菊科飞蓬属植物选自短葶飞蓬、多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬中的任意一种或多种。2.根据权利要求1所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液的制备方法是：将菊科飞蓬属植物的干燥全草加水煎煮得到水提取液；所述乙醇提取液除去乙醇后的水溶液的制备方法是：将菊科飞蓬属植物的干燥全草用乙醇溶液回流提取，然后收集乙醇提取液，除去乙醇后加水稀释。3.根据权利要求2所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液的制备方法是：向菊科飞蓬属植物的干燥全草加8-15倍重量-体积比的水或者沸水，煎煮提取2-3次，每次提取时间1-2小时，收集水提取液；所述乙醇提取液除去乙醇后的水溶液的制备方法是：向菊科飞蓬属植物的干燥全草加8-15倍重量-体积比的浓度为30％-80％的乙醇溶液，回流提取2-3次，每次提取时间1-2小时，收集乙醇提取液，除去乙醇后加水调节水溶液浓度为0.1-1g生药/ml。4.根据权利要求1所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液的制备方法是：黄芩茎和/或黄芩叶粉碎，加水搅拌提取，收集水提取液即为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液经膜浓缩后调节ph3-5，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎叶的水溶液。5.根据权利要求4所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液的制备方法是：黄芩茎和/或黄芩叶粉碎至粒径≤5目筛孔的粉粒，加8-20倍重量-体积比的水，在0-50℃的条件下搅拌提取1-3次，每次提取时间0.25-1小时，收集水提取液即为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液；或将上述收集的水提取液经膜浓缩后调节ph3-5，静置过夜，收集沉淀，加水溶解分散作为黄芩茎和/或黄芩叶的水溶液。6.根据权利要求1-5任意一项所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，以菊科飞蓬属植物的干燥全草、黄芩茎和/或黄芩叶的干重进行计量，所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液使用的菊科飞蓬属植物原料，与所述黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液使用的黄芩茎和/或黄芩叶原料的质量比为10：(0.25-5)。7.根据权利要求1-5任意一项所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述合并反应的条件为：室温至≤50℃的条件下维持5小时以上，收集沉淀物，即得野黄芩素提取物，60％≤野黄芩素含量＜80％。8.根据权利要求7所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，所述野黄芩素提取物，用浓度≥70％乙醇提取，收集乙醇提取液，回收乙醇，沉淀或析晶，或进一步重复“提取-收集-回收-沉淀或析晶”，得到纯化精制的野黄芩素提取物，80％≤野黄芩素含量＜100％。9.根据权利要求1所述的野黄芩素提取物的制备方法，其特征在于，与黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液合并反应前，在所述菊科飞蓬属植物的干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液中加入相当于所述菊科飞蓬属植物的干燥全草重量的0.2-5％的偏重亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。
10.一种野黄芩素提取物，其特征是，采用权利要求1-5、8-9任意一项所述的制备方法制备得到所述的野黄芩素提取物，其中，60％≤野黄芩素含量＜100％。

技术总结
本发明公开了一种野黄芩素提取物及其制备方法，将菊科飞蓬属植物干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液，与黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液合并反应，就可以得到野黄芩素提取物，60％≤野黄芩素含量＜100wt％。菊科飞蓬属植物选自短葶飞蓬、多舌飞蓬、长茎飞蓬、小飞蓬、飞蓬中的任意一种或多种。黄芩茎和/或黄芩叶的水提取液能高效地将菊科飞蓬属植物干燥全草的水提取液或乙醇提取液除去乙醇后的水溶液中的灯盏乙素(野黄芩苷)酶解转化为灯盏乙素苷元(野黄芩素)。本发明利用菊科飞蓬属植物为野黄芩素制备的原料，且充分利用黄芩的茎叶，降低了生产野黄芩素的成本；制备方法所得产物中野黄芩素的含量高，生产工艺简便可行。生产工艺简便可行。生产工艺简便可行。


技术研发人员：易进海 刘云华 黄志芳 陈燕 刘玉红
受保护的技术使用者：四川省中医药科学院
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/20