OsGRP1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用

osgrp1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及osgrp1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。


背景技术：

2.从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。
3.杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。
4.目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因子。按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制作物种子大小及产量的思路和方法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟待解决的关键问题之一。
5.长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育杂交作物，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。基因工程方法相比传统方法具有一些特点：选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供osgrp1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。
7.本发明提供了osgrp1蛋白或osgrp1基因在调控植物的株高和/或育性中的应用。
8.所述调控的含义为：osgrp1蛋白含量降低，植物的株高降低和/或育性降低。
9.所述调控的含义为：osgrp1基因表达量降低，植物的株高降低和/或育性降低。
10.本发明还提供了osgrp1蛋白或osgrp1基因作为抑制靶标在植物育种中的应用；所述植物育种的目标为培育株高降低和/或育性降低的植物。
11.本发明还提供了抑制osgrp1蛋白的物质或抑制osgrp1基因的物质在植物育种中的应用；所述植物育种的目标为培育株高降低和/或育性降低的植物。抑制osgrp1基因具体可为抑制osgrp1基因表达。抑制osgrp1基因表达的物质具体可为：以osgrp1基因为靶标的基因编辑载体。所述基因编辑载体表达cas9蛋白和sgrna。所述sgrna的靶标位于osgrp1基因中。具体的，所述sgrna的靶标为：atcgctgtggaccgtgagac。所述sgrna的靶标位于序列表的序列3的第820-839位。
12.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：将植物基因组dna中的osgrp1基因的中的区段“gcagatcgctgtggaccgtgagacggggaggtcccg
cgggttcgggttcgtgagcttc”突变为“gcagatcgctgtggaccgtgaagacggggaggtcccgcgggttcgggttcgtgagcttc”。
13.所述突变为纯合型突变，即一对同源染色体上发生了相同突变。
14.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中的osgrp1基因进行基因编辑，得到基因编辑植株，从基因编辑植株中筛选相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植株。所述基因编辑通过导入基因编辑载体实现。所述基因编辑载体表达cas9蛋白和sgrna。所述sgrna的靶标位于osgrp1基因中。具体的，所述sgrna的靶标为：atcgctgtggaccgtgagac。所述sgrna的靶标位于序列表的序列3的第820-839位。
15.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：敲除受体植物基因组中的osgrp1基因，得到相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植物。所述敲除可为全部敲除读码框，也可为部分敲除读码框中的区段。
16.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中的osgrp1基因表达，得到相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植物。抑制受体植物中的osgrp1基因表达具体通过导入基因编辑载体实现。所述基因编辑载体表达cas9蛋白和sgrna。所述sgrna的靶标位于osgrp1基因中。具体的，所述sgrna的靶标为：atcgctgtggaccgtgagac。所述sgrna的靶标位于序列表的序列3的第820-839位。
17.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：通过降低植物中osgrp1蛋白的含量，使植物的株高降低和/或育性降低。
18.本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：通过降低植物中osgrp1蛋白的活性，使植物的株高降低和/或育性降低。
19.以上任一所述osgrp1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
20.(a1)seq id no：1所示的蛋白质；
21.(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
22.(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物的株高和/或育性相关的蛋白质；
23.(a4)来源于水稻且与(a1)具有98％以上同一性且与植物的株高和/或育性相关的蛋白质。
24.所述标签具体可如表1所示。
25.表1标签的序列
26.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
27.以上任一所述osgrp1基因为编码所述osgrp1蛋白的基因。
28.具体的，所述osgrp1基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
29.(b1)编码区如seq id no：2所示的dna分子；
x,zhu jk,lu y.high-throughput genome editing in rice with a virus-based surrogate system.j integr plant biol.2022oct 11.doi:10.1111/jipb.13381.epub ahead of print.pmid:36218268.。
53.水稻品种中花11号：中国农业科学院作物研究所。中花11号由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。中花11号记载于如下文献：倪丕冲.水稻花培新品种—中花11号.作物品种资源，1989年04期。中花11号植株又称为野生型植株，用wt表示。
54.实施例1、制备培养基和侵染液
55.nb基本培养基的配方见表1。
56.表1
[0057][0058][0059]
愈伤诱导培养基(ph5.8)：在nb基本培养基的基础上增加酶水解酪蛋白(使其在培养基中的浓度为500mg/l)、2,4-d(使其在培养基中的浓度为2mg/l)、脯氨酸(使其在培养基中的浓度为2.8g/l)、蔗糖(使其在培养基中的浓度为30g/l)和植物凝胶(使其在培养基中的浓度为2.6g/l)。
[0060]
愈伤继代培养基(ph5.8)：在nb基本培养基的基础上增加酶水解酪蛋白(使其在培养基中的浓度为500mg/l)、2,4-d(使其在培养基中的浓度为2mg/l)、脯氨酸(使其在培养基中的浓度为0.5g/l)、蔗糖(使其在培养基中的浓度为30g/l)和植物凝胶(使其在培养基中的浓度为2.6g/l)。
[0061]
共培养培养基(ph5.2)：在nb基本培养基的基础上增加乙酰丁香酮(使其在培养基中的浓度为100μm)、葡萄糖(使其在培养基中的浓度为10g/l)和植物凝胶(使其在培养基中的浓度为2.6g/l)。
[0062]
筛选培养基(ph5.8)：在nb基本培养基的基础上增加水解酪蛋白(使其在培养基中的浓度为500mg/l)、2,4-d(使其在培养基中的浓度为2mg/l)、脯氨酸(使其在培养基中的浓度为2.8g/l)、蔗糖(使其在培养基中的浓度为30g/l)、g418(使其在培养基中的浓度为150mg/l)、头孢霉素(使其在培养基中的浓度为500mg/l)和植物凝胶(使其在培养基中的浓度为2.6g/l)。
[0063]
分化培养基(ph5.8)：在nb基本培养基的基础上增加激动素kinetin(使其在培养基中的浓度为2mg/l)、naa(使其在培养基中的浓度为0.5mg/l)、蔗糖(使其在培养基中的浓度为30g/l)、山梨醇(使其在培养基中的浓度为30克/升)、g418(使其在培养基中的浓度为150mg/l)、头孢霉素(使其在培养基中的浓度为300mg/l)和植物凝胶(使其在培养基中的浓度为2.6g/l)。
[0064]
生根培养基(ph5.8)：含1/4浓度的ms无机盐、1
×
浓度的ms维生素、0.5mg/l naa、1mg/l多效唑、2.6g/l植物凝胶，余量为水。
[0065]
aam侵染液(ph5.2)的配方见表2。
[0066]
表2
[0067][0068][0069]
实施例2、osgrp1突变株的获得
[0070]
本实施例中，以水稻中花11号植株为出发植株，制备crispr/cas介导的以osgrp1
基因为靶标基因的定点基因编辑植株(即osgrp1突变株)。
[0071]
osgrp1基因来源于水稻(oryza.sativa l.)，编码序列表中序列1所示的osgrp1蛋白(由104个氨基酸残基组成)。水稻cdna中，osgrp1基因的编码框如序列表中序列2所示(由315个核苷酸组成)。水稻基因组dna中，osgrp1基因如序列表中序列3所示(序列表的序列3中，起始密码子位于第99-101位，终止密码子位于第976-978位)。
[0072]
一、基因编辑载体的构建
[0073]
预设靶点为：atcgctgtggaccgtgagac。
[0074]
预设靶点位于序列表的序列3的第820-839位。
[0075]
1、制备单链dna分子sgosgrp1-f和单链dna分子sgosgrp1-r，然后进行退火，得到具有粘末端的双链dna分子。
[0076]
sgosgrp1-f：ggcaatcgctgtggaccgtgagac；
[0077]
sgosgrp1-r：aaacgtctcacggtccacagcgat。
[0078]
2、取pcbsg032载体，用限制性内切酶bsai进行酶切，回收载体骨架(即约1.6kb的线性大片段)。
[0079]
3、步骤1获得的具有粘末端的双链dna分子和步骤2获得的载体骨架连接，得到重组质粒，即为基因编辑载体。基因编辑载体已进行测序验证。
[0080]
二、基因编辑植株的获得
[0081]
1、愈伤诱导与继代
[0082]
取水稻中花11号的成熟种子，剥离颖壳，用75％乙醇溶液消毒1min，然后用无菌水冲洗，然后用30％次氯酸钠溶液消毒20min，然后用无菌水充分清洗，用灭菌滤纸吸干种子表面的水分，然后将种子转移到愈伤诱导培养基上进行培养，得到用于农杆菌侵染的愈伤组织(愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右)。
[0083]
愈伤组织长出后可用原胚直接进行农杆菌侵染。原胚旁边长出的小颗粒可挑取到愈伤继代培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时同样可以进行农杆菌侵染。
[0084]
2、制备农杆菌悬浮液
[0085]
将步骤一制备的基因编辑载体导入农杆菌eha105，得到重组农杆菌。培养重组农杆菌并收集菌体，用aam侵染液悬浮，得到od
600nm
值为0.3-0.5农杆菌悬浮液。
[0086]
3、农杆菌侵染
[0087]
取步骤1获得的愈伤组织，浸没于步骤2制备的农杆菌悬浮液中，室温侵染20分钟(期间不时晃动)，然后取出愈伤组织，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，26℃暗培养3天。
[0088]
4、筛选培养
[0089]
完成步骤3后，取愈伤组织，先用无菌水冲洗2次，然后用羧苄青霉素溶液冲洗1次，用移液枪吸掉多余水分后转移到无菌滤纸上在超净台上风干表面水分，然后转移到含潮霉素的筛选培养基上，28-30℃暗培养3-4周，此时可以观察到长出了颜色鲜黄、直径1-2mm的阳性愈伤。
[0090]
5、分化再生
[0091]
取步骤4获得的阳性愈伤，转移到分化培养基上，28-30℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。培养10天左右可观察到愈伤冒出绿点，再培养10天左右会有幼苗分化出，培养至
分化出的幼苗株高为2-3cm。
[0092]
6、生根
[0093]
取步骤5获得的幼苗，转移至生根培养基上，28-30℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。生根的幼苗即为t0代植株。
[0094]
三、突变形式的鉴定
[0095]
步骤二获得的t0代植株自交并收获种子，将种子培育为植株，即为t1代植株。
[0096]
取t1代植株的叶片，提取基因组dna，采用cas9-osgrp1-f和cas9-osgrp1-r组成的引物对进行pcr扩增，然后回收扩增产物并测序。根据测序结果筛选突变株。
[0097]
cas9-osgrp1-f：cgccgggccaatttatacac；
[0098]
cas9-osgrp1-r：tgtcctggaagctcacgaac。
[0099]
从t1代植株中筛选到1株纯合型突变株，将其命名为osgrp1突变株。
[0100]
相对野生型植株的基因组dna，osgrp1突变株的基因组dna中的osgrp1基因的第二个外显子前端插入了1个a核苷酸，造成了移码(即一对同源染色体中均发生了如下突变：由“gcagatcgctgtggaccgtgagacggggaggtcccgcgggttcgggttcgtgagcttc”突变为“gcagatcgctgtggaccgtgaagacggggaggtcccgcgggttcgggttcgtgagcttc”)，不能翻译出正常蛋白。测序结果见图2。
[0101]
实施例3、性状鉴定
[0102]
供试种子：实施例2获得的osgrp1突变株自交获得的种子，野生型植株的种子。
[0103]
将供试种子播种并培养至出苗，然后转移至北京郊区的大田。
[0104]
1、观察植株的株高表型
[0105]
成熟期植株的照片见图3。与野生型植株相比，osgrp1突变株的后代植株的株高显著降低。
[0106]
2、花粉表型以及花粉育性分析
[0107]
植株开花期，取花粉期小花，在体视镜下解剖获得花药，滴加i
2-ki溶液，快速捣碎花药释花粉，显微镜下观察花粉并拍照。i
2-ki染液：将0.5g ki溶于1.25ml去离子水，加入0.25g碘片，再稀释至75ml，避光保存。
[0108]
花药照片以及花粉染色后照片见图4。
[0109]
可育花粉比例和不育花粉比例的统计结果见图5(10株的平均值)。
[0110]
野生型植株的后代植株的成熟花粉由于充满淀粉和其它代谢物，被染成深色，花粉呈圆形。osgrp1突变株的后代植株中超过70％花粉不能被染成深色，花粉发育不正常。结果表明：osgrp1突变株的后代植株的花粉发育受到影响；与野生型植株相比，osgrp1突变株的后代植株的花粉育性显著降低。
[0111]
3、稻穗表型以及种子结实率分析
[0112]
成熟稻穗照片见图6。
[0113]
成熟稻穗中，实粒种子比例和空粒种子比例的统计结果见图7(10株的平均值)。
[0114]
与野生型植株相比，osgrp1突变株的后代植株的种子结实率显著降低(结实率不到30％)。
[0115]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.osgrp1蛋白或osgrp1基因在调控植物的株高和/或育性中的应用；所述osgrp1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)seq id no：1所示的蛋白质；(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物株高和/或育性相关的蛋白质；(a4)来源于水稻且与(a1)具有98％以上同一性且与植物株高和/或育性相关的蛋白质；所述osgrp1基因为编码所述osgrp1蛋白的基因。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述osgrp1基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)编码区如seq id no：2所示的dna分子；(b2)seq id no：3所示的dna分子；(b3)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。3.osgrp1蛋白或osgrp1基因作为抑制靶标在植物育种中的应用；所述植物育种的目标为培育株高降低和/或育性降低的植物；所述osgrp1蛋白为权利要求1中所述的osgrp1蛋白；所述osgrp1基因为权利要求1或2中所述的osgrp1基因。4.抑制osgrp1蛋白的物质或抑制osgrp1基因的物质在植物育种中的应用；所述植物育种的目标为培育株高降低和/或育性降低的植物；所述osgrp1蛋白为权利要求1中所述的osgrp1蛋白；所述osgrp1基因为权利要求1或2中所述的osgrp1基因。5.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：以纯合突变的方式将植物基因组dna中的osgrp1基因的中的区段“gcagatcgctgtggaccgtgagacggggaggtcccgcgggttcgggttcgtgagcttc”突变为“gcagatcgctgtggaccgtgaagacggggaggtcccgcgggttcgggttcgtgagcttc”。6.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中的osgrp1基因进行基因编辑，得到基因编辑植株，从基因编辑植株中筛选相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植株；所述osgrp1基因为权利要求1或2中所述的osgrp1基因。7.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：敲除受体植物基因组中的osgrp1基因，得到相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植物；所述osgrp1基因为权利要求1或2中所述的osgrp1基因。8.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中的osgrp1基因表达，得到相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植物；所述osgrp1基因为权利要求1或2中所述的osgrp1基因。9.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：通过降低植物中osgrp1蛋白的含量，使植物的株高降低和/或育性降低；所述osgrp1蛋白为权利要求1中所述的osgrp1蛋白。10.一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：通过降低植物中
osgrp1蛋白的活性，使植物的株高降低和/或育性降低；所述osgrp1蛋白为权利要求1中所述的osgrp1蛋白。

技术总结
本发明公开了OsGRP1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。本发明提供了OsGRP1蛋白或OsGRP1基因在调控植物的株高和/或育性中的应用。所述调控的含义为：OsGRP1蛋白含量降低，植物的株高降低和/或育性降低；OsGRP1基因表达量降低，植物的株高降低和/或育性降低。本发明还提供了一种培育株高降低和/或育性降低的植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中的OsGRP1基因表达，得到相对于所述受体植物株高降低和/或育性降低的植物。本发明可用于培育抗倒伏的雄性不育水稻。发明可用于培育抗倒伏的雄性不育水稻。


技术研发人员：王东辉 白书农 许智宏
受保护的技术使用者：北京大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/9/20