与先天性心脏病相关的CYP51A1基因低频错义突变及其应用

与先天性心脏病相关的cyp51a1基因低频错义突变及其应用
发明领域
1.本发明属于基因工程及发育医学领域，涉及cyp51a1基因c.1147a》g突变及其在先天性心脏病早期辅助诊断和治疗中的应用。


背景技术：

2.先天性心脏病(简称先心)是全球范围内最常见的先天性出生缺陷，约占所有主要出生缺陷的28％。其临床表型多样，包括房间隔缺损(asd)，室间隔缺损(vsd)，肺动脉狭窄(ps)，动脉导管未闭(pda)，法洛四联症(tof)等。
3.心脏发育经历了心管形成、环化、内部分隔、血管连接等过程，任何环节遭到干扰都可能引起先天性缺陷。先心的表型复杂多样，临床亚型多达几十种，其病因机制存在明显的异质性。流行病学研究显示，尽管环境危险因素如：母体疾病，病毒感染和致畸物暴露等与先心发病有关，但在致病过程中发挥主导作用的是遗传危险因素。随着基因组学方法的发展，越来越多的遗传学因素逐渐被发现。既往基于家系的连锁分析和候选基因序列分析发现了一些先天性心脏病的致病突变，但是局限于少数已知的心脏发育相关重要基因的编码区突变。另一方面，全基因组关联分析(gwas)已经成为人们探究散发性先心遗传易感位点的有力“武器”，它的优势在于不基于任何病因假设，不局限于已知基因/通路，能够将研究范围扩大到整个基因组的遗传变异，可为先心遗传易感因素研究提供新的线索。然而，gwas研究策略是基于“常见变异”的遗传假说，通过标签snp代表整个基因组的常见变异(较小等位基因频率，maf≥5％)，难以对低频变异进行系统研究，而低频变异(maf＜5％)往往具有较高的外显性，对疾病的贡献甚至高于常见变异。
4.因此，采用外显子组芯片的分型技术，基于多阶段、大样本的病例-对照研究探索低频变异在先心的发生中发挥的重要作用；并利用crispr/cas9技术进行点突变小鼠模型构建，对于所发现位点的功能以及作用机制进一步进行研究。本研究结果有望将新发现的标志物用于遗传学咨询，分析人群子代先心患病风险，筛查子代先心高危人群，并为早期诊断和治疗提供数据支持；此外，还有助于发现与先心发病风险相关全新的、功能性的变异，为先心的发生提出新的生物学机制。


技术实现要素：

5.在该研究中，发明人筛选出人群中cyp51a1与先心病发生相关的新突变，本发明的目的在于提出了一个先心病高危人群筛查和辅助诊断的标志物基因的突变序列。
6.本发明的第二个目的是提供上述突变位点及其特异性引物。
7.发明人通过三阶段、多中心的病例对照研究，鉴定出了cyp51a1 i383v错义突变(c.1147a》g)显著增加先天性心脏病发病风险；并通过crispr/cas9进行点突变小鼠模型构建，显示i383v小鼠胆固醇合成降低继而心肌增殖迟缓，从而导致先天性心脏病的发生，而给点突变孕鼠补充胆固醇后先心病的发生风险能够得到有效的缓解。本发明为先天性心脏病高危人群的遗传咨询，及早期诊断和治疗提供数据支持。
8.本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
9.一种与先天性心脏病相关的cyp51a1基因突变序列，突变后的序列为seq id no.2，所述cyp51a1突变序列与正常基因序列seq id no.1相比具有c.1147a》g突变。
10.用于检测所述突变序列的引物对，其特征在于该引物对为：
11.上游引物核苷酸序列为seq id no.3，下游引物核苷酸序列为seq id no.4。
12.一种用于先天性心脏病的cyp51a1基因突变序列的检测方法：采用sanger测序方法，使用pcr扩增引物，对cyp51a1基因进行突变检测。
13.所述的检测方法，其中pcr扩增引物为seq id no.3-seq id no.4所示的核苷酸序列。
14.所述的引物对在制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。
15.一种用于先天性心脏病辅助诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测所述cyp51a1基因突变序列的引物对。该引物对的序列为seq id no.3-seq id no.4。
16.本发明采用高通量分型平台—illumina human exome bead chip全外显子基因分型芯片，对982名明确诊断为散发型非综合征型先心(asd、vsd以及asd/vsd)患者及2408名来自同一地区、无出生缺陷和心脏疾病的对照进行了全外显子遗传变异检测。经过严格的质量控制，运用logistics回归中的相加模型对70669个合格snps进行了关联分析，并对在病例和对照中频率呈现显著差异的snps进入后续两阶段独立样本验证。验证平台采用taqman基因分型平台。第一阶段验证样本为来自中国其他地区的1803名非综合征型先心(asd、vsd以及avsd)患者及6160名对照，第二阶段验证样本为来自南京地区的840名其他亚型先心(非asd、vsd的其他非综合征型先心)患者及2052名对照，并最终进行了三阶段研究的meta分析。
17.以上研究所发现的与先天性心脏病辅助诊断相关的突变位点为c.1147a》gp.ile383val，该突变发生于第7号染色体的92118555位置，ncbi数据库(gene id:1595)中该突变位点及其前后100bp的碱基序列如seq id no:1所示(正常序列)，cyp51a1基因突变序列对应的序列如seq id no:2所示，其中突变位点为在seq id no:1序列的第101位由碱基a突变为g碱基。
18.seq id no:1
19.agtctgtggagagaatctgcctcctttaacttatgaccagctcaaggatctaaatttacttgatcgctgtataaaagaaacattaagacttagacctcctataatgatcatgatgagaatggccagaactcctcagactgtggcagggtataccattcctccaggacatcaggtgtgtgtttctcccactgtcaatcaaag
20.seq id no:2
21.agtctgtggagagaatctgcctcctttaacttatgaccagctcaaggatctaaatttacttgatcgctgtataaaagaaacattaagacttagacctcctgtaatgatcatgatgagaatggccagaactcctcagactgtggcagggtataccattcctccaggacatcaggtgtgtgtttctcccactgtcaatcaaag
22.所述的突变位点的特异性测序引物，该引物为：
23.c.1147a》g的引物序列为seq id no:3(gctttctcattttagctcaaggatct)和seq id no:4(tggccattctcatcatgatca)。
24.具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)筛选出中国人群中与先天性心脏病发生相关的新突变，提供位点的突变后碱基序列。(2)建立统一标准的标本库和数据库：
以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(3)突变筛选和验证其作用：采用illumina human exome bead chip全外显子基因分型芯片对3600多例先心病患者和10600多例正常人通过三阶段、大样本的病例-对照研究，发现cyp51a1基因上的一个错义突变(c.1147a》g，p.ile383val)在病例组中的出现频率比对照组(or＝3.48；p＝2.16
×
10-15)出现频率更高。通过crispr/cas9进行点突变小鼠模型构建，显示i383v小鼠胆固醇合成降低继而心肌增殖迟缓，从而导致先天性心脏病的发生，而给点突变孕鼠补充胆固醇后先心病的发生风险能够得到有效的缓解。
25.本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了全外显子基因分型芯片对外显子编码区域进行扫描。
26.具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
27.1.研究样本的选择
28.研究中纳入的病例及对照均为无亲缘关系的中国汉族人。先心的诊断以临床超声心动图和专业心脏科医生的诊断结果为标准。对照均来自于同一时期在相同医院就诊的炎症外伤类疾病患者。病例及对照的排除标准如下：1)排除合并其他出生缺陷或发育异常的先心病例；2)排除染色体检查诊断为染色体异常者；3)排除一级亲属(父母、兄弟姐妹、子女)中有患先心病者；4)排除母亲怀孕期间患妊娠糖尿病、苯丙酮尿症者；5)排除母亲怀孕期间接触有毒致畸环境危险物(如杀虫剂、有机溶剂等)者；6)排除母亲怀孕期间服用有致畸危险药品者；7)排除对照中有先天性出生缺陷者；8)排除对照中有心脏疾病者。本研究中纳入的研究对象，18岁以上者由本人签署知情同意书，18岁一下者由其监护人签署知情同意书。纳入研究的病例和对照提供2毫升外周血样本一份。
29.本研究共纳入3600多例先心病患者和10600多例正常人进行研究。
30.2.酚-氯仿法提取外周血基因组dna
31.按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl dna，纯度(紫外260od与280od比值)在1.6-2.0。
32.3.外显子组芯片筛选突变位点
33.(1)取受试者全基因组dna样本；
34.(2)plinkl.9和r软件进行了位点的质量控制，排除分型质量不可靠的位点和样本；
35.(3)基于plinkl.9软件logistic回归模型进行全外显子组关联分析。
36.4.候选snp的验证及关联研究
37.采用taqman基因分型平台(abi 7900ht real time pcr system,applied biosystems)进行基因分型。使用primer express软件(http://www.appliedbiosystems.com)设计引物和探针。根据taqman7900平台检测荧光信号并判断基因型。
38.5.cyp51a1
i383v
点突变小鼠模型构建及功能机制研究
39.(1)利用crispr/cas9技术进行点突变小鼠模型构建；
40.(2)病理切片及h&e染色对刚出生乳鼠及胎鼠心脏结构进行分析，并通过免疫荧光染色观察胎鼠心肌细胞增殖能力；
41.(3)点突变孕鼠补充胆固醇进行回复实验。
42.以下是本发明进一步的说明：
43.采用高通量分型平台—illumina human exome bead chip全外显子基因分型芯片，对982名明确诊断为散发型非综合征型先心(asd、vsd以及asd/vsd)患者及2408名来自同一地区、无出生缺陷和心脏疾病的对照进行了全外显子遗传变异检测。经过严格的质量控制，运用logistics回归中的相加模型对70669个合格snps进行了关联分析。snp rs150090274(c.1147a》g,p.ile383val,or＝3.96；p＝2.29
×
10-5
)在病例和对照中频率呈现显著差异进入后续两阶段独立样本验证。验证平台采用taqman基因分型平台。第一阶段验证样本为来自中国其他地区的1803名非综合征型先心(asd、vsd以及avsd)患者及6160名对照。rs150090274突变基因型[g]显示出与先心发生风险显著相关(or＝2.79,p＝5.18
×
10-5
)。第二阶段验证样本为来自南京地区的840名其他亚型先心(非asd、vsd的其他非综合征型先心)患者及2052名对照。rs150090274突变基因型[g]同样显著增加先心发生风险(or＝4.93，p＝2.24
×
10-8
)。此外，基于既往的gwas基因型填补的研究数据，针对rs150090274上下游2.5mb范围所有常见和罕见位点进行进一步关联分析，未发现p值优于该易感位点的变异，并且该区域无常见或者罕见变异与rs150090274存在高ld关系(r2≥0.5)，说明rs150090274可能为该区域唯一的功能性位点。最后进行了三阶段研究的meta分析，显示i383v在病例中频率远高于对照(1.32％vs.0.36％,or＝3.68,p＝1.75
×
10-15
)。
[0044]
根据上述实验结果，本发明人发现了一个能用于先天性心脏病辅助诊断的突变位点，为筛查子代先心高危人群，及早期诊断和治疗提供数据支持。
[0045]
本发明有益效果：
[0046]
本发明提供的突变位点序列改变作为先天性心脏病辅助判断的标志物的优越性在于：
[0047]
(1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，该类生物标志物的成功开发将为先天性心脏病的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0048]
(2)采用严密的验证和评价体系，本发明人首先利用全外显子基因分型芯片对散发型非综合征型先心患者及对照进行了全外显子遗传变异检测。在经过质量控制之后，对初筛阶段呈现显著差异的snps进行后续两阶段独立样本验证。以上方法和策略的应用加速和保证了突变位点生物标志物在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
附图说明：
[0049]
图1全外显子关联研究研究设计流程图。
[0050]
图2全外显子关联研究曼哈顿图。
[0051]
图3cyp51a1i383v点突变小鼠模型构建。
[0052]
图4各基因型后代心脏缺陷发生率的统计分析及心肌细胞增殖能力的评价。
[0053]
图5正常饮食(nd)和高胆固醇饮食(hcd)母亲后代心脏缺陷发生率的统计分析。
具体实施方式：
[0054]
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，实验过程中未详细描述的操作步骤为
本领域技术人员公知的相关操作步骤，采用的试剂为与检测方法相适应的设备厂商提供的配套试剂及常规试剂，均可从市售获得，不再进行特别说明。
[0055]
实施例1样品的收集和样品资料的整理
[0056]
本研究在芯片初筛阶段纳入的982名明确诊断的先心病例(asd、vsd以及asd/vsd)和2408名非先心对照均为2006年3月至2012年3月间在南京医科大学附属江苏省人民医院和南京医科大学附属南京市儿童医院就诊的患者；第一阶段验证纳入的1803名先心患者(asd、vsd以及asd/vsd)及6160名非先心对照为2009年3月至2012年3月间在第四军医大学附属西京医院就诊的患者。第二阶段验证样本为来自南京地区同期收取的840名其他亚型先心(非asd、vsd的其他非综合征型先心)患者及2052名对照。
[0057]
研究中纳入的病例及对照均为无亲缘关系的中国汉族人。先心的诊断以临床超声心动图和专业心脏科医生的诊断结果为标准。病例及对照的排除标准如下：
[0058]
(1)排除合并其他出生缺陷或发育异常的先心病例；
[0059]
(2)排除染色体检查诊断为染色体异常者；
[0060]
(3)排除一级亲属(父母、兄弟姐妹、子女)中有患先心病者；
[0061]
(4)排除母亲怀孕期间患妊娠糖尿病、苯丙酮尿症者；
[0062]
(5)排除母亲怀孕期间接触有毒致畸环境危险物(如杀虫剂、有机溶剂等)者；
[0063]
(6)排除母亲怀孕期间服用有致畸危险药品者；
[0064]
(7)排除对照中有先天性出生缺陷者；
[0065]
(8)排除对照中有心脏疾病者。
[0066]
采用结构式流行病学调查问卷对病例和对照进行面访调查，采集包括一般情况、出生情况、个人疾病史、家族史、母亲一般情况及孕期情况、父亲一般情况和临床诊断资料等信息。根据统一制定的流行病学资料调查工作手册，培训调查员，统一方法和标准，确保流行病学调查资料的质量。
[0067]
实施例2外周血基因组dna的提取
[0068]
采集研究对象晨起空腹静脉血2ml，置于真空抗凝管中，4小时分离血浆、白细胞和红细胞，分别储存于冻存管中，-80℃冷冻保存。
[0069]
酚-氯仿法提取基因组dna，所用试剂如下：
[0070]
溶血试剂(ph7.5 tris-hcl、蔗糖、mgcl2、1％tritone x-100)；核悬浮液(nacl、ph8.0 edta)；蛋白酶k；sds；平衡酚；te缓冲液；ph5.0 naac；异戊醇；24:1氯仿；异丙醇；乙醇；无水乙醇。
[0071]
提取dna后，采用紫外分光光度法测定dna纯度、浓度，稀释备用。
[0072]
实施例3外显子组芯片筛选突变位点
[0073]
本研究基因分型采用illumina公司的外显子组芯片(illumina human exome bead chip)。
[0074]
质量控制采用plinkl.9和r软件。剔除不合格遗传位点的标准如下：
[0075]
(1)性染色体(x染色体和y染色体)上的遗传位点；
[0076]
(2)在初筛阶段分型样本中单一基因型的位点(即频率为0的位点)；
[0077]
(3)分型成功率＜95％的样本；
[0078]
(4)对照组的hardy-weinberg平衡p值《1
×
10-3
。
[0079]
本研究中所有分析均基于additive遗传模型(自由度为1)，单位点关联分析使用plinkl.9软件基于logistic回归模型进行全外显子组关联分析，计算比值比(odds ratios，ors)和95％可信区间(95％confidence intervals，95％cis)。详细流程见图1。
[0080]
实施例4.候选snp的验证及关联研究
[0081]
采用taqman基因分型平台(abi 7900ht real time pcr system,applied biosystems)进行基因分型。使用primer express软件(http://www.appliedbiosystems.com)设计引物和探针。探针引物具体信息见表1。
[0082]
表1：taqman基因分型探针引物
[0083][0084]
将统一稀释到10ng/μl的dna样本与反应预混试剂按照特定比例在384孔板中混合每孔反应体系5μl(表2)。
[0085]
表2：384孔板反应体系
[0086][0087]
taqman7900仪进行对384孔板中的dna样本进行pcr扩增反应，反应条件如下：
[0088][0089]
根据taqman7900平台检测荧光信号并判断基因型。关联分析结果见表3。
[0090]
表3：全基因组关联分析结果
[0091][0092]
实施例5.cyp51a1
i383v
点突变小鼠模型构建及功能机制研究
[0093]
(1)利用crispr/cas9技术进行点突变小鼠模型构建(图3)。
[0094]
(2)心脏结构及心肌细胞增殖能力的评价。
[0095]
取e12.5的胎鼠心脏和刚出生乳鼠，在4％多聚甲醛(pfa)中固定24小时。然后以8μ
m的增量连续切片，进行苏木精-伊红染色后进行心脏表型判定。
[0096]
取e12.5的胎鼠心脏，在4％多聚甲醛(pfa)中固定2小时后，在4℃下在30％蔗糖中脱水过夜，然后以10μm的增量连续冷冻切片。通过胚胎心脏心肌壁和室间隔处的edu和心肌细胞标记物肌钙蛋白t(tnt)的免疫荧光染色来定量胎鼠心肌细胞增殖能力，结果显示i383v小鼠胆固醇合成降低继而心肌增殖迟缓，从而导致先天性心脏病的发生。结果见图4。
[0097]
(3)点突变孕鼠补充胆固醇进行回复实验。
[0098]
交配之前给予两组wt和杂合雌性小鼠高胆固醇饮食四周，另两组wt和杂合雌性小鼠以正常饮食喂养作为对照，并在配繁和妊娠期间保持相同的饮食习惯。通过h&e染色分析刚出生乳鼠心脏缺陷发生率，结果显示，点突变孕鼠补充胆固醇后先心病的发生风险能够得到有效的缓解。结果见图5。
[0099]
实施例6用于先天性心脏病辅助诊断突变位点试剂盒的制作
[0100]
突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于sanger测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：c.1147a》g突变位点的引物序列为seq id no:3和seq id no:4)，还可以有相应pcr技术所需的常用试剂，如：dntps，mgcl2，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，辅助判断单纯法洛四联症，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

技术特征：
1.一种与先天性心脏病相关的cyp51a1基因突变序列，其特征在于：突变后的序列为seq id no.2，所述cyp51a1突变序列与正常基因序列seq id no.1相比具有c.1147a>g突变。2.用于检测权利要求1所述突变序列的引物对，其特征在于该引物对为：上游引物核苷酸序列为seq id no.3，下游引物核苷酸序列为seq id no.4。3.一种用于先天性心脏病的cyp51a1基因突变序列的检测方法，其特征在于：采用sanger测序方法，使用pcr扩增引物，对cyp51a1基因进行突变检测。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的pcr扩增引物为seq id no.3-seq id no.4所示的核苷酸序列。5.权利要求2所述的引物对在制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。6.一种用于先天性心脏病辅助诊断的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有用于检测权利要求1所述cyp51a1基因突变序列的引物对。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该引物对为权利要求2所述的引物对。

技术总结
本发明属于基因工程及发育医学领域，公开了与先天性心脏病相关的CYP51A1基因低频错义突变及其应用。该基因突变序列为SEQ ID NO.2，所述CYP51A1突变序列与正常基因序列SEQ ID NO.1相比具有c.1147A>G突变。检测该突变的引物对可用于制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒。物对可用于制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒。物对可用于制备先天性心脏病辅助诊断试剂盒。


技术研发人员：胡志斌 沈洪兵 马红霞 戴俊程 顾亚云 周彦
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/9/20