一种用于检测BCR-ABL1融合基因的引物探针组合及其应用的制作方法

一种用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.慢性髓性白血病（cml）是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，是慢性白血病的主要病种，占慢性白血病70%。染色体易位t（9; 22）（q34; q11）形成的费城染色体（ph）是慢性髓性白血病的标志性特征，分子水平表现为22号染色体的bcr基因和9号染色体上的abl1基因形成的bcr-abl1融合基因；根据bcr基因的断裂点不同，可分为m-bcr（p190）、m-bcr（p210）和u-bcr（p230）。
3.cde指导原则强调bcr-abl1定量是cml伴随诊断的关键指标。bcr-abl1基因持续高水平表达、由阴性变为阳性或表达水平逐渐升高则预示疾病复发。目前酪氨酸激酶抑制剂（tki）治疗3、6、12个月以及之后任意时间点的分子学反应已被列入国内外cml诊疗推荐或指南的tki反应评估标准中，且治疗后的cml患者需定期进行bcr-abl1融合基因监测，直至达到稳定的主要分子学反应（mmr）。
4.现有对bcr-abl1(p210)融合基因的检测方法包括：1.荧光pcr法；2.荧光原位杂交法；3.数字pcr法-两步法。但荧光pcr法通常无法精准定量；针对mrd样本，较难满足检测限的需求；荧光原位杂交法步骤繁琐容易造成假阴性；只能定性不能定量；数字pcr法-两步法步骤繁琐，需要先进行逆转录，再使用cdna进行检测，耗时长，如cn116083569a公开了一种用于bcr-abl1基因融合突变ddpcr检测的探针引物组及其应用。
5.综上所述，如何开发操作简便、快速、高特异性和灵敏度的bcr-abl1融合基因检测方法，是bcr-abl1融合基因检测领域亟需解决的问题之一。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合及其应用，开发操作简便、快速、高特异性和灵敏度地bcr-abl1融合基因检测方法。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合，所述引物探针组合包括1对引物对和2条探针；所述引物对的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.2所示的序列；所述探针的核酸序列包括seq id no.3-seq id no.4所示的序列。
9.本发明中，针对bcr-abl1（p210)两种分型（b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）设计特定序列的扩增引物和探针，巧妙配合，可实现高特异性和灵敏的扩增，可用于扩增检外周血中融合基因bcr-abl1（p210)，特别是微小残留病变的检测。
10.seq id no.1：agcttctccctgacatccgt。
11.seq id no.2：cttcactcagaccctgaggct。
12.seq id no.3：cagagttcaaaagcccttc。
13.seq id no.4：ataaggaagaagcccttcag。
14.优选地，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭集基团。
15.优选地，所述荧光基团包括6-fam、vic、cy5或rox中任意一种。
16.优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、mgb或tamra中任意一种。
17.本发明中，进一步以abl1为对照，设计内参引物和探针，对提取和检测过程进行监控。内参基因：abl基因2、3号外显子上设计特异性引物探针，上游引物在2号外显子上、下游引物在3号外显子上、探针跨2、3号外显子，针对性检测rna。
18.优选地，所述引物探针组合还包括1对内参引物对和1条内参探针。
19.优选地，所述内参引物对的核酸序列包括seq id no.5-seq id no.6所示的序列。
20.优选地，所述内参探针的核酸序列包括seq id no.7所示的序列。
21.seq id no.5：atgattttgtggccagtggagat。
22.seq id no.6：ggccatttttggtttgggcttc。
23.seq id no.7：ccggagcttttcacctt。
24.第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合在制备检测bcr-abl1融合基因的产品中的应用。
25.第三方面，本发明提供一种检测bcr-abl1融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合。
26.优选地，所述试剂盒还包括pcr反应液。
27.优选地，所述pcr反应液包括逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dutp。
28.优选地，所述pcr反应液还包括ung酶。
29.本发明中，基于设计的引物探针组合开发检测试剂盒，构建整体检测体系，一步法进行检测，为实现快速、高特异性和灵敏度地bcr-abl1融合基因检测提供新工具。
30.第四方面，本发明提供第一方面所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合在检测bcr-abl1融合基因中的应用。
31.第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测bcr-abl1融合基因的方法，所述方法包括：
32.以待测样本中rna为模板，与第一方面所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合以及pcr反应液混合，进行数字pcr，根据数字pcr结果定量计算bcr-abl1融合基因，所述pcr反应液包括逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dutp。
33.本发明中，基于设计的引物探针组合结合数字pcr，精准控制反应体系和反应条件，整体协同，进一步开发操作简便、快速、高特异性和灵敏度地bcr-abl1融合基因检测方法，一步法进行检测，特殊的扩增程序使阴阳性液滴区分更明显，rain减少，方便判读，定量检测无需额外进行标准曲线计算，2.5 h内即可检测完成。
34.本发明的方法还可用于以非疾病诊断和/或治疗为目的的应用中，例如bcr-abl1融合基因的作用机制、基础行为等科学研究中。
35.优选地，所述逆转录酶工作浓度为10~250 u/μl，包括但不限于11 u/μl、12 u/μl、15 u/μl、20 u/μl、50 u/μl、80 u/μl、100 u/μl、150 u/μl、180 u/μl、190 u/μl、200 u/μl、
220 u/μl、230 u/μl、240 u/μl、245 u/μl、247 u/μl、248 u/μl或249 u/μl；taq酶工作浓度为0.005~0.25 u/μl，包括但不限于0.006 u/μl、0.008 u/μl、0.009 u/μl、0.01 u/μl、0.015 u/μl、0.02 u/μl、0.08 u/μl、0.1 u/μl、0.15 u/μl、0.18 u/μl、0.2 u/μl、0.22 u/μl、0.23 u/μl或0.24 u/μl。
36.优选地，所述mgcl2的工作浓度为2~4 mm。
37.优选地，所述pcr缓冲液的ph为8.6~9。
38.优选地，所述dntp和dutp的工作浓度各自独立地为50~200 nm，包括但不限于51 nm、55 nm、60 nm、70 nm、80 nm、100 nm、150 nm、160 nm、180 nm、190 nm、195 nm、196 nm、197 nm或198 nm。
39.优选地，所述引物探针组合的工作浓度为200~900 nm，包括但不限于201 nm、205 nm、210 nm、300 nm、350 nm、400 nm、600 nm、650 nm、700 nm、800 nm、850 nm或890 nm。
40.本发明中，用于定量检测慢性髓性白血病（chronic myeloid leukemia，cml）成年患者外周血中融合基因bcr-abl1（p210)和abl1的核糖核酸（rna），特别是微小残留病变的检测；通过计算bcr-abl1和abl1拷贝数的比值并换算成国际标准值（international scale percent ratio，%is），以分子反应对数值（molecular reduction level，mr）来表示，能够实现p210两种分型b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）的分型和定量，能够定量检测成年患者外周血中融合基因bcr-abl1（p210)和abl1的核糖核酸（rna）。
41.优选地，所述数字pcr的程序包括：
42.逆转录及预变性：50~55℃，900~1800 s；
43.酶激活：95~98℃，180~300 s；
44.变性：94~96℃，10~30 s，5~10个循环
45.退火、延伸：55~60℃，10~60 s；
46.变性：94~96℃，10~30 s，35~40个循环；
47.退火、延伸：58~63℃，10~60 s；
48.终延伸及荧光采集：70~72℃，120~300 s。
49.优选地，所述逆转录及预变性前还包括防污染的步骤，条件为25℃，300 s。
50.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
51.（1）本发明设计特定序列的引物探针组合，协同配合，能够实现对bcr-abl1（p210)两种型别b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）的快速、高特异性、高灵敏度地扩增；
52.（2）本发明基于特定引物探针组合结合数字pcr，精准控制反应体系和反应条件，整体协同，进一步开发操作简便、快速、高特异性和灵敏度地bcr-abl1融合基因检测方法，定量检测无需额外进行标准曲线计算；特异性强，与p230、p190等其他融合基因无交叉；灵敏度高，线性在mr0.3-mr4.7，定量限在mr4.5，检出限mr4.7，有效检测mrd样本；耗时短：采用一步法扩增体系，2.5 h内检测完成；结果判读简单，检测结束后即可看到数据及图结果，显示清晰。
附图说明
53.图1a为各个组合检测结果1d图；
54.图1b为e13a2体系分别检测e13a2、e14a2两种样本结果1d图，2a和2c代表孔位，2a
位置对应e13a2结果，2c位置对应e14a2结果；
55.图1c为e14a2体系分别检测e13a2、e14a2两种样本结果1d图，2a和2c代表孔位，2a位置对应e13a2结果，2c位置对应e14a2结果；
56.图1d为e13a2和e14a2组合探针体系分别检测e13a2、e14a2两种样本fam通道结果1d图，2a和2c代表孔位，2a位置对应e13a2结果，2c位置对应e14a2结果；
57.图1e为e13a2和e14a2组合探针体系分别检测e13a2、e14a2两种样本vic通道结果1d图，2a和2c代表孔位，2a位置对应e13a2结果，2c位置对应e14a2结果；
58.图2为线性样本实测mr值与理论mr值线性曲线图；
59.图3a为靶基因线性实测结果1d图；
60.图3b为内参基因线性实测结果1d图；
61.图4为mr1.0样本检测结果2d图；
62.图5为定量限样本检测结果1d图；
63.图6为定量限样本检测结果2d图；
64.图7为空白限检测结果1d图。
具体实施方式
65.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
66.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
67.实施例1
68.本实施例针对融合基因bcr-abl1（p210)设计特异性引物探针，进行筛选，包括：靶标基因：e13a2、e14a2特异性探针各两条，5’标记相同荧光基团如6-fam、vic、cy5、rox其中一个，3’端标记淬灭集团如bhq1、bhq2、mgb、tamra其中一个；bcr基因13号外显子上特异性上游引物两条和abl1基因2号外显子上特异性下游引物一条。
69.具体序列如下：
70.bcr-e13-f1（上游引物）：5
’‑
accaactcgtgtgtgaaactcc-3’；
71.bcr-e13-f2（上游引物）：5
’‑
agcttctccctgacatccgt-3’；
72.bcr-a2-r1（下游引物）：5
’‑
cttcactcagaccctgaggct-3’；
73.bcr-e13-p1（探针）：5
’‑
vic-ataaggaagaagcccttcag-3’mgb；
74.bcr-e13-p2（探针）：5
’‑
vic-ctgaccatcaataaggaagaagc-3’mgb；
75.bcr-e14-p1（探针）：5
’‑
vic-gttcaaaagcccttcagcg-3’mgb；
76.bcr-e14-p2（探针）：5
’‑
vic-cagagttcaaaagcccttc-3’mgb。
77.内参基因：abl基因2、3号外显子上设计特异性引物探针，上游引物在2号外显子上、下游引物在3号外显子上、探针跨2、3号外显子,针对性检测rna。探针5’端标记荧光基团如6-fam、vic、cy5、rox其中一个，3’端标记淬灭集团如bhq1、bhq2、mgb、tamr其中一个。
78.具体序列如下：
79.abl1-a2-f（上游引物）：5
’‑
atgattttgtggccagtggagat-3’；
80.abl1-a3-r（下游引物）：5
’‑
ggccatttttggtttgggcttc-3’；
81.abl1-a2a3-p（探针）：5
’‑
rox-ccggagcttttcacctt-3’mgb。
82.不同引物探针组合之间可能会存在干扰（产生非特异扩增，或抑制扩增）所以使用已知浓度样本，按照表1组合分别与内参基因组合进行筛选。
83.表1
[0084][0085]
筛选结果如表2所示。
[0086]
表2
[0087][0088]
由表2可知，组合7检测结果与理论检测值更符合，检测结果1d图阴阳性液滴区分度更好（如图1a，其中横坐标字母a1、b1代表组合1两次结果，c1、d1代表组合2两次结果，e1、f1代表组合3两次结果，g1、h1代表组合4两次结果，a2、b2代表组合5两次结果，c2、d2代表组合6两次结果，e2、f2代表组合7两次结果，g2、h2代表组合8两次结果）。
[0089]
利用上述筛选出的引物和探针结合现有pcr扩增试剂等即可进一步构建检测试剂盒。
[0090]
实施例2
[0091]
本实施例进行bcr-abl1 e13a2、e14a2特异性检测。
[0092]
e13a2体系信息：
[0093]
bcr-e13-f2（上游引物）：5
’‑
agcttctccctgacatccgt-3’；
[0094]
bcr-a2-r1（下游引物）：5
’‑
cttcactcagaccctgaggct-3’；
[0095]
bcr-e13-p1（探针）：5
’‑
fam,-ataaggaagaagcccttcag-3’mgb。
[0096]
e14a2体系信息：
[0097]
bcr-e13-f2（上游引物）：5
’‑
agcttctccctgacatccgt-3’；
[0098]
bcr-a2-r1（下游引物）：5
’‑
cttcactcagaccctgaggct-3’；
[0099]
bcr-e14-p2（探针）：5
’‑
vic-cagagttcaaaagcccttc-3’mgb。
[0100]
e13a2和e14a2组合探针体系信息：
[0101]
bcr-e13-f2（上游引物）：5
’‑
agcttctccctgacatccgt-3’；
[0102]
bcr-a2-r1（下游引物）：5
’‑
cttcactcagaccctgaggct-3’；
[0103]
bcr-e13-p1（探针）：5
’‑
fam-ataaggaagaagcccttcag-3’mgb；
[0104]
bcr-e14-p2（探针）：5
’‑
vic-cagagttcaaaagcccttc-3’mgb。
[0105]
其中bcr-e13-p1（探针）使用fam标记，bcr-e14-p2（探针）使用vic标记，分别使用e13a2、e14a2以及e13a2和e14a2组合探针体系检测e13a2、e14a2两种rna样本，如图1b、图1c、图1d、图1e，结果显示e13a2体系特异性检测e13a2样本，e14a2体系特异性检测e14a2样本，e13a2和e14a2组合探针体系能够检测两种样本，且三种体系检测ratio结果一致（表3）。
[0106]
表3
[0107][0108]
表明本发明设计的特定的引物探针组合，协同配合，能够实现对bcr-abl1（p210)两种分型b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）的快速、高特异性、高灵敏度地扩增。
[0109]
实施例3
[0110]
本实施例检测临床样本（含p230、p190临床样本）、k562细胞系rna、hl60细胞系rna。
[0111]
pcr反应液：包括pcr缓冲体系（含有one-step rt-dpcr buffer（一步法反转录缓冲液）、dntp/dutp 混合物（mix）、mgcl2和rnase inhibitor（rna酶抑制剂））、酶混合液，如表4所示。
[0112]
表4
[0113][0114]
引物探针预混液如表5所示。
[0115]
表5
[0116][0117]
使用上述试剂进行pcr扩增。
[0118]
①
样本制备：实验样本为临床样本（含p230、p190临床样本）、k562细胞系rna、hl60细胞系rna，使用思纳福trizol提取试剂盒提取。
[0119]
②ꢀ
pcr反应扩增体系配制：按照表6配比加入到pcr反应管中，震荡混匀后进行离心，总体系22 μl。
[0120]
表6
[0121][0122]
③ꢀ
pcr扩增：将混匀离心后的pcr反应管放入到数字pcr中，具体操作方法如下：
[0123]
参照《sniper数字pcr分析仪用户使用手册》摆放相应的耗材。
[0124]
样品的设置：点击“setup（设置）
”→“
assignment（分配）”进入样品分配界面；“target（目标）”即荧光通道，靶基因荧光通道选择“vic”，液滴识别通道“cy5.5”；点击“number（数量）”设置生成液滴数量为23000个。
[0125]
按表7程序进行扩增。
[0126]
表7
[0127][0128]
点击“run（运行）
”→“
sample partioning（样本分配）
”→“
start（开始）”开始运行实验。
[0129]
④ꢀ
结果判读如下：
[0130]
a. dpcr反应结束后，打开“analyze plot（分析图）
”→“
1d dot plot（1维点图）
”→“
wells select（孔位选择）”可以查每个孔的扩增结果；
[0131]
b. 选择阳性对照的反应孔，阈值线应设置在阴性和阳性液滴集群间的1/3处（靠近阴性液滴集群），将阈值进行记录；
[0132]
c. 选择所有的反应孔，将记录下的阈值应用于所有反应孔；
[0133]
d. 验证所有的反应孔，确保阈值线不会穿过任何一个反应孔的液滴集群；
[0134]
e. 如果划定的阈值线无法很好的区分待测样本的阴性和阳性液滴集群或者穿过液滴集群，则可对该待测样本进行单独划定阈值线，划定的方法参考“b”步骤；
[0135]
f. 根据划定的阈值线可以得出阳性微滴数、浓度等结果。
[0136]
实施例3
[0137]
本实施例进行临床样本检测。
[0138]
参照实施例2试剂及方法对临床样本检测，验证方法的特异性、灵敏度。
[0139]
线性结果如表8所示，结果表明各浓度梯度均呈线性；图2为理论mr值与实测mr拟合的线性曲线，结果表明线性良好，斜率为1.0133，r2为0.9996；图3a为靶基因线性实测结果1d图，图3b为内参基因线性实测结果1d图，结果显示阴阳性液滴区分良好；图4为mr1.0样本检测结果2d图，结果显示阴阳性区分良好，无非特异扩增。
[0140]
表8
[0141][0142]
定量限结果如表9所示，结果表明对定量限mr4.5样本进行检测，检出率为100%，cv为4.02%；图5为定量限样本检测结果1d图，结果显示阴阳性液滴区分良好；图6为定量限样本检测结果2d图，结果显示阴阳性区分良好，无非特异扩增。
[0143]
表9
[0144][0145]
检出限结果如表10所示，结果表明对检出限mr4.7样本进行检测，检出率为100%，cv为4.02%。
[0146]
表10
[0147][0148]
特异性结果如表11所示，结果表明对除p210融合基因外的p190、p230融合基因均特异。
[0149]
表11
[0150][0151]
空白限（lob）结果如表12所示，结果表明空白限为0，图6为空白限检测结果1d图，结果表明阴阳性液滴区分良好，无非特异扩增。
[0152]
表12
[0153][0154]
对75份临床样本进行一致性分析，10份mpn样本作为干扰组（临近病），65份cml样本，合计75份结果，如表13所示，其中编号i3882、i3521、i3513、i3601样本为qpcr检出为阴性，第三方数字pcr检测平台与思纳福均检测到阳性，说明数字pcr检测灵敏度方面具有优势。
[0155]
表13
[0156][0157]
综合以上结果，本发明方法：线性满足|r| ≥0.980，线性关系良好；检出限单孔检测能达到mr4.7，定量限单孔检测能达到mr4.5，实测值（mr）的变异系数≤10%；空白限结果为0。对临床样本p230、p190检测结果均无交叉反应；说明本发明设计特定的引物探针同时结合数字pcr，整体协同，检测bcr-abl1（p210）融合基因灵敏度高、特异性强，针对mrd样本的检测更具优势。
[0158]
综上所述，本发明设计特定序列的引物探针组合，协同配合，能够实现对bcr-abl1（p210)两种分型b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）的快速、高特异性、高灵敏度地扩增；基于特定引物探针组合结合数字pcr，精准控制反应体系和反应条件，整体协同，进一步开发操作简便、快速、高特异性和灵敏度地bcr-abl1融合基因检测方法。
[0159]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括1对引物对和2条探针；所述引物对的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.2所示的序列；所述探针的核酸序列包括seq id no.3-seq id no.4所示的序列。2.根据权利要求1所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。3.根据权利要求2所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括6-fam、vic、cy5或rox中任意一种；所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、mgb或tamra中任意一种。4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括1对内参引物对和1条内参探针；所述内参引物对的核酸序列包括seq id no.5-seq id no.6所示的序列；所述内参探针的核酸序列包括seq id no.7所示的序列。5.权利要求1-4任一项所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合在制备检测bcr-abl1融合基因的产品中的应用。6.一种检测bcr-abl1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合。7.根据权利要求6所述的检测bcr-abl1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应液；所述pcr反应液包括逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dutp。8.权利要求1-4任一项所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合在检测bcr-abl1融合基因中的应用。9.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测bcr-abl1融合基因的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样本中rna为模板，与权利要求1-4任一项所述的用于检测bcr-abl1融合基因的引物探针组合以及pcr反应液混合，进行数字pcr，根据数字pcr结果定量计算bcr-abl1融合基因；所述pcr反应液包括逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dutp。10.根据权利要求9所述的检测bcr-abl1融合基因的方法，其特征在于，所述数字pcr的程序包括：逆转录及预变性：50~55℃，900~1800 s；酶激活：95~98℃，180~300 s；变性：94~96℃，10~30 s，5~10个循环；退火、延伸：55~60℃，10~60 s；变性：94~96℃，10~30 s，35~40个循环；退火、延伸：58~63℃，10~60 s；终延伸及荧光采集：70~72℃，120~300s。

技术总结
本发明公开了一种用于检测BCR-ABL1融合基因的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括1对引物对和2条探针；所述引物对的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的序列；所述探针的核酸序列包括SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的序列。本发明针对BCR-ABL1（p210)两种分型（b2a2（e13a2）和b3a2（e14a2）设计特定序列的扩增引物和探针，巧妙配合，可实现高特异性和灵敏的扩增，可结合数字PCR用于快速、高特异性和灵敏度地检测BCR-ABL1融合基因。因。因。


技术研发人员：李修春 杨康 李海龙
受保护的技术使用者：思纳福（北京）医疗科技有限公司
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/9/20