一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是引起食物中毒的主要病原菌之一。由金葡菌引起的胃肠炎，发病急，症状严重，可以导致患者脱水、电解质紊乱甚至休克死亡。由该菌引起的食物中毒的比例，在我国仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。此外，金葡菌也是临床中最常见的致病菌，可导致全身性和局部性疾病，如呼吸系统感染、泌尿系统感染、肠道感染、败血症、创伤性感染、皮肤局部性化脓性感染，特别是耐甲氧西林金葡菌，对多种抗菌药物有较高的耐药率，给疾病的治疗和医院感染的防控带来很大的困难。研究表明，meca基因是导致金葡菌对甲氧西林耐药的主要原因。
3.meca基因作为一种抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)，其生物学特征使其可在环境中长期存在，可通过垂直基因转移与水平基因转移在同种或异种间迁移传播。args作为与细菌耐药性有着直接联系的新型污染物在诸多环境广泛存在，进一步加剧抗生素污染，成为一重大公共卫生问题。实现对args的准确快速、简便、可视化检测具有重大意义。而现有args及抗生素耐药菌检测主要通过传统平板分离、全基因组测序、高通量pcr、dna微阵列等手段实现，存在检测周期长、成本高昂、操作难度大、数据分析复杂、设备要求高等不同的问题，仍未有一种方法可以实现高特异性且适合现场分析的方式。
4.而目前基于crispr-cas12a的生物传感器分析技术在抗生素抗性基因及抗生素耐药性菌的定性和定量分析方面具有巨大的潜力。crispr-cas12a可以有效识别特定核酸靶标的存在和序列的微小变化，这对于核酸鉴定和检测尤为重要。doudna课题组报告了一种基于crispr/cpf1结合重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification，rpa)的检测方法，命名为“detectr”，成功准确鉴定了两种人乳头瘤病毒亚型hpv16和hpv18。证明crispr-cas12检测平台可以开发成为抗生素抗性菌检测的一种新的策略。
5.因此可以利用对meca基因的检测，提供一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的crrna及试剂盒。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对上述问题，提供一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒。试剂盒中的crrna能够特异性识别耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的meca基因，能与靶标dna的识别区域杂交，从而激发crispr-cas12a系统的顺式/反式剪切活性，能够灵敏地输出可视化结果。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，所述试剂盒，包括以下组分：cas12a、crrna、reporter-fq、mg
2+
、基因组dna；
所述crrna核苷酸序列如a1-a6所示序列：名称序列a1uaauuucuacuaaguguagauguucugcaguaccggauuuga2uaauuucuacuaaguguagauauaagaucuauaaauaucuua3uaauuucuacuaaguguagauaaaugaaacaaggagaaacua4uaauuucuacuaaguguagauaugccuuuuucaaauuucuua5uaauuucuacuaaguguagauuagauaaugaaauauuauuaa6uaauuucuacuaaguguagauaaaaaggcaugaaaaaacuaggu所述reporter-fq如b1-b5所示序列：名称序列b15
’‑
fam-aaaaaaaa-bhq1-3’b25
’‑
fam-aaaaaaaaaa-bhq1-3’b35
’‑
fam-aaaaaaaaaaaa-bhq1-3’b45
’‑
fam-tttttttttttt-bhq1-3’b55
’‑
fam-ttatt-bhq1-3’一种使用权利要求1所述试剂盒检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法：包括如下步骤：(1)获取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组dna并定量；(2)将cas12a与crrna孵育结合后加入含reporter-fq、mg
2+
、基因组dna的反应管中反应；(3)反应后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。
8.进一步的，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组dna包括聚合酶链式反应、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增反应(rpa)、环介导等温扩增反应、链置换扩增技术任意一种扩增后所得的扩增产物。
9.进一步的，所述含reporter-fq、mg
2+
、基因组dna的反应管中包含rpa正反向引物，所述rpa正反向引物序列如下：mec-rpa-f：tttgctagagtagcactcgaattaggcagt；mec-rpa-r：tatttcaccttgtccgtaacctgaatcagc。
10.进一步的，所述crrna为a1-a6中任意一种或两种；所述reporter-fq为b1-b5中的任意一种。
11.本发明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的技术原理：cas12a是一种ⅱ类
ⅴ
型crispr效应蛋白。crispr/cas12a系统通过cas12a与crrna形成二元复合体，识别能够与crrna杂交的靶标双链dna，并对其进行切割。与此同时，cas12a非特异切割体系内其他单链dna(ssdna)的侧切活性被激活。reporter-fq是一段短dna单链。其5’端修饰有fam荧光基团，3’端修饰有bhq1荧光猝灭基团，因此在此状态下并不显荧光。
12.本检测方法利用crispr/cas12a系统对耐甲氧西林金葡菌进行检测，同时在体系中加入reporter-fq作为报告子。当cas12a与crrna结合并识别到靶标dna序列时，cas12a的侧切活性激活，切割体系中的reporter-fq。fam基团因与荧光猝灭基团分离，可显荧光。观
察样品检测结果的荧光强度，即可判断检测样品中是否含有耐甲氧西林金葡菌。
13.rpa扩增技术可利用针对特定基因序列的引物，在37～42℃的恒定温度下，1h内即可实现目标序列的指数扩增，起到信号放大的作用，可提高检测体系的灵敏度，同时也便于现场检测环境中应用。
14.本发明的优点在于：本发明的试剂盒利用crispr/cas12a的高度特异性，能够特异性识别耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的meca基因，并结合rpa的信号放大作用，实现对目标物的精确检测。整个体系能于一个反应管中进行rpa扩增，在37℃的常温环境下1h内完成检测，不受非特异扩增产物的影响，仅对特异性产物输出信号，背景稳定，抗离子干扰能力强，可避免气溶胶污染产生的假阳性问题。
15.该试剂盒操作简单、反应速度快、检测灵敏、性能稳定的特点，检测结果具有高序列特异性，结合简单紫外/蓝光照明设备适合现场检测，该方法能够通过简单体系混合，与变温/恒温扩增方法结合，并可以获得更高的灵敏度。
附图说明:
图1实施例1单向crrna活性检测结果。n为：空白对照组，p为：样本检测结果。
17.图2实施例2单向crrna活性检测结果。n为：空白对照组，p为：样本检测结果。
18.图3实施例3双向crrna活性检测结果。n为：空白对照组，p为：样本检测结果。
19.图4实施例4双向crrna活性检测结果。n为：空白对照组，p为：样本检测结果。
20.图5实施例5实际样本检测结果。ntc：空白对照组；s1、s2、s3、s4、s5为各检测样本的平行重复组。
具体实施方式
21.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
22.下述实施例中的信号输出方法仅为了阐明本发明，可以使用紫外光、pcr等更多方法进行信号检测。
23.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
25.下述实施例中crrna核苷酸序列如a1-a6所示：名称序列a1uaauuucuacuaaguguagauguucugcaguaccggauuuga2uaauuucuacuaaguguagauauaagaucuauaaauaucuua3uaauuucuacuaaguguagauaaaugaaacaaggagaaacua4uaauuucuacuaaguguagauaugccuuuuucaaauuucuua5uaauuucuacuaaguguagauuagauaaugaaauauuauuaa6uaauuucuacuaaguguagauaaaaaggcaugaaaaaacuaggu下述实施例中所述reporter-fq如b1-b5所示：
名称序列b15
’‑
fam-aaaaaaaa-bhq1-3’b25
’‑
fam-aaaaaaaaaa-bhq1-3’b35
’‑
fam-aaaaaaaaaaaa-bhq1-3b45
’‑
fam-tttttttttttt-bhq1-3’b55
’‑
fam-ttatt-bhq1-3’实施例1单向crrna用于crispr-cas12a系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测：步骤1：取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌液接种至无菌牛奶中，然后提取基因组dna并定量；步骤2：向反应管中加入2μm reporter-fq b4(5
’‑
fam-tttttttttttt-bhq1-3’)、14mm mg
2+
、20nm步骤1中提取的基因组dna。
26.步骤3：cas12a与a4crrna(uaauuucuacuaaguguagauaugccuuuuucaaauuucuu)在室温下放置10min；加入至步骤2反应管中；步骤4：37℃反应1h后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。结果见图1。
27.上述cas12a参考文献janice s.chen et al.，crispr-cas 12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded dnase activity.science360，436-439(2018)的方法制备获得。
28.实施例2单向crrna用于crispr-cas12a系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测：步骤1：取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌液接种至无菌牛奶中，然后提取基因组dna并定量；步骤2：向反应管中加入2μm reporter-fq b3(5
’‑
fam-aaaaaaaaaaaa-bhq1-3’)、14mm mg
2+
、20nm步骤1中提取的基因组dna。
29.步骤3：cas12a与a6crrna(uaauuucuacuaaguguagauaaaaaggcaugaaaaaacuaggu)在室温下放置10min；加入至步骤2反应管中；步骤4：37℃反应1h后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。结果见图2。
30.实施例3双向crrna用于crispr-cas12a系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。
31.步骤1：取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌液接种至无菌牛奶中，提取基因组dna并定量；步骤2：向rpa试剂盒冻干粉管中加入复水剂和正反向引物充分溶解冻干粉后向反应管中加入2μm reporter-fq b1(5
’‑
fam-aaaaaaaa-bhq1-3’)、14mm mg
2+
、20nm步骤1中提取的基因组dna。
32.所用rpa正反向引物可为如下所述序列：名称序列mec-rpa-ftttgctagagtagcactcgaattaggcagtmec-rpa-rtatttcaccttgtccgtaacctgaatcagc步骤3：cas12a与a2(uaauuucuacuaaguguagauauaagaucuauaaauaucuu)、a3(uaauu
ucuacuaaguguagauaaaugaaacaaggagaaacu)两条crrna在室温下放置10min，加入至步骤2反应管中；步骤4：39℃反应1h后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。结果见图3。
33.实施例4双向crrna用于crispr-cas12a系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。
34.步骤1：取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌液接种至无菌牛奶中，提取基因组dna并定量；步骤2：向rpa试剂盒冻干粉管中加入复水剂和正反向引物充分溶解冻干粉后向反应管中加入2μm reporter-fq b2(5
’‑
fam-aaaaaaaaaa-bhq1-3’)、14mm mg
2+
、20nm步骤1中提取的基因组dna。
35.所用rpa正反向引物可为如下所述序列：名称序列mec-rpa-ftttgctagagtagcactcgaattaggcagtmec-rpa-rtatttcaccttgtccgtaacctgaatcagc步骤3：cas12a与a1(uaauuucuacuaaguguagauguucugcaguaccggauuug)、a5(uaauuucuacuaaguguagauuagauaaugaaauauuauua)两条crrna在室温下放置10min，加入至步骤2反应管中；步骤4：39℃反应1h后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。结果见图4。
36.实施例5crrna用于crispr-cas12a系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的实际样品检测。
37.步骤1：取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活化后平板划线过夜培养，次日挑取平板上的单菌落至lb肉汤37℃，250rpm液体培养6h，将培养菌液用无菌lb肉汤培养基10倍稀释，平板培养计数。然后分别取不同浓度的稀释液按1∶10的比例接种到无菌牛奶中，各组分别为8.2
×
105cfu/ml、8.2
×
104cfu/ml、8.2
×
103cfu/ml、8.2
×
102cfu/ml、8.2
×
101cfu/ml、8.2
×
100cfu/ml。采用粗提法提取各染菌牛奶中的基因组dna。
38.步骤2：向rpa试剂盒冻干粉管中加入复水剂和正反向引物充分溶解冻干粉后，各组均向反应管中加入2μm reporter-fq b5(5
’‑
fam-ttatt-bhq1-3’)、14mm mg
2+
、2μl步骤1中提取的基因组dna。
39.所用rpa正反向引物可为如下所述序列：名称序列mec-rpa-ftttgctagagtagcactcgaattaggcagtmec-rpa-rtatttcaccttgtccgtaacctgaatcagc步骤3：cas12a与所述a6 crrna(uaauuucuacuaaguguagauaaaaaggcaugaaaaaacuaggu)在室温下放置10min，加入至步骤2各组反应管中；步骤4：39℃反应1h后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。结果见图5。

技术特征：
1.一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒，包括以下组分：cas12a、crrna、reporter-fq、mg
2+
、基因组dna；所述crrna核苷酸序列包括如a1-a6所示序列：a1：uaauuucuacuaaguguagauguucugcaguaccggauuug；a2：uaauuucuacuaaguguagauauaagaucuauaaauaucuu；a3：uaauuucuacuaaguguagauaaaugaaacaaggagaaacu；a4：uaauuucuacuaaguguagauaugccuuuuucaaauuucuu；a5：uaauuucuacuaaguguagauuagauaaugaaauauuauua；a6：uaauuucuacuaaguguagauaaaaaggcaugaaaaaacuaggu；所述reporter-fq序列包括如b1-b5所示序列：b1：5
’‑
fam-aaaaaaaa-bhq1-3’；b2：5
’‑
fam-aaaaaaaaaa-bhq1-3’；b3：5
’‑
fam-aaaaaaaaaaaa-bhq1-3’；b4：5
’‑
fam-tttttttttttt-bhq1-3’；b5：5
’‑
fam-ttatt-bhq1-3’。2.一种使用权利要求1所述试剂盒检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1) 获取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组dna并定量；(2) 将cas12a与crrna孵育结合后加入含reporter-fq、mg
2+
、基因组dna的反应管中反应；(3) 反应后于蓝光切胶仪下查看荧光情况。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组dna包括聚合酶链式反应、滚环扩增、连接酶链反应、环介导等温扩增反应、链置换扩增技术任意一种扩增后所得的扩增产物。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含reporter-fq、mg
2+
、基因组dna的反应管中包含rpa正反向引物，所述rpa正反向引物序列如下：mec-rpa-f：tttgctagagtagcactcgaattaggcagt；mec-rpa-r：tatttcaccttgtccgtaacctgaatcagc。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述crrna为a1-a6中任意一种或两种；所述reporter-fq为b1-b5中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒，包括Cas12a、crRNA、Reporter-FQ、Mg


技术研发人员：张芳 汪诗雨 黄淑琴 郑昕怡 钟烨 邱银鸿 涂嘉怡 潘南 李小晶 翁齐彪
受保护的技术使用者：长乐聚泉食品有限公司
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/9/20