姜黄素在增强替加环素抗菌作用中的新用途

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及姜黄素作为替加环素增效剂新用途。


背景技术：

2.替加环素(tigecycline)属于新一代的四环素类抗生素，是甘氨酰环素类抗生素，于2005年在美国批准上市，我国于2012年初批准上市。替加环素的主要作用机制与其他四环素类抗生素相似，都是通过与细菌核糖体30s亚基上的螺旋区(h34)可逆结合，阻止trna的进入，而抑制细菌蛋白质翻译(即肽链的延长)，最终起到阻断细菌蛋白质合成，限制细菌生长的作用。然而，由于替加环素的d环c9位添加了n-烷基-甘氨酰氨基侧链，使其与核糖体的结合能力增强，抗菌谱得到扩展，其抑制蛋白质合成的能力是其它四环素类药物的3～20倍。替加环素能够有效克服四环素类抗生素耐药性的主要机制，如四环素特异性外排泵tet(a)和核糖体保护蛋白tet(m)等。
3.姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄的干燥根茎中提取的一种天然有效成分，毒性低，耐受性好。姜黄素的分子式为c21h206，分子量为368.37g/mol，熔点为183℃，呈结晶状，是植物界很少的具有二酮的色素，姜黄素分子中含有多个双键。姜黄素的结构式如下所示：
[0004][0005]
近几年，随着替加环素使用量的增加，以及其他抗生素滥用情况的发生，导致替加环素治疗效果相对下降，出现了替加环素耐药。根据《eucast欧盟药敏试验标准》，替加环素对肠杆菌类细菌的mic值为4μg/ml时，细菌既表现出耐药性。目前，替加环素耐药性呈显著上升趋势，因此，通过增效剂减少其耐药性发生具有重要的临床应用意义，至今没有以姜黄素作为替加环素的增效剂的报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明目的是提供一种姜黄素化合物在增效替加环素抗菌作用中的新用途。所述姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015-4μg/ml。在制备组合物或复方制剂时，姜黄素用于增效替加环素抗菌作用时，姜黄素与替加环素用量比例在8：1-8533:1之间。
[0007]
优选的，替加环素的用量为0.5-2μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0008]
优选的，替加环素的用量为0.015-0.06μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0009]
优选的，替加环素的用量为1-4μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0010]
本发明另一目的是提供一种姜黄素在增效替加环素抗大肠杆菌作用中的新用途。所述姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015-4μg/ml。在制备组合物或复方制剂时，姜黄素用于增效替加环素抗菌作用时，姜黄素与替加环素用量比例在8：1-8533:1之间。
[0011]
优选的，替加环素的用量为0.5-2μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0012]
优选的，替加环素的用量为0.015-0.06μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0013]
优选的，替加环素的用量为1-4μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。
[0014]
本发明另一目的是提供一种姜黄素在增效替加环素抗大肠杆菌用途的抗菌试验方法，或目标物测试方法，所述方法包括如下步骤：
[0015]
s1:将姜黄素与替加环素用溶剂进行溶解；
[0016]
s2:姜黄素与替加环素按比例混合，得到组合物；
[0017]
s3:将步骤s2组合物用于mic的测试，fici的测试，或时间-杀菌曲线试验，或目标物的测试。
[0018]
步骤s1所述的溶剂包括二甲基亚砜或去离子水。
[0019]
步骤s2所述姜黄素与替加环素比例为8：1
ꢀ‑
8533:1。优选的，姜黄素与替加环素比例为8：1
ꢀ‑
2133:1。
[0020]
步骤s3所述姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015-4μg/ml。优选的，替加环素的用量为0.5-2μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。优选的，替加环素的用量为0.015-0.06μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合。优选的，替加环素的用量为1-4μg/ml与姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml的组合；
[0021]
本文中术语“协同作用”是指两药合用的效应大于单药效应的代数和。
[0022]
本文中术语“相加作用”是指两药合用的效应等于它们分别作用的代数和。
[0023]
本文中术语“拮抗作用”是指两药合用的效应小于它们分别作用的总和。
[0024]
本发明具有以下的有益效果是：
[0025]
(1)姜黄素的用量为32-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015-4μg/ml能够明显增强替加环素对大肠的抗菌活性；(2)姜黄素与替加环素联用均表现出显著的增效作用，fic指数为0.09375～0.375(均小于0.5)，即两者联用呈现显著的协同作用；(3)可以有效减低替加环素的使用量，替加环素单独使用是姜黄素与替加环素联合使用用量的267-8倍；(4)姜黄素与替加环素联合使用可以起到协同逆转耐药的作用，fic指数为0.09375～0.375，联合用药在12h后表现出明显的杀菌作用，在24h将细菌全部杀灭。24h时，与tig单药相比，两个联合用药组的菌落数减少均大于2log10cfu/ml。
附图说明
[0026]
图1为姜黄素与替加环素对菌株ctr2的时间杀菌曲线。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028]
实施例1：mic测试
[0029]
材料和方法
[0030]
1.试药
[0031]
姜黄素(cur)：北京索莱宝科技有限公司，纯度:95％
[0032]
替加环素(tig)：北京索莱宝科技有限公司，纯度:98％
[0033]
姜黄素用二甲基亚砜配成5120μg/ml的浓度。替加环素用去离子水配成1280μg/ml的浓度。受试药物-20℃保存。试验前，将药物贮存液取出置室温融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
[0034]
2.菌株
[0035]
临床上分离大肠杆菌株：大肠杆菌ctr2、ctr4、ce34由河南农业大学药理实验室提供。大肠杆菌在麦康凯培养基上划板活化，37℃培养16～18h，4℃保存备用。
[0036]
3.培养液
[0037]
lb肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司生产，按照本品说明书配制1000毫升，121℃高压灭菌15分钟后4℃保存备用。ss琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司生产，按照本品说明书配制1000毫升，加热煮沸充分溶解灭菌，凉至60度倾注灭菌平皿4℃保存备用。mhb肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司生产，按照本品说明书配制1000毫升，121℃高压灭菌15分钟后4℃保存备用。
[0038]
4.仪器
[0039]
高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；ab204-n型电子分析天平(梅特勒-托利仪器上海有限公司)；hzq-r空气浴振荡器(北京六一仪器厂)；dh-600电热恒温培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；dhg-9140a型真空干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司)；sw-cj-jc超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。
[0040]
5.菌液制备
[0041]
从4℃保存的麦康凯培养基上挑取大肠杆菌单菌落，接种至5ml lb肉汤培养基，于37℃以180rpm振荡培养活化，使细菌处于指数生长期后期。取该菌液至mhb肉汤培养基中，使原菌液浓度稀释到105cfu/ml。在菌悬液中加入相应浓度的姜黄素备用。使姜黄素菌悬液中的最终浓度分别为：32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml。
[0042]
6.药敏板制备
[0043]
使用步骤5中的菌悬液进行药物敏感性试验。取无菌96孔反应板，于第一排第1号孔加入新鲜配制的含有姜黄素的菌悬液126μl和1280μg/ml的替加环素14μl；2-12号孔加入新鲜配制的含有姜黄素的菌悬液70μl；第二排1-7号孔也加入新鲜配制的含有姜黄素的菌悬液70μl，8号孔加入mhb肉汤70μl作空白对照。对第一排1-12号和第二排1-6孔进行顺延倍比稀释，使第一排1-12号孔和第二排1-6号孔的最终替加环素的浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008、0.004、0.002、0.001μg/ml；第二排7号孔为不含药物的mhb菌悬液，作为阴性对照；8号孔为不含药物的菌液，作为阳性对照。药敏板于37℃培养16-20h。
[0044]
7.mic值的判定
[0045]
含菌的96孔板在37℃培养16-20h后，读取mic(最小抑菌浓度)结果。药物mic值(最小抑菌浓度)为96孔板中浑浊孔的前一个澄清透明孔的药物浓度。上述实验均平行操作3次，当mic值能准确重复时才被接受；当mic值相差一个浓度以上时，则需要新试验，直到符合要求为止，结果见表1。
[0046]
表1姜黄素与替加环素联用对受试菌株的mic
[0047][0048]
注：1/2mic姜黄素：姜黄素加入量为128μg/ml；1/4mic姜黄素：姜黄素加入量为64μg/ml；1/8mic姜黄素：姜黄素加入量为32μg/ml
[0049]
结果表明，替加环素对菌株ctr2、ctr4、ce34的mic值分别为16、4、32μg/ml，姜黄素对菌株ctr2、ctr4、ce34的mic值均为256μg/ml，加入1/2mic(128μg/ml)，1/4mic(64μg/ml)，1/8mic(32μg/ml)姜黄素时，替加环素对ctr2的mic分别为0.5、1、2μg/ml；对ctr4的mic分别为0.015、0.03、0.06μg/ml；对ce34的mic分别为1、2、4μg/ml。
[0050]
与单独使用替加环素时的mic值相比，当分别加入128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的姜黄素时，替加环素对菌株ctr2的mic分别下降32、16、8倍；替加环素对菌株ctr4的mic分别下降267、133、67倍；替加环素对菌株ce34的mic分别下降32、16、8倍。
[0051]
结果表明，姜黄素的浓度在32～128μg/ml时，能够明显增强替加环素对大肠杆菌ctr2、ctr4、ce34的抗菌活性。替加环素单独使用是姜黄素与替加环素联合使用用量的267-8倍。
[0052]
实施例2：fici的测试
[0053]
材料和方法
[0054]
1.试药：
[0055]
同实施例1。
[0056]
2.菌株
[0057]
同实施例1。
[0058]
3.培养液
[0059]
同实施例1。
[0060]
4.仪器
[0061]
同实施例1。
[0062]
5.菌液制备
[0063]
同实施例1。
[0064]
6.药敏板制备
[0065]
在微量肉汤稀释法的基础上，我们获得了cur和tig单药的mic值，选择cur和tig 1
倍～1/1024倍mic的浓度置于药敏棋盘中。具体来说，将100μl的mhb分配到8
×
8的96孔板中，然后将tig和cur分别沿横坐标和纵坐标稀释2倍，同时作cur和tig单药mic以及阴性和阳性对照。(将96孔板置于恒温培养箱中，37℃，16～18h，静置培养，观察并记录结果。试验进行三次重复。
[0066]
以部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)作为棋盘药敏试验判定标准进行评价。两个化合物a和b的fici由以下公式定义：
[0067]
fici＝fica+ficb＝mic
ab
/mica+mic
ba
/micb[0068]
mica是化合物a单独的mic，mic
ab
是联合用药时a的mic，micb是化合物b单独的mic，mic
ba
是联合用药时b的mic。fic＜0.5，为协同作用；0.5≤fic≤1，为相加作用；1＜fic≤2，为无关作用；fic＞2，为拮抗作用。结果见表2。
[0069]
表2姜黄素与替加环素的联合抗菌作用
[0070][0071]
结果表明，姜黄素单独使用对受测菌株的抑菌作用微弱，与tig联用均表现出对tig的增效作用，fic指数为0.09375～0.375，均＜0.5，即两者联用均呈现协同作用。
[0072]
实施例3：时间杀菌曲线测定
[0073]
材料和方法
[0074]
1.试药：
[0075]
同实施例1。
[0076]
2.菌株
[0077]
同实施例1。
[0078]
3.培养液
[0079]
同实施例1。
[0080]
4.仪器
[0081]
同实施例1。
[0082]
5.菌液制备
[0083]
同实施例1。
[0084]
6.时间-杀菌曲线
[0085]
选择大肠杆菌ctr2进行时间-杀菌曲线试验。将单菌落接种于新鲜的lb肉汤中，置于37℃，180r/min的摇床中，振荡培养过夜；再将菌液1:100转接于10ml新鲜的lb肉汤中，分为5个试验组：
[0086]
a组：control；
[0087]
b组：1/2mic tig；
[0088]
c组：1/2mic cur；
[0089]
d组：1/2mic cur+1/2mic tig；
[0090]
e组：1/4mic cur+1/2mic tig。
[0091]
分组后置于37℃，180r/min振荡培养，在0h、2h、4h、8h、12h和24h时分别吸取菌悬液100μl，用pbs缓冲液对100μl菌悬液进行10倍比系列稀释后，取100μl稀释液涂布于lb琼脂平板上，37℃静置培养16～18h，最后对琼脂平板上的菌落进行计数，以时间为横坐标，log
10
cfu/ml为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线，试验进行三次重复。
[0092]
结果判定：与单药相比，联合用药组的菌落数减少≥2log
10
cfu/ml时，定义为协同作用，结果如图1所示。实验结果表明，单药1/2mic cur对菌株的杀菌曲线和空白对照(control)几乎一致，表明cur的抑菌作用较弱；单药1/2mic tig最初对菌株表现出轻微抑菌作用，但随后生长趋势与空白对照和1/2mic cur保持一致；1/2mic cur或1/4mic cur与1/2mic tig联合的杀菌曲线一致，即在12h后表现出明显的杀菌作用，在24h将细菌全部杀灭。24h时，与tig单药相比，两个联合用药组的菌落数减少均大于2log
10
cfu/ml，即两药联合为协同作用。时间-杀菌曲线结果与联合药敏结果基本一致，即cur单用的抑菌效果较弱，1/2mic cur或1/4mic cur与tig联用均能显著降低tig对耐药菌的mic值，表现出良好的协同逆转耐药作用。
[0093]
上述实验表明，姜黄素的浓度在32～128μg/ml时，能够明显增强替加环素对大肠杆菌ctr2、ctr4、ce34的抗菌活性。姜黄素与替加环素联用均表现出显著的增效作用，fic指数为0.09375～0.375，均＜0.5，即两者联用均呈现显著的协同作用。时间-杀菌曲线结果显示，联合用药在12h后表现出明显的杀菌作用，在24h将细菌全部杀灭，与联合药敏结果基本一致，即cur单用的抑菌效果较弱，1/2mic cur或1/4mic cur与tig联用均能显著降低tig对耐药菌的mic值，表现出良好的协同逆转耐药作用。
[0094]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.姜黄素在制备替加环素对大肠杆菌的抗菌作用增效剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于,所述姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015μg/ml-4μg/ml。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于,姜黄素与替加环素用量比例在8：1-8533:1。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于,姜黄素与替加环素比例为8：1-2133:1。5.一种替加环素复方制剂，其特征在于，包括姜黄素，所述姜黄素与替加环素用量比例在8：1-8533:1。6.一种姜黄素在增效替加环素抗大肠杆菌用途的抗菌试验方法，或目标物测试方法，所述方法包括如下步骤：s1:将姜黄素与替加环素用溶剂进行溶解；s2:姜黄素与替加环素按比例混合，得到组合物；s3:将步骤s2组合物用于mic的测试，或fici的测试，或时间-杀菌曲线试验，或目标物的测试。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于,所述步骤s2姜黄素与替加环素比例为8：1-8533:1。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于,所述步骤s1的溶剂包括二甲基亚砜或去离子水。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于,所述步骤s3姜黄素的用量为32μg/ml-128μg/ml时,替加环素的用量为0.015-4μg/ml。

技术总结
本发明涉及姜黄素在增效替加环素抗菌作用中的新用途。所述姜黄素的用量为32μg/mL-128μg/mL时,替加环素的用量为0.015-4μg/mL。在制备组合物或复方制剂时，姜黄素用于增效四环素类抗生素替加环素的抗菌作用时，姜黄素与替加环素用量比例在8：1-8533:1之间。本发明可以恢复耐药细菌对替加环素的敏感性，可降低替加环素的用药剂量，提高抗菌治疗效果，降低毒副作用，具有重要的临床应用价值。具有重要的临床应用价值。具有重要的临床应用价值。


技术研发人员：贺丹丹 胡功政 潘玉善 苑丽
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/20