一种景天三七内生天蓝黄链霉菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种景天三七内生天蓝黄链霉菌及其应用及其应用。


背景技术：

2.景天三七(sdeum aizoon l.)为景天科景天属植物，又名“养心草”、“土三七”，是中国传统的药食两用植物，全年可采集，全草或根均可入药或食用。景天三七性平，味甘微酸，归心、肝经，具有散瘀止痛、凉血止血、消炎及安神等功效。其含有黄酮类、三萜类、多糖类等多种有效活性成分，其中黄酮类物质是景天三七中一类含量丰富且种类多样的重要天然活性成分，常作为药材质量控制指标。黄酮类物质具有明确广泛的药理作用，如抗氧化、抗胃溃疡、神经保护、抗心肌缺血、降血压、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。近年来，由于其易于栽培种植，适应环境能力强，景天三七已被大量种植，广泛分布于我国东北、西北、华北及长江流域各地区。景天三七因其较高的营养价值，已被开发成为一种新兴的保健蔬菜。随着人们生活水平的提高，养生保健意识越来越强，景天三七在制药、保健食品等领域的需求在不断扩增，人工种植是满足其需求量增加的有效途径。但目前人工种植景天三七存在滥用化肥、农药等现象，导致人工种植的景天三七生长年限缩短，品质变差。如何合理减少化肥的使用，找到绿色、生态的促进景天三七生长，提高其有效活性成分方式，对保证景天三七药材的质量具有重要意义。
3.植物内生菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在健康植物组织或器官内，并对宿主植物没有引起明显病害症状的一类微生物群。植物内生菌作为一类重要的微生物资源，在对植物的生长发育、活性成分的积累、抗逆性的提高等方面具有重要的促进作用。景天三七植物内部寄居着大量与其生长发育密切相关的微生物类群，影响着其营养吸收、免疫调节、抗病害等各方面的能力。因此通过施加具有提质作用的有益内生菌，改善景天三七根际微生态环境，提高其药材的质量，这将在保障其药材的有效性、安全性方面具有巨大的应用潜力。
4.目前人工种植景天三七主要是依赖传统化肥来促进其生长，一方面持续使用化肥对土壤状态会产生持续的影响，同时对周围环境生态也会产生影响，目前并无人工种植景天三七使用菌种提高产量，缩短生长周期的记载。


技术实现要素：

5.本发明的目的:针对现有技术的不足之处，提供一种景天三七内生天蓝黄链霉菌及其应用及其应用，能够有效提高产量，缩短生长周期，少用或者不用化肥，提高景天三七生长品质，能够有效促进景天三七总黄酮和总三萜积累中的应用。
6.为实现上述目的，本发明的一种景天三七内生天蓝黄链霉菌，所述景天三七内生天蓝黄链霉菌的分类明命名为天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号
院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：mep0301，保藏编号为：cgmccno.25778，保藏日期为2022年9月23日。
7.进一步，其应用促进景天三七中总黄酮及总三萜含量的提高。
8.一种制备景天三七内生天蓝黄链霉菌菌剂的方法，将所述天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)进行如下处理：
9.将菌株接种于新鲜的高氏一号液体培养基中，于28℃摇床，200rpm/min培养5d，活化菌株；
10.按1％的比例将已活化好菌液转接于高氏一号液体培养基中，28℃，200rpm/min摇床培养5d，
11.离心收集菌体，用无菌水洗涤收集菌体2次，再次离心收集菌体，并用无菌水将菌体重悬，调整菌液浓度为od
600
＝0.5。
12.进一步，用菌液对景天三七植株进行灌根处理，每株苗灌根1ml，从而促进景天三七总黄酮及总三萜含量的提高。
13.进一步，所述菌剂为微生物肥料。
14.一种组合物，包含景天三七内生天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)。
15.本发明的菌株mep0301是从采自徐州沛县的野生景天三七根部采用内生细菌分离纯化技术分离获得的，经分子鉴定表明其为天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)，将其编号为mep0301。具体分离纯化方法如下：
16.1)取采自徐州沛县的野生景天三七根部作为分菌材料，称取根部1g材料，用流水冲洗20min，将灰尘和砂砾洗净，然后将冲洗过后的样品放置于超声波清洗机中超声清洗30min，进一步清洗根部表面残存灰尘及泥沙。之后在超净工作台内将冲洗后的样本先用75％乙醇浸泡90s，无菌水冲洗1次，然后用2％次氯酸钠浸泡8min，无菌水洗3遍。将表面消毒后的样本放入研钵，加9ml无菌水研磨均匀，并将研磨液用无菌水进行梯度稀释(10-1
、10-2
)，然后将研磨原液及稀释液(10-1
、10-2
)分别涂布于高氏一号固体培养基，并于28℃培养5-7d，直至长出单菌落；
17.2)挑取单菌落于相同的高氏一号平板划线纯化，于28℃培养5-7d；
18.3)重复步骤2)并挑选单菌，直至获得纯培养物。
19.本发明所用的培养基包括：
20.高氏一号液体培养基：kno31g；k2hpo40.5g；mgso4·
7h2o 0.5g；nacl 0.5g；feso4·
7h2o 0.01g；可溶性淀粉20g；蒸馏水1000ml，ph＝7.4-7.6。
21.高氏一号固体培养基：kno31g；k2hpo40.5g；mgso4·
7h2o 0.5g；nacl 0.5g；feso4·
7h2o 0.01g；可溶性淀粉20g；琼脂20g；蒸馏水1000ml，ph＝7.4-7.6。
22.上述培养基均为常规培养基，使用前需进行常规的灭菌。
23.有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
24.(1)本发明分离获得的天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)mep0301能明显提高景天三七中总黄酮及总三萜的含量。该菌株可作为微生物菌肥，用于景天三七的人工种植，提升其药材的质量，保证药材使用的安全性和有效性，同时在一定程度上还可以减轻化肥滥用带来的环境污染问题。
25.(2)本发明的天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)mep0301培养操作过
程简单、遗传稳定、易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
26.本发明从植物内生菌的角度出发，利用景天三七内生菌mep0301有效提高了景天三七次级代谢产物的含量，本发明提供的菌株可作为微生物菌肥，取代或降低传统化肥等肥料的使用，用于人工种植的景天三七，提升人工种植景天三七药材的质量，同时能够减轻化肥滥用带来的环境污染问题。
附图说明
27.图1为本发明所述的菌株mep0301在高氏一号固体培养基上的形态图，a为平板正面图，b为平板反面图；
28.图2为本发明所述的菌株mep0301对景天三七总黄酮积累的影响对比图。
29.图3为本发明所述的菌株mep0301对景天三七总三萜积累的影响。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，帮助更好地理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
31.实施例1：菌株mep0301的分离纯化与鉴定
32.(1)取采自徐州沛县的野生景天三七的根部组织作为分离内生菌的材料，称取根部组织1g，用流水冲洗20min，将灰尘和砂砾洗净，然后将冲洗过后的样品放置于超声波清洗机中超声清洗30min。
33.(2)将清洗后的样本在超净工作台中进行表面消毒处理，先用75％乙醇溶液浸泡消毒90s，无菌水冲洗1次，然后用2％次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗3次，第三次清洗后的无菌水保留，待后续进行可靠性检验，将表面消毒后的样本放在无菌的滤纸上吸干水分待用。
34.(3)将表面消毒后的样本放入无菌研钵中，加入9ml无菌水研磨均匀，并将研磨液用无菌水进行梯度稀释(10-1
、10-2
)，然后取研磨原液及稀释液(10-1
、10-2
)各100μl分别涂布于高氏一号固体培养基，并于28℃培养5-7d，直至长出单菌落，同时对上述步骤(3)中最后一遍清洗的无菌水进行常规的无菌检测，以保证样本表面消毒彻底。
35.(4)挑取高氏一号平板上长出的单菌落，并接种于相同培养基进行划线纯化分离，置于28℃培养5-7d，继续挑取单菌落，重复多次分离纯化培养，直至得到纯培养物为止。
36.(5)将上述步骤(4)中得到的单菌落进行16s rrna基因扩增(常规pcr方法)、测序，测序结果如seq id no.1所示，将测序结果与ncbi数据库进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，比对结果表明菌株mep0301与streptomyces coelicoflavus strain nbrc 15399的相似性为99.86％。并结合形态观察，鉴定菌株mep0301为天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)。
37.所具有的菌落及形态特征和生理生化特征如下：
38.(1)菌株的形态特征
39.菌株在高氏一号固体培养基上生长良好，菌落基内菌丝呈蓝色，气生菌丝呈白色、表面干燥、边缘较整齐(如图1)。
40.(2)菌株的生理生化特征
41.菌株mep0301能利用葡萄糖，水解淀粉、尿素、木糖、明胶，氧化酶反应、v-p反应为阴性，能够解磷，降解纤维素，产吲哚乙酸，产蛋白酶，在12％nacl中生长，14％nacl中不生长，适宜生长温度28℃。
42.实施例2：菌株mep0301促进景天三七总黄酮的积累，如图2所示：
43.(1)菌种活化及菌液制备
44.将菌株mep0301接种于新鲜的高氏一号液体培养基，于28℃摇床，200rpm培养5d，活化菌株；然后按1％的比例将已活化好菌液转接于高氏一号液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养5d后，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，再次离心收集菌体，并用无菌水将菌体重悬，调节菌液浓度为od
600
＝0.5待用。
45.(2)mep0301菌液处理景天三七植株
46.将营养土高温高压灭菌，挑选大小、粗细，生长状态一致的景天三七植株栽种于灭菌后的营养土中，每盆栽种3株植株，共计栽种15盆，放至温室中培养(12h/d光照，25℃)。适应生长14d后，对景天三七盆栽苗进行灌根处理，每株植株灌根上述(1)中mep0301菌液1ml；按相同方式灌根无菌水于植株作为对照组，实验组和对照组各处理7盆景天三七植株，在接种菌液48h后每隔2d各组补充相同体积的无菌水，在接种菌液后的第7天取下各组植株的根部待检测成分。
47.(3)景天三七总黄酮的检测
48.具体检测方法如下：
49.a.取景天三七新鲜根部样品，清洗剪碎后用液氮充分研磨，称取2g于50ml离心管，按料液比为1:25(g/ml)加入80％乙醇，混匀超声提取，35℃，15min。
50.b.取适量超声后的溶液于50ml离心管中，加入1ml 5％nano2溶液混匀，静置6min后，加入1ml 10％al(no3)3溶液摇匀，静置6min，再加入8ml 1mol/lnaoh，用去离子水补至刻度线，混匀后取0.3ml样品溶液，od
510
检测吸光值。
51.c.制作标准曲线：
52.将芦丁标准品烘干到恒重，称取0.012g烘干的标准品于50ml容量瓶，用甲醇定容至刻度线，混匀后取0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0ml芦丁标准品溶液于25ml容量瓶，依次加入6ml去离子水，然后按b步骤进行显色实验，od
510
检测吸光值。
53.以od
510
吸光值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝0.0132x+0.002，r2＝0.9991，说明线性关系良好。基于标准曲线，计算实验组和对照组的总黄酮含量，检测结果如图2所示，ck组的总黄酮含量为16.78
±
0.68mg/g，实验组的总黄酮含量为29.57
±
0.68mg/g，实验组的总黄酮含量约为ck组的1.8倍，结果表明菌株mep0301可有效促进景天三七中总黄酮的积累。
54.实施例3：菌株mep0301促进景天三七总三萜的积累，如图3所示：
55.菌种活化、菌液制备及mep0301菌液处理景天三七植株均同实施例2(实施例2中(1)和(2)步骤)，对景天三七总三萜含量进行检测，具体方法如下：
56.a.取景天三七新鲜根部样品，清洗剪碎后用液氮充分研磨，称取0.2g样品于50ml离心管，加入10ml甲醇混匀，35℃，2h超声提取后放置过夜
57.b.吸取超声后提取液0.1ml于50ml离心管，加入0.2ml香草醛溶液，0.8ml高氯酸溶液，摇晃均匀后70℃水浴锅中加热15min；冷却至室温后，每组吸取0.2ml，加入冰醋酸
5.0ml，od
545
检测吸光值。
58.c.制作标准曲线：
59.称取熊果酸0.02g加入100ml容量瓶，并用甲醇定容至刻度线，混匀；
60.香草醛-冰醋酸标准品：称取5g香草醛粉末于100ml容量瓶，用冰醋酸定容至刻度线后混匀；
61.分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml熊果酸标准品溶液，以1.2ml甲醇为对照组，向其中加入0.2ml香草醛-冰醋酸标准品，0.8ml高氯酸溶液混匀后于70℃水浴锅中水浴加热15min，冷却至室温，再加入5.0ml冰醋酸，od
545
检测吸光值。
62.以od
545
吸光值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝4.0649x+0.0374，r2＝0.9935，表明线性关系良好。根据标准曲线，计算实验组和对照组的总三萜含量，结果如图3所示，检测的ck组总三萜含量为21.9
±
0.78mg/g，实验组总三萜含量为46.6
±
4.57mg/g，结果表明菌株mep0301可显著提高景天三七总三萜的含量。
63.综合以上实施例，本发明提供的菌株mep0301能够有效促进景天三七中总黄酮及总三萜成分的积累，可用于提升人工种植的景天三七的品质，这对保证其药材使用的有效性及安全性具有重要意义。
64.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种景天三七内生天蓝黄链霉菌，其特征在于：所述景天三七内生天蓝黄链霉菌的分类明命名为天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：mep0301，保藏编号为：cgmcc no.25778，保藏日期为2022年9月23日。2.根据权利要求1所述景天三七内生天蓝黄链霉菌的应用，其特征在于：促进景天三七中总黄酮及总三萜含量的提高。3.一种制备景天三七内生天蓝黄链霉菌菌剂的方法，其特征在于，将权利要求1所述天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)进行如下处理：将菌株接种于新鲜的高氏一号液体培养基中，于28℃摇床，200rpm/min培养5d，活化菌株；按1％的比例将已活化好菌液转接于高氏一号液体培养基中，28℃，200rpm/min摇床培养5d，离心收集菌体，用无菌水洗涤收集菌体2次，再次离心收集菌体，并用无菌水将菌体重悬，调整菌液浓度为od
600
＝0.5。4.根据权利要求3所述景天三七内生天蓝黄链霉菌菌剂的应用，其特征在于：用权利要求3所述菌剂对景天三七植株进行灌根处理，每株苗灌根1ml，从而促进景天三七总黄酮及总三萜含量的提高。5.根据权利要求4所述的景天三七内生天蓝黄链霉菌的应用，其特征在于：高氏一号液体培养基：kno31g；k2hpo40.5g；mgso4·
7h2o 0.5g；nacl 0.5g；feso4·
7h2o 0.01g；可溶性淀粉20g；蒸馏水1000ml，ph＝7.4-7.6。6.根据权利要求4所述的景天三七内生天蓝黄链霉菌的应用，其特征在于：高氏一号固体培养基：kno31g；k2hpo40.5g；mgso4·
7h2o 0.5g；nacl 0.5g；feso4·
7h2o 0.01g；可溶性淀粉20g；琼脂20g；蒸馏水1000ml，ph＝7.4-7.6。7.根据权利要求4所述的景天三七内生天蓝黄链霉菌的应用，其特征在于：所述菌剂为微生物肥料。8.一种组合物，包含权利要求1所述的景天三七内生天蓝黄链霉菌(streptomyces coelicoflavus)。

技术总结
本发明公开了一种景天三七内生天蓝黄链霉菌及其应用，属于微生物技术领域。发明涉及的景天三七内生天蓝黄链霉菌(Streptomycescoelicoflavus)，于2022年09月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏名称为：MEP0301，保藏编号为：CGMCCNo.25778。其可显著促进景天三七中总黄酮及总三萜含量的提高，且能够人工培养，遗传稳定，易于规模化生产。该菌株可用于景天三七的人工种植，能够有效提高药材的质量，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：蒋继宏 李露丹 曹小迎 吴宣 徐靓 徐丹 盛译萱
受保护的技术使用者：江苏师范大学
技术研发日：2022.11.25
技术公布日：2023/9/23