用于识别或预测血管生成的标志物的制作方法

1.本发明涉及用于识别或预测受试者中的血管生成的标记的细胞应激标志物。本发明还涉及识别或预测受试者中血管生成的方法。


背景技术：

2.血管生成(angiogenesis)是与诸如癌症、过敏性疾病、自身免疫性疾病和眼部病症(例如年龄相关性黄斑变性(amd)、特别是湿性amd)相关的关键病状(pathology)。湿性amd(wet-amd)是视力丧失的主要原因，在英国影响着2.5％的65岁及以上的老年人。在80岁及以上的老年人中，这一比例上升至6.3％。
3.目前湿性amd的诊断依赖于视网膜成像来评估异常血管的发育。然而，湿性amd具有静默且进展快速的性质，常常导致诊断和治疗进行得太晚而无效。由此可能导致严重的发病率。
4.因此，存在识别有发展湿性amd风险的受试者的需求，以便在早期进行治疗。本发明力图解决这些及其他问题。


技术实现要素：

5.本发明的第一方面提供了一种用于识别或预测受试者中的血管生成的标记的细胞应激标志物。
6.本文所用的术语“细胞应激标志物(cell stressmarker)”是指识别发生细胞应激的细胞的标志物。因此，标志物可以为特异性结合应激的细胞的化合物或分子。细胞应激可能预测细胞最终会发生凋亡。在一些实施方案中，细胞应激标志物还能够标记凋亡的细胞(即标志物能够标记发生细胞应激的细胞以及凋亡细胞)。因此，在实施方案中，细胞应激标志物在本文中可为“凋亡标志物(apoptosis marker)”。
7.本文所用的术语“凋亡标志物”是指可以将凋亡细胞与活细胞区分开的标志物。该标志物还能够区分凋亡细胞和坏死细胞。因此，标志物可以为特异性结合凋亡细胞的化合物或分子。
8.该细胞应激标志物可以包含或由识别应激的细胞膜的标志物组成。
9.术语“血管生成(angiogenesis)”是本领域已知的术语，指的是从原有脉管系统中生长出新血管。有利地，本发明人发现标记的细胞应激标志物可用于在单细胞水平上识别应激细胞以预测或识别血管生成。在一些实施方案中，血管生成是指早期血管生成。通过在早期识别血管生成，或预测血管生成的发展，临床上可以在早期靶向抑制或促进血管生成，以确保受试者的最大受益。
[0010]“预测血管生成(predicting angiogenesis)”，可以理解为是指预测血管生成的发展，例如在血管生成发生之前。这使得临床干预能够在意料之外的早期进行。这反过来可以防止症状的快速进展，例如湿性amd的视力丧失。
[0011]
细胞应激标志物可用于识别或预测血管生成是完全出乎意料的。这是因为血管生
成与新细胞的生长有关，而不是与细胞应激和/或细胞凋亡有关。
[0012]
在一些实施方案中，细胞应激标志物是膜联蛋白或其片段或变体。膜联蛋白家族是已知的细胞凋亡标志物。膜联蛋白是在阳离子存在的情况下可逆地结合到细胞膜上的蛋白质。用于本发明的膜联蛋白可以是天然的或可以是重组的。
[0013]“片段”应理解为指基本上保留了整个膜联蛋白的功能活性的膜联蛋白的截短版本。“基本上保留”应理解为指保留整个膜联蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的功能活性。膜联蛋白的变体应理解为指具有与野生型膜联蛋白不同的氨基酸序列的蛋白质，使得该变体具有与野生型膜联蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。膜联蛋白的变体将基本上保留野生型膜联蛋白的功能活性。
[0014]
膜联蛋白可以是膜联蛋白5、11、2或6。在一些实施方案中，膜联蛋白是膜联蛋白5。在另一实施方案中，膜联蛋白是膜联蛋白128(taitetal.2005)。膜联蛋白128是膜联蛋白5的变体，与野生型膜联蛋白5的不同之处在于两个单氨基酸突变。膜联蛋白128在n末端包含一个暴露的巯基，可提高分子标签例如荧光标记的偶联效率。
[0015]
超出现有理论的是，本发明人认为膜联蛋白能够结合的磷脂酰丝氨酸暴露于处于应激状态的内皮细胞中。因此，识别磷脂酰丝氨酸，例如通过与膜联蛋白相结合的方式，可以表明细胞处于应激状态。发明人惊讶地发现细胞膜上磷脂酰丝氨酸的暴露可以指示早期血管生成的后期发展。
[0016]
本领域已知的其它细胞凋亡标志物包括例如突触结合蛋白i的c2a结构域、耐久霉素、非肽类的靛红磺酰胺类似物例如wc-ii-89，和aposense例如nst-732、ddc和ml-10(saint hubert et al.，2009)。此类细胞凋亡标志物适合用作本发明的细胞应激标志物。
[0017]
细胞应激标记的标签可以是可见的。示例性的可见标记可以包括但不限于量子点、纳米微球和/或纳米棒。本领域技术人员知晓其他可见标记。
[0018]
标记可以是荧光标记。荧光标记是指响应激发而发光的化合物或分子(例如荧光基团)，由于高信噪比从而具有较高的图像分辨率和灵敏度，同时符合曝光安全标准避免光毒性作用而可选用。优选的是，荧光标记在施用时几乎或完全不引起炎症。荧光标记可以具有红外或近红外光谱中的波长。荧光标记可具有约400nm-约1000nm、优选约500nm-约900nm、更优选约700nm-约900nm的发射波长。
[0019]
合适的荧光标记包括一种或多种荧光素钠、吲哚菁绿(icg)、姜黄素、irdye700、dy-776(也被称为d-776)、dy-488和dy-781。在一些实施方案中，荧光标记是d-776。
[0020]
标记的细胞应激标志物可以通过标准技术将标记例如荧光标记，偶联到标志物化合物上来制备。此类标记可以从公众熟知的来源获得，例如dyomics。适当的用于将标记偶联到标志物上的技术是本领域已知的，也可以由标记的制造商提供。
[0021]
血管生成(可选地早期血管生成)与病理状况例如疾病以及正常的生长和发育相关。因此，血管生成可以是生理性、治疗性或病理性的血管生成。在本发明中，生理性血管生成是指与受试者的正常生长和伤口愈合相关的血管生成。例如，血管生成先前已被证明是由运动诱导的，特别是高海拔的耐力运动，例如登山。因此，生理性血管生成可能与受试者先前的运动有关。治疗性血管生成可以与伤口愈合和/或组织工程支架的整合相关。
[0022]
在一些实施方案中，血管生成是病理性血管生成。病理性血管生成理解为与疾病
相关或涉及疾病的血管生成。病理性血管生成可以与疾病、疾病阶段、疾病严重程度和/或疾病发展的预测相关。
[0023]
细胞应激标志物可用于识别或预测病理性血管生成。通过细胞应激标志物对病理性血管生成的识别或预测可以预测或识别特定疾病、疾病阶段和/或疾病严重程度。能够预测特定疾病、疾病阶段和/或疾病严重程度或能够在早期识别特定疾病，有助于选择、施用或可选地，监测最适治疗方案。
[0024]
本文疾病使用的术语“预测”可以理解为指在疾病发生之前或在受试者处在没有症状的疾病的早期阶段和/或该疾病不会以其他方式被识别的早期阶段对疾病、疾病阶段和/或疾病严重程度发展的预测。在识别早期血管生成的实施方案中，这可以用于识别早期阶段的疾病。例如，当受试者没有疾病的其他症状时，或者当受试者仅具有有限的或轻微的疾病症状时识别出早期血管生成，可以认为处于疾病的早期阶段，而很难用其他方式或者不可能诊断。这有助于临床医生在早期阶段选择和实施治疗，从而潜在地避免不必要的疾病进展。
[0025]
本文所述的疾病可以包括与血管生成相关的任何疾病。例如，疾病包括可以施用抗vegf作为治疗的任何疾病。在一些实施方案中，所述疾病包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、过敏性疾病、镰状细胞病和/或眼部疾病。可以理解的是一些疾病包括例如眼部疾病和自身免疫性疾病(例如糖尿病性视网膜病)。
[0026]
在一些实施方案中，血管生成与心血管疾病相关。在其他实施方案中，血管生成与心血管疾病的有效治疗(即治疗性血管生成)相关。与血管生成相关的心血管疾病的示例包括静脉闭塞，例如中风。
[0027]
各种自身免疫性疾病为本领域技术人员所周知。它们包括但不限于结节病、类风湿性关节炎、多发性硬化症(ms)、银屑病、糖尿病(特别是i型糖尿病)、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、格林-巴利综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性脑炎、视神经脊髓炎和抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)抗体病。
[0028]
在一些实施方案中，自身免疫疾病是中枢神经系统(cns)自身免疫疾病。示例性的cns自身免疫性疾病包括但不限于神经结节病、ms、视神经脊髓炎和抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)抗体病。
[0029]
过敏性疾病可包括或由鼻炎、哮喘和/或花粉过敏组成。通常，过敏性疾病是慢性过敏性疾病。已发现慢性过敏性疾病可能与血管生成有关。“慢性过敏性疾病”将理解为是指长期且复发的过敏性疾病。长期可以指病症持续和/或复发至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少10年或至少20年。
[0030]
在一些实施方案中，疾病包括眼部疾病。眼部疾病包括但不限于视网膜静脉阻塞、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性(amd)、视神经炎和眼部血管疾病。在一些实施方案中，眼部疾病包括眼部神经系统变性疾病。术语“眼神经变性疾病”是本领域技术人员周知的，是指由视神经元逐步和进行性损失引起的疾病。它们包括但不限于amd、视神经炎和糖尿病视网膜病变。神经系统变性疾病包括例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和弗立特里希氏共济失调。
[0031]
在一些实施方案中，眼部疾病包括或由糖尿病性视网膜病或amd组成。
[0032]
在一些实施方案中，眼部疾病包括或由amd组成。可选地，眼部疾病包括或由湿性amd组成。本发明人惊讶地发现，标记的细胞应激标志物可用于识别或预测受试者中的血管生成，所述识别或预测受试者中的血管生成是湿性amd的预测标志物。因此临床医生能够预测受试者是否会继续发展为湿性amd。湿性amd症状发展得非常快，有可能导致永久性的视力丧失。因此，这样的预测特别有益于临床医生能够在早期阶段对受试者进行治疗，从而减少并且在一些实施方案中避免视力丧失。
[0033]
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。例如，受试者可以是大鼠、小鼠、人、兔、马、狗、猫、牛或羊。在一些实施方案中，受试者选自小鼠、大鼠、人和兔。在一些实施方案中，受试者是人类。
[0034]
本发明的第二方面提供了标记的细胞应激标志物在识别或预测受试者中的血管生成中的用途。血管生成可以是生理性或治疗性的血管生成，优选如本文所述的生理性血管生成。
[0035]
本发明的第三方面提供了一种识别或预测受试者中血管生成的方法，该受试者已经被施用了标记的细胞应激标志物，包括步骤：
[0036]
(a)使用第一成像装置生成来自受试者的第一图像；
[0037]
(b)识别图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞；
[0038]
其中如果在图像中识别出标记的细胞应激标志物阳性的细胞，则识别或预测血管生成。
[0039]
本发明的再一方面提供了一种识别或预测受试者中血管生成的方法，包括步骤：
[0040]
(a)向受试者施用标记的细胞应激标志物；
[0041]
(b)使用成像装置生成来自受试者的图像；
[0042]
(c)识别图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞；
[0043]
其中如果在图像中识别出标记的细胞应激标志物阳性的细胞，则识别或预测血管生成。
[0044]
本发明人发现标记的细胞应激标志物可用于在单细胞水平上标记细胞应激。在单细胞水平上识别细胞应激能够有利地预测血管生成的后续发展和/或能够在早期阶段检测血管生成，从而能够在其他或进一步的症状出现之前预测或识别疾病。
[0045]
施用标记的细胞应激标志物可以是静脉内施用、鼻内施用、局部施用或玻璃体内施用。局部施用是指应用于受试者的表面，例如皮肤或眼睛表面。在一些实施方案中，静脉内施用标记的细胞应激标志物。在其他实施方案中，玻璃体内施用标记的细胞应激标志物。
[0046]
在一些实施方案中，该方法还包括对基于血管生成或预测的血管生成识别的疾病、疾病阶段、疾病严重程度或预测疾病施用适当的治疗。合适的治疗可包括或由抗血管生成剂(即抑制血管生成的治疗)组成，例如抗vegf化合物。示例性的抗血管生成剂可包括但不必然限于阿西替尼、贝伐单抗、雷珠单抗、卡博替尼、依维莫司、来那度胺、帕唑帕尼、雷莫芦单抗、瑞格非尼、索拉非尼、舒尼替尼、沙利度胺、凡德他尼和zib-阿柏西普。施用适当的治疗可以是静脉内施用、鼻内施用、局部施用或玻璃体内施用。
[0047]
在一些实施方案中，识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞包括对图像中该阳性细胞的数量进行计数。有利的是该步骤不需要重复。即识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞的步骤仅需要发生一次，因为本发明人惊讶地发现仅需要一个识别步骤来识别血管生
成或预测其后的发生。因此，本方法特别快速、准确并且具有成本效益。
[0048]
在一些实施方案中，识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞包括确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞在受试者中的位置。这可能包括确定图像中所示的标记的细胞应激标志物阳性的细胞的解剖位置。如前所述，本发明的细胞应激标志物可以标记发生应激的细胞和凋亡的细胞。因此，可能需要区分凋亡细胞和应激细胞。本发明人已经确定实现这一点的一种方法是观察标记细胞的位置并考虑它是否位于可能发生血管生成的位置，例如靠近血管，或者是否位于不太可能发生血管生成的位置，例如位于视网膜的感光层中。因此，本发明的方法可以进一步包括确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞位置的步骤，该位置表明了细胞是否参与血管生成或细胞是否凋亡。这能够使医师减少凋亡阳性细胞的假阳性，从而确保血管生成的识别和/或预测是准确的。确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞位置的步骤可以包括识别细胞相对于解剖结构例如血管或组织类型的位置。
[0049]
确定位置的步骤可包括识别细胞在所生成的第一图像上的位置。或者，其可包括在第二图像中定位细胞，特别是从不同侧面展示细胞的图像，或显示在第一图像中可能不可见的组织或其他结构。任选地，该方法包括在多个平面中确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置。例如，可以跨x轴和y轴确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置，例如，在2d图像中。可以跨x轴、y轴和z轴确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置。在一些实施方案中，可以从多个图像中识别细胞的位置。例如，可以使用至少第二和第三图像来识别细胞的位置。多个图像中的每一个可以使用相似或相同的参考系来拍摄，使得在获得多个图像之后，它们可以堆叠在一起以形成x、y和z轴。也就是形成3d图像。3d图像可用于识别细胞的位置。
[0050]
该方法可以包括生成来自受试者的第二图像，例如使用相同或不同的成像设备；并且可选地将该图像与第一图像进行比较。当该方法包括比较一幅或多幅图像时，优选的是，一幅图像可以叠加在另一幅图像上。该方法包括这样做的步骤。该方法还可以包括图像配准的步骤，即对齐图像，以正确匹配每个图像中显示的标记的细胞应激标志物阳性的细胞。
[0051]
当该方法包括使用两个或更多个图像时，可以使用相同或不同的成像设备来获得图像。例如，第一成像装置可以包括或由共聚焦扫描激光显微镜组成。共聚焦扫描激光显微镜的一个示例是如共聚焦扫描激光检眼镜(cslo)。
[0052]
在一些实施方案中，使用第一和第二成像装置来获得多个图像。第二成像装置可以包括或由计算机断层扫描(ct)扫描仪、磁共振成像(mri)扫描仪、位置发射断层扫描(pet)扫描仪、偏振器、反射图像扫描仪、眼底相机和/或oct扫描器组成。优选地，第二成像装置是与第一成像装置不同的装置。
[0053]
在一些实施方案中，第二成像装置包括或由计算机断层(ct)扫描仪、磁共振成像(mri)扫描仪、位置发射断层(pet)扫描仪和/或oct扫描仪组成。
[0054]
在一些实施方案中，第二成像装置包括或由oct扫描仪组成。
[0055]
在一些实施方案中，使用第一、第二和第三成像装置来获得多个图像。第三成像装置可以包括或由计算机断层(ct)扫描仪、磁共振成像(mri)、位置发射断层(pet)扫描仪、偏振器、反射图像扫描仪、眼底相机和/或oct扫描仪组成。优选地，第三成像装置是与第一和第二成像装置不同的装置。
[0056]
第一成像装置可用于获得2d或3d图像。可选地，第一成像装置用于获取2d图像。第二成像装置可用于获得2d或3d图像。第二成像装置可用于获得3d图像。在一些实施方案中，使用第二或第三成像装置来提供掩模图像。掩模图像理解为指代“背景”图像，即可设置用于识别细胞位置的图像的背景值的图像。
[0057]
在一些实施方案中，第三成像装置包括或由反射图像扫描仪组成。
[0058]
在一个实施方案中，该方法包括确定一根或多根血管的位置。可通过血管造影来确定血管位置的方法是本领域熟知的。例如，可以使用荧光素血管造影(fa)、吲哚菁绿血管造影(icga)和/或光学相干断层扫描(oct)、任选地还可以使用光学相干断层扫描血管造影(octa)来确定血管的位置。
[0059]
在一些实施方案中，确定图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置可以包括确定所述细胞相对于血管的位置的位置。例如，当标记的细胞应激标志物阳性的细胞被识别为邻近血管或在血管上时，这可用于识别细胞应激而不是细胞凋亡。反过来，这可以用作早期血管生成或预测后续发展血管生成的积极指标。
[0060]
例如，在使用血管生成的识别或预测来预测受试者是否可能发展出眼神经变性病症的实施方案中，标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置的确定(任选地，可进一步包括确定相对于血管的位置的位置)可用于预测受试者是否可能发展成为湿性amd而不是青光眼。这是因为湿性amd的特点是细胞应激，而青光眼则与细胞凋亡相关。这是特别有益的，因为湿性amd和青光眼都是严重且进展迅速的眼部病症，需要不同的治疗。在症状出现之前或在疾病早期阶段区分这两种病症，可以选择和实施正确的治疗方案，以避免病人不必要的视力丧失。
[0061]
标记的细胞应激标志物阳性的细胞的识别和标记的细胞应激标志物阳性的细胞在图像中的位置的确定可以由计算机来执行。这可以包括生成用于训练识别模型(例如人工神经网络)的训练数据。人工神经网络可以包括卷积神经网络(cnn)。训练数据可以包括对照数据，该对照数据人工分类为包含或不包含标记的细胞应激标志物阳性的细胞，例如来自已知患有(或不患有)疾病(例如湿性amd)的受试者。
[0062]
在一些实施方案中，可以使用训练数据来训练识别模型。这可以用于补充或者替代生成用于训练识别模型的训练数据的步骤。训练完成后，识别模型就可以被人工验证。
[0063]
经过训练的识别模型(例如，卷积神经网络)可用于识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞和任选地确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞的位置。
[0064]
或者，识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞的以及任选地确定标记的细胞应激标志物阳性的细胞在图像中的位置可以是人工的。
[0065]
在一些实施方案中，在图像中识别出至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少40个标记的细胞应激标志物阳性的细胞预测受试者疾病发展。在一些实施方案中，在图像中识别出多于5个、多于10个、多于15个、多于20个、多于30个或多于40个标记的细胞应激标志物阳性的细胞预测受试者疾病发展。例如，在受试者眼睛的图像中识别出至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少40个标记的细胞应激标志物阳性的细胞可以预测受试者发展湿性amd。在一些实施方案中，在受试者眼睛的图像中识别出至少5个、可选地多于5个标记的细胞应激标志物阳性的细胞可预测受试者发展湿性amd。
[0066]
有利的，本发明人还发现，识别的标记的细胞应激标志物阳性的细胞的数量增加
与随后发展的疾病的严重程度相关，即图像中所识别的标记的细胞应激标志物阳性的细胞的数量越多，受试者随后的疾病就越严重。因此，在一些实施方案中，在图像中识别出至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少40个标记的细胞应激标志物阳性的细胞预测受试者疾病发展严重性的增加。这有助于确定受试者是否需要更高剂量的治疗、更规律的进行治疗或者完全不同的治疗。
[0067]
在一些实施方案中，会重复生成图像的步骤以获得第二、第三、第四、第五或更多个额外的图像。一个图像可以与一个或多个受试者相同区域的其他先前图像进行比较，例如受试者的同一只眼睛。重复生成图像的步骤可以是每月、每两个月、每六个月、每年或每两年一次。该方法可包括将图像叠加在一个、两个、三个、四个或更多个先前的图像上。比较受试者同一区域随着时间产生的图像可用于监测疾病的进展。或者，在已施用适当治疗的实施方案中，比较受试者同一区域随着时间产生的图像可用于监测施用的治疗的功效。例如，在生成第一图像之后，可以对受试者进行适当的治疗。任何后续获得的图像可用于监测所述治疗的功效。
[0068]
在一些实施方案中，该方法可施用于已施用另一方法的受试者，以试图诊断或预测特定疾病的发展的可能性。因此，本方法可以用作“第二意见”来测试和/或提高另一种(第一)方法的准确性，并确保识别出来自第一方法的任何假阴性结果。
[0069]
本发明的另一方面提供了一种标记的细胞凋亡标志物，用于识别受试者身体部分(非眼睛)中的细胞凋亡。在一个实施方案中，该身体部分不是中枢神经系统部分。身体部分可以是肢体(例如手臂或腿)、肝脏、脾脏、心脏、一个或多个肺、胃、小肠、大肠、肾、皮肤或膀胱的全部或部分。
[0070]
在本技术的说明书和权利要求书中，词语“包括”和“含有”以及其变体，例如“包含”的意思是“包括但不限于”，并且不排除其他组分，整数或步骤。此外，单数涵盖复数，除非上下文另有要求：特别地，当使用不定冠词时，在本技术书中应被理解为考虑复数以及单数，除非上下文另有要求。
[0071]
本发明每个方面的优选特征可以是如本文所述的结合任何其他方面的特征。在本技术的范围内，在前面的段落、权利要求书和/或如下的说明书和附图中阐述的各个方面、实施方案、示例和替代方案，特别是其各个特征，可以单独或任意组合使用。即，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合，除非这些特征不兼容。
附图说明
[0072]
现在仅通过示例的方式，参考附图描述本发明的一个或多个实施方案，其中：
[0073]
图1显示drac cnn系统在oct中预测新视网膜下液(湿性amd)。对齐应用：对于每只眼睛，利用专门的应用程序，将反射式oct定位图(a)与通过共聚焦扫描激光检眼镜(cslo)以及oct扫描(c)捕获的基线自发荧光图像(b)进行对齐。这涉及到使用自动路标(landmark)来定义连续扫描中的oct区域(填充的白色圆圈)和手动放置基准标记(黄色和蓝色十字，a，b)。使用cslo在静脉注射anx776后240分钟，拍摄darc图像(d)，并自动将其与基线自发荧光图像(b)对齐，而后者现在也与oct图像(a，c)对齐。然后，可以使用青色的垂直线通过oct扫描(c)在darc图像中找到相应的点，从而在该垂直位置上确定oct图像中的所有横截面结构。因此，在这个例子中，可以在基线时，通过x、y坐标记录青色圆圈中的黄色
darc斑点(d)在基线oct扫描(c)的所有视网膜层中的位置。可以对所有darc斑点进行这样的操作，相应的点位于所有随访oct扫描。darc斑点定位：使用先前描述的cnn辅助算法(lindekleiv et al.(2013))自动检测darc斑点。青色圆圈中的黄色darc斑点(d)位于基线(c)，并与36个月的随访oct扫描(e)对齐。随后，使用srf cnn自动识别新视网膜下液(srf)并在36个月时的标注图像中勾画出来(紫色区域，f)。这表明青色圆圈中的黄色darc斑点(d)预测36个月后的新srf(e，f)。独有darc斑点预测：对于在基线时看到的每个单独的darc斑点，可以与随访进行的一系列oct扫描进行评估。与srf相关的独有darc斑点(d)用不同颜色的圆圈表示不同的时间点，包括：12-18个月(红色，d，g)，18-24个月(浅绿色，d，l)，24-30个月(紫色，d，q)和30-36个月(黄色，d)。这些显示在相应的随访oct扫描图上，其中包括原始图像(h、m、r)和基线图像(j、o、t)，以及由srf cnn定义的新形成srf，使用相同的颜色编码显示标注的新srf区域(i、n、s)，并与基线图像(k、p、u)进行比较。每个oct扫描中的青色线突出显示了通过指示的darc斑点的垂直横截面(白色箭头；g、l、q)。
[0074]
图2显示在36个月内，oct中cnn darc计数＞5与srf发展(湿性amd)的风险相关联。(a)图显示按cnndarc计数＞5(红色)或≤5(蓝色)分组的眼睛在36个月内保持免于srf(免于湿性amd)的比例。cnndarc计数＞5的眼睛与cnndarc计数≤5的眼睛相比，srf发展水平显著增加(wilcoxon秩，p＝0.0156)。(b)表显示根据基线诊断对转换眼睛进行分类。所有7只发展出新srf的眼睛的cnn darc计数都大于5，在17只眼睛中，有16只眼睛在基线时有活动性脉络膜新生血管cnv(n＝10)或在随访时发生转化(n＝7)，它们的cnn darc计数都大于5。
[0075]
图3显示具有大面积srf积累的眼睛中cnn darc计数在显著增加。小提琴图展示了在oct上叠加srf的独有darc斑点数据分布，以及每个时间点的oct上累积srf的总面积。为了检测oct上的cnv病变，使用cnn识别srf区域，该cnn使用the retinal oct fluid challenge(retouch)的数据进行训练。考虑到在6个月间隔和眼睛之间oct扫描数量的不均衡，计算了每个间隔内的平均srf面积。根据3000um的阈值，将眼睛分为“高srf”和“低srf”两组。所有时间点上所有眼睛的独有darc计数大于5，这与大量srf积累相关。所有p值表明mann-whitney检验的显著性。水平线表示中位数和四分位数范围，以及最小和最大的点。
[0076]
图4显示darc识别了兔子血管生成模型中最早的内皮活性变化。通过向3只兔子的左眼滴注50ul人源vegf(hvegf165-peprotech，伦敦，英国)(含有1ug)来建立兔子血管生成模型。2天和4天后，静脉注射anx776(0.2mg)和1％的荧光素钠。使用cslo的icga和ffa设置对兔子的双眼进行成像。在经过hvegf处理的左眼(a-c)中，darc斑点(被识别为anx776阳性标记的白色斑点)与未经处理的右眼相比清晰可见(d-f)。三名盲法观察员手动获得了darc的计数结果。(g)每个点代表左右眼的分开手动观察结果。相对对照的对侧眼，所有hvegf眼睛都显示出阳性的darc着色。处理眼与对照眼的darc计数之间存在显著差异(p＝0.0203)。插图(a-f)显示hvegf处理后4天的荧光血管造影。与对照(插图d-f)相比，所有处理后的眼睛在4天内显示荧光素渗漏(插图a-c)。局部雷珠单抗的施用减少了血管生成的darc标记(h-j)。虽然在a-f的处理和对照眼之间darc计数存在显著差异，但雷珠单抗处理(n)消除了这种显著性。与空白对照相比，局部雷珠单抗的施用显著减少了darc计数(o，p＝0.0262)。
[0077]
图5显示在兔子血管生成模型中，抗血管生成治疗减少了血管渗漏。按照与图4相同的方法建立兔子血管生成模型。施用雷珠单抗进行抗血管生成的治疗。与雷珠单抗处理的眼(g-i)相比，所有经过hvegf处理的对照兔子眼睛在4天内显示荧光素渗漏(a-c)示。
具体实施方式
[0078]
背景
[0079]
年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration，amd)是在发达国家中造成失明的主要原因，预计其发病率会随着人口老龄化的上升而增加。amd存在两种形式，根据脉络膜新生血管(cnv)的存在(“湿性”)或不存在(“干性”)进行分类，并以渗漏脉管系统形成视网膜下或视网膜内液体(分别为srf或irf)为特征。光学相干断层扫描(oct)目前被认为是治疗amd的金标准，尤其是评估靶几抗血管内皮生长因子(抗vegf)的治疗。
[0080]
凋亡视网膜细胞检测(detection of apoptotic retinal cell，darc)是一种监测视网膜细胞死亡率的技术，并完成了诊断青光眼的i期临床试验(cordeiro et al.2017)。该技术目前包括静脉注射一种名为anx776的新型荧光剂，该荧光剂包含内源性膜联蛋白a5的改良版本，其与近红外荧光团dy-776荧光偶联。使用常用的共焦扫描激光检眼镜(cslo)的icga设置，anx776阳性标记的细胞在视网膜上可视化为“白点”。darc利用眼睛独特的光学特性，使得能够使用人源膜联蛋白5的荧光标记衍生物直接观察患者的单个神经细胞凋亡。研究将darc作为一种预测(即由于缺乏足够的症状，在诊断发生之前)疾病发展，(特别是湿性amd)的技术。
[0081]
材料和方法
[0082]
d776和膜联蛋白5的偶联
[0083]
将重组细菌表达的膜联蛋白5(5mg，溶于1ml等渗缓冲液)在“标记缓冲液”中透析超过3小时，过程中更换两次缓冲液(每次250ml)。通过将21g(250mmol)碳酸氢钠溶解在400ml蒸馏水中来制备标记缓冲液。添加1克叠氮化钠(0.2％)。用浓氢氧化钠水溶液将ph值调节至9.0。使用前，向一份浓缩储备溶液中添加9份蒸馏水稀释缓冲液(v/v)。然后膜联蛋白5可以进行标记反应。每个标记反应的染料与蛋白质的比例保持恒定。因此，用0.5mg的d776-nhs-酯来标记1mg的膜联蛋白5，染料和膜联蛋白5之间的摩尔比大约为500。涡旋将nhs-酯溶解于二甲基甲酰胺，并将染料加入到标记缓冲液中的膜联蛋白5中，反应开始。标记反应中膜联蛋白5的终浓度为5mg/ml。标记反应可以在置于摇床中的eppendorf管中进行，历时两个小时。
[0084]
反应结束时，将有色标记溶液小心地移液至5或10ml sephadex g-25柱上，并使其渗入凝胶中。然后将100mm pbs缓冲液(ph＝7.4)缓慢滴加到柱子上洗脱偶联物。标记的蛋白质为跑在前面的相对清晰的条带，而游离的染料则慢慢地拖尾在后面。标记的膜联蛋白5一到达柱子底部，就会被收集到eppendorf管中并可供立即使用。
[0085]
临床试验设计
[0086]
darc的单中心、开放标签的2期临床试验在帝国理工学院医疗保健nhs信托西部眼科医院进行。所有受试者在2017年2月15日至2017年6月30日期间均接受了单次静脉注射荧光膜联蛋白5(anx776，0.4mg)。已经在西方眼科医院视网膜医学科护理下的amd受试者被招募参加试验，其中该研究经布伦特研究伦理委员会批准后，根据赫尔辛基宣言获得知情同意(isrctn10751859)。所有参与者仅在基线时进行一次darc，并根据护理标准在每次随访时记录光学相干断层扫描(oct)扫描，最多持续至darc后36个月。
[0087]
如果患者符合表1中概述的纳入和排除标准，则考虑将其纳入研究。具体来说，要纳入amd队列，他们必须存在cnv(湿性amd)或与“早期amd”(玻璃疣、视网膜色素上皮(rpe)
色素变化)或“晚期amd”(rpe地图样萎缩(干性amd))相一致的变化。此外，存在脉络膜新生血管(cnvm)风险增加的眼部疾病，以及当前或过去使用氯喹、羟氯喹、氯丙嗪、硫利达嗪、硫酸奎宁、氯法齐明、顺铂、卡莫司汀、(bcnu)、去铁胺、胺碘酮、异维a酸或金超过30天的患者被排除在外。根据临床检查和视网膜成像结果，在基线时将眼睛分为活动性cnv、既往cnv、早期amd和晚期amd患者。
[0088]
在19名amd受试者中，对31只眼睛进行了基线图像分析和240分钟时间点的评估。
[0089]
darc图像获取和盲法研究
[0090]
视网膜图像的获取使用cslo(hra+oct spectralis，heidelberg engineering gmbh，海德堡，德国)，如normando等人之前所述(2020)。使用高分辨率icga模式的荧光设置(二极管激光器786nm激发；带有800nm屏障滤光片的光电探测器)，在瞳孔扩张(1％托吡卡胺和2.5％去氧肾上腺素)后获取基线红外自发荧光图像。所有受试者仅在基线时进行一次darc。每名患者静脉注射anx776(单剂量0.4mg)，并在anx776注射期间和注射后15、120和240分钟进行成像，在每个时间点记录100帧的平均图像。在进行任何分析之前，所有图像都是匿名的，并且本研究中仅分析了240分钟的图像。
[0091]
还对3只新西兰白兔进行了一项试点研究，使用已建立的视网膜血管生成模型评估darc。所有实验均按照arvo关于眼科和视力研究动物使用的声明以及英国内政部批准的方案设计和进行。简而言之，将2.5kg的兔子分别肌肉注射50mg/kg盐酸氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉处理。用2.5％去氧肾上腺素和1％托吡卡胺散瞳。将1ug人vegf165(sigma，uk)溶解在0.1％牛血清白蛋白(sigmauk)中，取50ul通过玻璃体腔注射到每只动物的左眼中。48小时后，在全身麻醉的状态下，兔子接受静脉注射anx776(0.2mg)和1％荧光素钠，并使用hra-spectralis的高分辨率icga和ffa模式在40分钟内进行darc和448成像。3名盲法观察员对darc图像进行手动计数。对于抗血管生成实验，随后给3只兔子施用雷珠单抗滴眼液。3只兔子作为空白对照。
[0092]
oct扫描采集
[0093]
根据护理标准，在darc后最长36个月内记录每位患者每次随访时的oct扫描结果。darc图像和oct扫描在事后分析中进行了评估。
[0094]
darc斑点检测
[0095]
normando(2020)等人描述了斑点检测的完整方法。简而言之，这种方法包括训练中枢神经网络(cnn)对对照数据集中的斑点进行分类，这些斑点最初使用模板匹配进行识别，并由5名观察者手动分类。使用5名观察者中两名观察者的一致结果来训练cnn，发现其准确率为97％，灵敏度为91.1％，特异性为97.1％。
[0096]
本发明中未对已报道的cnn模型和权重进行任何修改。
[0097]
clso和oct对齐
[0098]
每只眼睛的darc图像与相应的oct系列扫描对齐，以便在后续随访时在相应的oct扫描上识别darc斑点的位置。对齐也可以将clso图像中识别的darc斑点的位置与oct图像中视网膜下液(srf)的位置进行参考比对。为了将darc clso图像与oct图像配准，简单地说，使用仿射变换和非刚性b样条变换自动对齐基线自发荧光和darc图像(240分钟)。这是使用多分辨率对齐方法(simpleitk(numfocus，美国)和梯度下降优化器完成的。接下来，通过在clso自发荧光和oct反射图像上手动放置基准标记(fiducial marker)(白点，图1)，然
后计算并应用仿射变换，将连续spectralis oct扫描的反射图像与配准的darc图像对齐。所有图像都对齐之后，则在240分钟darc图像上的可选择的位置与相应的oct图像切片中识别的位置相同。
[0099]
cnn识别srf
[0100]
为了在oct上检测脉络膜新生血管(cnv)病变，使用cnn来识别srf区域。cnn使用来自bogunovi等人(2019)所述的the retinal oct fluid challenge(retouch)的数据进行训练。
[0101]
调整如ronneberger等人(2015)所述的自定义unet。之前已经实施了传统unet的通用训练机制，这使用bogunovi等人(2019)所述的the retinal oct fluid challenge(retouch)的数据进行训练，其中视网膜内液(irf)、视网膜下液(srf)、色素上皮脱离(ped)区域已由多个观察者手动注释。
[0102]
创建每个oct扫描图像的3通道标记掩膜，以便每个注释类型都可以用三通道rgb图像中的三个独立通道来表示。该模型在配备8gb nvidia gtx 1080显卡的windows pc上进行训练，并使用unet进行100轮的训练，固定图像尺寸为512
×
512、32个滤波器、随机失活为0.2，并且仅随机增强水平翻转。训练数据集中分出大约2/3(n＝4,624)用于训练，1/3(n＝2，312)用于验证，每个srf扫描图像的图像尺寸为497
×
495像素。
[0103]
模型训练完成后，在1/3验证集上进行了测试。比较从训练网络获得的dice系数(normando et al.2020中所述)，针对srf，spectralis与retouch中报告的最佳系统相比具有优势，spectralis的dice系数得分为0.83，而报告的为0.75。尽管无法进行直接比较，因为报告的结果是针对cirrus、spectralis和topcon的挑战数据集的组合而我们的结果是针对训练数据集划分的子集。
[0104]
为了确保使用retouch数据集获得的结果能够代表我们自己的darc研究，高级视网膜专家使用牛津大学视觉几何组的vgg图像注释器(via，其网址为https://gitlab.com/vgg/via/blob/master/contributors.md)对735个匿名oct图像进行了手动注释。使用srfcnn计算得出的dice系数为0.84。将srfcnn应用于31只眼睛的数据集中的20,630个oct图像。
[0105]
如果在oct扫描平面上有srf，则认为darc斑点与srf区域相交。
[0106]
srf积累计算
[0107]
每6个月间隔出现的srf用于对眼睛进行分类。考虑到6个月间隔内和不同眼睛之间的oct扫描次数不等，计算每个间隔的srf平均面积。新srf被定义为oct上出现srf的眼睛，但在之前的时间段内该眼睛被分类为srf阴性。
[0108]
对于任何6个月的时间间隔，每只眼睛的srf量被视为整个眼睛的特定时间点的所有oct扫描的检测到的srf像素的归一化总和。积累srf是每次oct扫描的srf量，按该6个月期间的oct扫描次数进行平均。
[0109]
数据分析
[0110]
使用graphpad prism(version 8.01)、sklearn(version 0.0)、spss(ibm spss version 25)和python(version 3.6)进行统计分析。使用为srf cnn测试生成的精确率、召回率、f1得分和曲线下面积(auc)构建精确度-召回曲线。使用kappa统计数据评估srf的临床定义和cnn定义之间的一致性。基于免于srf的眼睛，构建比较cnndarc总数高于和低于5
的眼睛的图表，在每个时间点使用wilcoxon秩配对和简单线性回归统计进行比较。构建混淆矩阵以评估仅使用叠加srf的darc斑点对新srf眼的预测率，从中计算阳性预测值(ppv)、特异性、灵敏度。使用spearman相关系数(p＜0.05)建立oct上叠加的srf上独有的darc斑点与oct上每个时间点积累srf总面积的相关性。使用小提琴图对每个oct时间点叠加srf的darc斑点进行评估，分为积累srf的低区域和高区域两组。对srf高组和低组使用曼惠特尼检验进行比较。对施用人源vegf的兔子左眼与未经处理的右眼进行比较的手动darc计数，使用配对t检验进行分析。
[0111]
实施例1：darc预测36个月时oct中出现新的视网膜下液(湿性amd)
[0112]
我们决定研究darc作为一种预测技术(即由于缺乏足够的症状，而在诊断之前)用于疾病的发展，特别是湿性amd。
[0113]
对伦敦icnht西部眼科医院2期darc临床试验中19名amd患者的darc结果进行了事后分析。患者在darc之后进行了规律的oct扫描，持续时间长达36个月。患者的人口统计学数据显示在表2和表3中。在最初进行darc评估的31只眼睛中，29只眼睛进行oct随访，在进行darc后进行了规律的oct扫描，持续时间长达36个月。每个眼睛每6个月间隔的平均oct扫描次数从30-36个月的1.70次到12-18个月的2.59次。随着患者根据标准护理进行继续治疗，接受的抗vegf玻璃体内注射次数的平均值从30-36个月的2.0次到0-6个月的3.61次。
[0114]
在每个时间点进行了分析，以查看基线的darc斑点是否通过其与oct上任何新srf区域的相交来预测湿性amd的发生，如图1所示，检测通过cnn进行。使用srf cnn定义新的srf，在每个时间点将眼睛分为新湿性amd和无新湿性amd组。
[0115]
每个时间段新srf的发生情况如表4所示，仅使用oct cnn srf定义的情况下，6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的转化率分别为7.4，11.5，26.1，26.1，29.2和33.3％。只有当眼睛首次显示新srf时，它们被归类为“转化”眼。与srf形成相关的所有眼睛中，除了一只眼睛外，cnn darc计数均大于5。
[0116]
在进一步的分析中，将叠加srf的自发荧光和darc斑点从基线oct中排除在外，只包括第一次出现的叠加新srf的单独的darc斑点(称为“独有darc斑点(unique darc spot)”)，以避免重复计数。在特定的时间点，如果眼睛在oct上显示出叠加新srf的任何独有darc斑点，将其分类为真阳性；有srf但没有独有darc斑点的眼睛被分类为假阴性；没有srf但有独有darc斑点的眼睛分类为假阳性；没有srf或darc斑点的眼睛分类为真阴性。为在基线后的每个6个月随访期(从6个月到36个月)，构建了混淆矩阵(每个混淆矩阵确定了每个时间间隔darc cnn对每只眼睛的预测决策)。表4总结了混淆矩阵的结果，显示了独有darc斑点预测眼睛新srf活动出现的能力。因此，在6个月时，该系统的特异性为90％，灵敏度为83％，ppv为71％，npv为95％。darc dl系统在所有时间点的ppv均超过70％，在30个月时达到峰值86％。特异性范围为79％至90％，灵敏度在80％以上。
[0117]
图2a显示了在每个6个月时间段，保持无srf(无湿性amd)的眼睛的比例，并按cnndarc计数阈值5进行分组。比较两组发现，cnndarc计数＞5的眼睛与cnn darc计数≤5的眼睛相比，srf发展水平显著增加(wilcoxon秩，p＝0.0156)。也进行了相同数据的线性回归分析，回归估计的斜率统计学上显著不同(p＜0.0001，r2＝0.92，darc cnn＞5；r2＝1.0，darc cnn≤5)，表明存在“时间*组”效应，即相比于cnn darc计数≤5的组，时间的进展对cnndarc计数＞5的组产生显著不同的影响。拟合线和数据点的观察表明，在最初的16个月
内危险较大，之后趋于平缓，尽管cnn darc计数≤5与增加的无srf存活率显著相关。
[0118]
图2b显示了根据基线诊断对转化眼睛的分类。所有7只发展出新srf的眼睛的cnn darc计数＞5。在17只眼睛中，有16只眼睛在基线时有活动性cnv(n＝10)或在随访时发生转化(n＝7)，它们的cnn darc计数＞5。
[0119]
这表明darc可以用于预测湿性amd的发展，从而确保早期诊断。
[0120]
实施例2：相较于其他预测方法，darc提高了预测的准确性
[0121]
随后，我们将实施例1中我们的darc+oct模型的结果与yim等人(2020年)报道的结果进行比较。yim描述了使用深度学习(dl)与oct来改进在6个月时通过分析oct特征预测脉络膜新生血管(cnv)或湿性amd发展的应用。然而，报道的预测值低，即在80％灵敏度时特异性为55％，在90％特异性时灵敏度为34％，阳性预测值(ppv)分别为7.3％和13.2％。
[0122]
表5显示了实施例1中我们的darc dl模型的结果与yim等人(2020年)报道的结果的比较。darc dl系统的ppv要大得多，在6个月时为100％，而yim系统为7％或13％。这也同样见于darc dl更大的特异性与灵敏度读数，在6个月时分别为100％和50％，在36个月时分别为95％和83％。在实施例1中，6个月时的转化率与yim等人的结果相似，分别为14.8％和13.5％。尽管样本大小有所不同。
[0123]
实施例3：darc计数增加与观察到的srf积累幅度相关
[0124]
我们假设darc dl系统比yim系统表现得更好，因为它能够评估单个细胞的活动。为了进一步研究这一点，评估了每只眼睛在每个时间点的darc计数与srf积累幅度之间的关系。根据每个时间点2000个像素的阈值，将眼睛分为“高srf”和“低srf”两组。图3显示，在每个时间点，叠加srf的darc计数在具有大面积srf积累的眼睛中显著增加(在6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月分别为p＝0.002，＜0.0001，0.0019，0.0016，0.0026和0.0118)。因此，srf越大，darc计数越高，所有独有darc计数大于5的眼睛，都与大面积srf积累相关联。事实上，在每个时间点叠加srf的darc斑点与6个月(spearman相关系数r＝0.65，p＝0.0001)、12个月(r＝0.72，p＜0.0001)、18个月(r＝0.60，p＝0.0006)、24个月(r＝0.57，p＝0.0012)、30个月(r＝0.67，p＜0.0001)和36个月(r＝0.59，p＝0.0008)的oct srf面积呈正相关。在图1中展示的单个darc斑点预测新srf区域的结果也可以支持这一结论。
[0125]
这证实了darc计数越大，发展的湿性amd的严重程度就越大。
[0126]
实施例4：darc识别兔子的早期血管生成
[0127]
通过玻璃体内滴注50ul含有1ug人源vegf(hvegf165-peprotech，伦敦，英国)建立血管生成的兔子模型。48小时后，给予静脉内anx776(0.2mg)，然后使用cslo的icga设置对兔子进行成像。
[0128]
发现所有接受hvegf处理的兔子眼睛，与未处理的对侧眼睛相比，在治疗后2天显示出darc阳性着色。图4显示了每只动物的两只眼睛的darc图像，与未处理的右侧眼睛(d-f)相比，左侧(a-c)hvegf处理的眼睛中darc斑点清晰可见，处理的眼睛显示出显著增加(p＝0.0203，g)。与对照(插图d-f)相比，所有接受处理的眼睛在4天后都显示出荧光素渗漏，如插图a-c所示。
[0129]
这进一步证实了darc对早期血管生成的预测和识别价值。
[0130]
实施例5：darc可用于监测抗血管生成治疗的功效
[0131]
在如实施例4所述的血管生成兔子模型中局部施用抗血管生成治疗药物雷珠单
抗。局部雷珠单抗处理降低了血管生成的darc标记(图4h-j)。与空白对照相比，局部雷珠单抗显著降低了darc计数(图4o，p＝0.0262)。
[0132]
图5显示了局部雷珠单抗治疗功效的确认。与雷珠单抗处理的眼睛(g-i)相比，所有接受hvegf处理的对照兔子眼睛在4天后都有荧光素渗漏(图5a-c)。在给予1％的荧光素钠后8分钟(d-f)和20分钟(a-c，g-i)采集图像。该图证实了局部雷珠单抗治疗降低了体内血管渗漏。这进一步证实了darc监测治疗功效的能力。
[0133]
纳入标准
[0134]
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
[0135]
1.年龄≥18岁。
[0136]
2.受试眼的光学介质清晰。
[0137]
3.屈光误差不高于等效球镜10d，在资格评估时，最佳矫正视力等于6/24或更好。
[0138]
4.女性在生育年龄，已确认未怀孕，并同意进行怀孕测试。
[0139]
5.受试者具有同意的能力，本人已签署知情同意文件并写明日期，表明他们已经了解了本研究的所有相关方面。
[0140]
排除标准
[0141]
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
[0142]
1.存在严重、不稳定或无法控制的全身性疾病。
[0143]
2.已知对imp过敏。
[0144]
3.体重＜40公斤或＞150公斤。
[0145]
4.无法配合研究或者随访程序。
[0146]
5.任何已知有凝血疾病(包括dvt深静脉血栓)史的受试者，以及正在服用抗凝药物的受试者。
[0147]
6.过去3个月内或在试验期间计划在受试眼中进行手术。
[0148]
7.怀孕或哺乳期，或在试验期间(以及注射研究药物后的30天)未使用适当的避孕措施*。
[0149]
8.当前正在接受癌症或任何其他可能对参与该研究产生不利影响的疾病治疗。
[0150]
9.艾滋病/hiv感染。
[0151]
10.酗酒或吸毒史。
[0152]
11.活动性眼色素层炎史。
[0153]
12.系统性血管炎、结缔组织病史或正在接受癌症治疗。
[0154]
13.有先前视网膜血管病变的证据。
[0155]
14.患有影响配合研究的晚期疾病或精神疾病。
[0156]
15.合作研究者认为，可能增加参与风险或干扰对研究结果的解释的任何其他疾病、病症或实验室异常，研究者的判断会排除受试者进入该研究。
[0157]
16.中央角膜厚度小于450pm或大于650pm。
[0158]
17.当前或在过去3个月内曾入组另一种试验用药的临床试验。
[0159]
18.视网膜激光光凝治疗史。
[0160]
19.光学介质混浊或视网膜病理或弱视显著影响视力、视野测试或视网膜成像。
[0161]
20.研究者认为受试者不适合参与该试验的任何其他病症或病理过程。
[0162]
表1：纳入和排除标准
[0163][0164]
表2：人口统计学特征和基线特征
[0165][0166]
表3：随访总结
[0167][0168]
表4：特有darc点预测眼睛新arf的精确度
[0169][0170]
表5：darc dl和yim dl系统预测值的比较和已公布的湿性amd发展的转化率
[0171]
参考文献
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技术特征：
1.一种标记的细胞应激标志物，其用于识别或预测受试者中的血管生成的用途。2.如权利要求1所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述细胞应激标志物为一种膜联蛋白或其片段或变体。3.如权利要求2所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述细胞应激标志物为膜联蛋白5、11、2或6。4.如权利要求1-3任一项所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述标记为荧光标记。5.如权利要求4所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述荧光标记具有红外光谱中的波长。6.如权利要求4或权利要求5所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述荧光标记为d-776。7.如前述任一权利要求所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述血管生成为生理性的、治疗性的或者病理性的血管生成。8.如权利要求7所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述生理性的血管生成与受试者先前的运动相关。9.如权利要求7所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述治疗性的血管生成与受试者伤口愈合和/或组织工程支架的整合相关。10.如权利要求7所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述病理性的血管生成与疾病、疾病阶段、疾病严重程度相关，或者可预测疾病发展。11.如权利要求10所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述病理性血管生成预测疾病发展。12.如权利要求10或权利要求11所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述疾病包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、过敏性疾病、镰状细胞病和/或眼部疾病。13.如权利要求12所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述疾病包括眼部疾病。14.如权利要求13所述的标记的细胞应激标志物的用途，其特征在于，所述眼部疾病包括年龄相关性黄斑变性(amd)，可选地包括湿性amd。15.一种识别或预测受试者中血管生成的方法，所述受试者已被施用标记的细胞应激标志物，所述方法包括步骤：(a)使用第一成像装置生成来自受试者的图像；(b)识别图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞；其中如果在图像中识别出标记的细胞应激标志物阳性的细胞，则识别或预测血管生成。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞应激标志物为膜联蛋白或其片段或变体。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述细胞应激标志物为膜联蛋白5、11、2或6。18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记为荧光标记。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述荧光标记具有红外光谱中的波长。
20.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其特征在于，所述荧光标记为d-776。21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述血管生成为生理性的、治疗性的或病理性的血管生成。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生理性的血管生成与受试者先前的运动相关。23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述治疗性的血管生成与伤口愈合和/或组织工程支架的整合相关。24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述病理性的血管生成与疾病、疾病阶段、预测疾病发展或严重程度相关。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述病理性的血管生成预测疾病的发展。26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其特征在于，所述疾病包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病、过敏性疾病、镰状细胞病和/或眼部疾病。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述疾病包括眼部疾病。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述眼部疾病包括年龄相关性黄斑变性(amd)，可选地包括湿性amd。29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括针对所识别的疾病、疾病阶段、疾病严重程度或预测的疾病施用适当的治疗。30.如权利要求15-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记的细胞应激标志物为静脉内、鼻内或局部施用。31.如权利要求15-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述识别标记的细胞应激标志物阳性的细胞包括对所述图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞的数量进行计数。32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述标记的细胞应激标志物阳性的细胞的识别由计算机执行。33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其特征在于，所述的方法进一步包括确定所述标记的细胞应激标志物阳性的细胞在受试者中的位置。34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述位置通过使用第二成像装置获得的另一图像来确定。35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述第二成像装置包括计算机断层(ct)扫描仪、磁共振成像(mri)扫描仪、位置发射断层(pet)扫描仪、偏振器、反射图像扫描仪、眼底照相机和/或oct扫描仪。36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第二成像装置包括oct扫描仪。37.如权利要求15-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一成像装置包括共聚焦扫描激光显微镜，可选地包括共聚焦扫描激光检眼镜(cslo)。38.一种标记的细胞凋亡标志物，其用于识别受试者身体部分(除眼睛以外)中的细胞凋亡。39.如权利要求38所述的标记的细胞凋亡标志物，其特征在于，所述身体部分不在中枢神经系统中。

技术总结
本发明提供一种用于识别或预测受试者中血管生成的标记的细胞应激标志物。还提供了一种识别或预测受试者中血管生成的方法，该受试者已被施用标记的细胞应激标志物。该方法包括步骤：(a)使用第一成像装置生成来自受试者的图像，以及(b)识别图像中标记的细胞应激标志物阳性的细胞。如果在图像中识别出标记的细胞应激标志物阳性细胞，则可以识别或预测血管生成。成。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：诺维有限公司
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2023/10/5