一种四氯化碳诱导肝损伤的TLR5信号通路活化抑制模拟方法与流程

一种四氯化碳诱导肝损伤的tlr5信号通路活化抑制模拟方法
技术领域
1.本发明涉及医疗领域，尤其涉及一种四氯化碳诱导肝损伤的tlr5信号通路活化抑制模拟方法。


背景技术：

2.toll样受体(toll-like receptors，tlrs)是一类模式识别受体(pattern recognition receptors，prrs)，其通过识别一系列外源性病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，pamps)或内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecularpatterns，damps)介导免疫应答反应以实现对病原体的清除和组织损伤修复。越来越多的研究发现，tlrs相关功能的失调与包括肝炎、肝纤维化、肝硬化乃至肝癌等肝脏疾病的发生发展密切相关，如tlr2、tlr3、tlr4、tlr9等介导的炎性免疫反应会加重肝脏组织的损伤，而tlr2-/-、tlr3-/-、tlr4-/-、tlr9-/-小鼠则对多种有害因素诱导的肝脏损伤具有不同程度的耐受。而tlr5是唯一一个以蛋白质(细菌鞭毛蛋白)作为配体的prrs，且其诱导的免疫应答相对“温和”，在介导抗凋亡、抗氧化效应的同时，不会像lps等pamps一样会强烈诱导tnf-α、il-1β等细胞因子风暴相关因子的产生，因而基于tlr5的激动剂被广泛应用在辐射损伤防治、化疗毒副作用减轻、肿瘤免疫治疗等领域。而作为tlr5配体分子的细菌鞭毛蛋白是肠道中含量最为丰富的pamps之一，二者间相互作用势必对肠-肝轴以及肝脏健康状态的维持产生重要的影响。肝脏是cblb502蛋白(一种经过人工改构的沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物)发挥抗辐射、抗肿瘤活性的主要靶器官。cblb502蛋白可以直接作用于肝实质细胞上的tlr5，活化nf-κb及其下游信号通路，抵抗fas抗体诱导的肝实质细胞坏死和凋亡。
3.四氯化碳诱导的肝损伤模型是模拟肝毒性物质诱导急、慢性肝脏疾病的经典模型，有研究报道tlr5信号通路活化能够通过上调抗炎性的il-1受体拮抗剂(il-1ra)抑制肝纤维化进程。然而，tlr5信号在急性肝损伤中作用不明显，无法发挥其确切作用。


技术实现要素：

4.针对现有tlr5信号在急性肝损伤中作用有限的问题，本发明提供一种四氯化碳诱导肝损伤的tlr5信号通路活化抑制模拟方法，包括以下步骤：
5.1)建立小鼠肝损伤模型
6.小鼠禁食过夜后腹腔单次注射四氯化碳，四氯化碳暴露后12、24、48、72h收集小鼠肝组织或血清样本；
7.2)rna的提取及real-time pcr检测mrna水平
8.取50mg左右小鼠肝组织，用rnazol试剂提取总rna，测定浓度和纯度后，按照试剂盒说明书将提取的rna反转录为cdna，进行real-time pcr反应；
9.3)小鼠肝脏免疫细胞的制备和流式分析
10.小鼠麻醉后脱颈处死，肝组织称重后剪碎，用10ml 0.05％ⅳ型胶原酶37℃消化30
分钟，将消化的肝组织分离培养后采用flowjo软件分析；
11.4)肝组织he及免疫组化染色
12.4％多聚甲醛固定的肝组织样品，石蜡包埋，切片机切成4μm厚的切片，随后进行he和免疫组织化学染色；
13.5)统计学处理
14.所有数据分析均采用graphpad prism 8.0.2作图软件，计量资料用均值
±
标准误表示，两组间数据采用t检验，组间动物的生存分析采用kaplan-meier方法中的log-rank test检验，p《0.05认为差异有统计学意义。
15.具体地，本发明小鼠为7周龄雄性小鼠。
16.进一步，步骤1)中，所述四氯化碳的注射量为0.1ml/kg，用于急性肝损伤模型制备；注射量为3.0ml/kg，用于动物存活率分析。步骤2)中，反应体系为20μl，反应程序为95℃、3min，1个循环；95℃、10s，60℃、40s，40个循环；60℃、1min，95℃、1s，1个循环；β-actin作为内参，用2(-ct)法计算目的基因mrna相对表达量。步骤3)对消化的肝组织分离培养的操作为：2ml的注射器推头在4℃预冷的pbs中研磨消化的肝组织，过40μm细胞筛，细胞悬液于4℃，50
×
g离心3分钟，弃沉淀，重复两次，上清于4℃，320
×
g离心5分钟，沉淀用10ml 30％percol重悬；4℃，800
×
g离心15分钟，离心升速和降速均调为5；细胞沉淀用pbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟；沉淀用红细胞裂解液裂解后，pbs清洗，加入含2％fbs的pbs重悬；调整细胞浓度为1
×
106个/ml，取出100μl细胞悬液与待检测抗体4℃避光孵育30分钟，2ml pbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟，沉淀用300μl pbs重悬后上机检测分析。
附图说明
17.图1为cblb502抑制四氯化碳诱导急性肝损伤的时效、量效关系。
18.图2为cblb502蛋白减轻四氯化碳诱导的急性肝损伤。
19.图3为cblb502蛋白加快四氯化碳损伤后的肝细胞增殖。
20.图4为cblb502抑制四氯化碳暴露后肝组织中性粒细胞浸润。
21.图5为cblb502抑制四氯化碳暴露后肝组织中趋化因子表达。
22.图6为cblb502蛋白促进四氯化碳诱导肝衰竭小鼠的存活。
具体实施方式
23.以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.一、模拟分析
25.1.1动物
26.c57bl/6雄性spf级小鼠，7周龄，体质量20-22g，购自北京维通利华动物技术有限公司，动物质量合格证号：scxk(京)2016-0006。动物前饲养于军事科学院军事医学研究院动物中心spf级动物房，动物饲养设施合格证号：syxk(军)2017-c023。所有动物均遵循动物管理与使用委员会批准的方案(伦理审查编号：iacuc-dwzx-2019-004)。
27.1.2小鼠肝损伤模型
28.所有小鼠均在禁食过夜后腹腔单次注射四氯化碳，其中四氯化碳0.1ml/kg体重暴
露用于急性肝损伤模型制备，3.0ml/kg体重暴露用于动物存活率分析。于四氯化碳暴露后12、24、48、72h收集小鼠肝组织或血清样本，用于he染色、免疫组化、流式分析、real-time pcr或血清转氨酶测定。
29.1.3试剂
30.重组cblb502蛋白(军事科学院军事医学研究院生命组学研究所制备)；四氯化碳(国药集团化学试剂有限公司)；流式抗体：小鼠cd45.2-pe、fixable viability dye-ef780、cd11b-bv605、ly6g-ef450(ebioscience公司)；四型胶原酶(sigma公司)；percoll细胞分离液(ge公司)；逆转录试剂盒(thermo公司)；green realtime pcr master mix(toyobo公司)；trizol reagent(vigorous公司)；depc(vwr公司)；红细胞裂解液(biolegend公司)；胎牛血清(康源生物公司)；引物(上海生工生物工程有限公司，序列见表1)。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)(sigma公司)。mouse anti-brdu、anti-ly6g抗体(武汉塞维尔生物科技有限公司)。
31.1.4rna的提取及real-time pcr检测mrna水平
32.取50mg左右小鼠肝组织，用rnazol试剂提取总rna，测定浓度和纯度后，按照试剂盒说明书将提取的rna反转录为cdna，进行real-time pcr反应，反应体系20μl。反应程序为95℃3min，1个循环；95℃10s、60℃40s，40个循环；60℃1min、95℃1s，1个循环。β-actin作为内参，用2(-ct)法计算目的基因mrna相对表达量。引物序列见表1。
33.表1.real time pcr引物序列
[0034][0035]
1.5小鼠肝脏免疫细胞的制备和流式分析
[0036]
小鼠麻醉后脱颈处死，肝组织称重后剪碎；用10ml 0.05％ⅳ型胶原酶37℃消化30分钟；2ml的注射器推头在4℃预冷的pbs中研磨消化的肝组织，过40μm细胞筛；细胞悬液于4℃，50
×
g离心3分钟，弃沉淀，重复两次；上清于4℃，320
×
g离心5分钟，沉淀用10ml 30％percol重悬；4℃，800
×
g离心15分钟，此步离心升速和降速均调为5；细胞沉淀用pbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟；沉淀用红细胞裂解液裂解后，pbs清洗，加入含2％fbs的pbs重悬。调整细胞浓度为1
×
106个/ml；取出100μl细胞悬液与待检测抗体4℃避光孵育30分钟；2ml pbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟；沉淀用300μlpbs重悬后上机检测，检测数据用flowjo软件分析(版本号：v10)。
[0037]
1.6肝组织he及免疫组化染色
[0038]
4％多聚甲醛固定的肝组织样品，石蜡包埋，切片机切成4μm厚的切片，随后进行he和免疫组织化学染色。
[0039]
1.7统计学处理
[0040]
所有数据分析均采用graphpad prism 8.0.2作图软件，计量资料用均值
±
标准误表示，两组间数据采用t检验；组间动物的生存分析采用kaplan-meier方法中的log-rank test检验，p《0.05认为差异有统计学意义。
[0041]
二、结果
[0042]
2.1cblb502蛋白减轻四氯化碳诱导的急性肝损伤
[0043]
为了探究tlr5信号通路活化对于四氯化碳暴露后肝脏损伤修复的影响，野生型c57bl/6小鼠分别在四氯化碳暴露前24、12、1h，暴露后即刻以及暴露后1、6h经腹腔注射单一剂量的tlr5激动剂cblb502蛋白(0.2mg/kg)，四氯化碳暴露后12h检测动物血清转氨酶水平。结果表明，不同时间点给予cblb502蛋白均能明显抑制动物血清alt、ast水平，其中以四氯化碳暴露前12h给药效果最优，其血清alt、ast水平较模型对照组均下降了90％以上(图1a)。而将cblb502蛋白给药剂量降到0.05mg/kg和0.025mg/kg，给药时间定在四氯化碳暴露前12h时，其仍然显著抑制了肝脏损伤，且以0.2mg/kg剂量组效果最好，表现为血清转氨酶显著降低和肝脏局部组织坏死面积的显著减小(图1b)，提示tlr5信号通路的活化能明显抑制四氯化碳诱导的氧化性肝损伤。
[0044]
动物均在四氯化碳暴露前12h按体重给予0.2mg/kg的cblb502蛋白。结果显示在四氯化碳暴露后24、48、72h，与pbs组相比，cblb502蛋白给药组小鼠血清alt、ast水平均显著降低(图2a)，肝局部组织炎性坏死明显减轻(图2b)。
[0045]
2.2cblb502蛋白加快四氯化碳损伤后的修复
[0046]
肝脏实质细胞的增殖是反映肝脏损伤修复和再生能力的客观指标。结果显示，在四氯化碳暴露后24h，亦即肝脏损伤最严重的时期，cblb502给药组动物肝脏局部组织肝实质细胞的增殖较pbs组显著加快，体现为brdu掺入阳性细胞数目显著升高；四氯化碳暴露后48h，pbs组和cblb502组肝细胞brdu的掺入都达到高峰，pbs组肝细胞增殖在四氯化碳暴露后72h仍维持在很高的水平，而cblb502组则明显降低(图3)，提示pbs组动物肝脏损伤较重，损伤后修复的时间延长。以上结果表明，cblb502蛋白加快了四氯化碳损伤后修复。
[0047]
2.3cblb502蛋白抑制四氯化碳损伤后肝内中性粒细胞的募集
[0048]
中性粒细胞参与的氧化应激反应在四氯化碳诱导的化学性肝损伤致病过程中发挥了重要作用，如图4所示，cblb502预防给药对肝损伤过程中中性粒细胞浸润的影响，四氯化碳暴露后24至72h，cblb502给药组动物肝组织中中性粒细胞(cd11b
+
ly6g
+
)比例较pbs组均有不同程度降低(图4a)；免疫组织化学染色结果亦表明，cblb502组动物各时间点肝脏局部组织中ly6g
+
阳性染色的细胞数目均显著低于pbs组(图4b)。造成这种中性粒细胞浸润减少的原因并非是cblb502诱导或加快了中性粒细胞凋亡所致，因为流式分析结果显示四氯化碳暴露后24、48h，两组动物肝组织内中性凋亡比例相当(图5a)。然而，real-time pcr分析结果表明，四氯化碳暴露后3至6h，cblb502组动物肝组织中与ccil-1βmrna表达水平较pbs组明显下调(图5b)，以上结果提示抑制中性粒细胞肝内浸润可能是cblb502蛋白抑制四氯化碳诱导肝损伤的原因之一。
[0049]
2.4cblb502蛋白促进四氯化碳诱导肝衰竭小鼠的存活
[0050]
肝毒性物质诱发的急性肝衰竭往往是导致病亡的直接原因，如图6所示，cblb502对致死剂量四氯化碳暴露(3ml/kg)时小鼠存活率的影响。结果显示pbs对照组小鼠在四氯化碳暴露后5个小时即开始死亡，100h后的存活率仅有10％，而cblb502给药组小鼠则在四氯化碳暴露后25h才开始死亡，100h后的存活率为40％，较pbs组显著改善。
[0051]
本研究发现外源性tlr5信号通路的活化能显著抑制四氯化碳诱导的急性肝损伤。tlr5激动剂cblb502蛋白预防给药除了显著提高动物存活率，减轻肝脏局部组织的炎性损
伤外，另外一个显著的特征是显著减少肝内中性粒细胞浸润。在四氯化碳诱导的急性肝损伤模型中，局部肝细胞坏死会激活库普弗细胞，释放炎性细胞因子、趋化分子，早期中性粒细胞的募集和浸润有益于清除凋亡或坏死细胞，促进损伤后的修复和再生，但持续性的中性粒细胞浸润和活化又会通过释放ros或蛋白酶类物质进一步加剧肝损伤。在本研究中cblb502预处理也能在一定程度上抑制il-1β表达水平的上升，提示炎性反应的抑制也有可能是导致肝脏损伤减轻的原因。本发明提供了一种tlr5信号通路活化对四氯化碳诱导的急性肝损伤的抑制作用的模拟方法，易于操作且效果明显，为后续开发基于tlr5靶点的肝脏疾病防治药物提供重要的理论基础和实验依据。
[0052]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种四氯化碳诱导肝损伤的tlr5信号通路活化抑制模拟方法，其特征在于，包括以下步骤：1)建立小鼠肝损伤模型小鼠禁食过夜后腹腔单次注射四氯化碳，四氯化碳暴露后12、24、48、72h收集小鼠肝组织或血清样本；2)rna的提取及real-timepcr检测mrna水平取50mg左右小鼠肝组织，用rnazol试剂提取总rna，测定浓度和纯度后，按照试剂盒说明书将提取的rna反转录为cdna，进行real-timepcr反应；3)小鼠肝脏免疫细胞的制备和流式分析小鼠麻醉后脱颈处死，肝组织称重后剪碎，用10ml0.05％ⅳ型胶原酶37℃消化30分钟，将消化的肝组织分离培养后采用flowjo软件分析；4)肝组织he及免疫组化染色4％多聚甲醛固定的肝组织样品，石蜡包埋，切片机切成4μm厚的切片，随后进行he和免疫组织化学染色；5)统计学处理所有数据分析均采用graphpadprism8.0.2作图软件，计量资料用均值
±
标准误表示，两组间数据采用t检验，组间动物的生存分析采用kaplan-meier方法中的log-ranktest检验，p<0.05认为差异有统计学意义。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠为7周龄雄性小鼠。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述四氯化碳的注射量为0.1ml/kg，用于急性肝损伤模型制备；注射量为3.0ml/kg，用于动物存活率分析。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，反应体系为20μl，反应程序为95℃、3min，1个循环；95℃、10s，60℃、40s，40个循环；60℃、1min，95℃、1s，1个循环；β-actin作为内参，用2(-ct)法计算目的基因mrna相对表达量。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)对消化的肝组织分离培养的操作为：2ml的注射器推头在4℃预冷的pbs中研磨消化的肝组织，过40μm细胞筛，细胞悬液于4℃，50
×
g离心3分钟，弃沉淀，重复两次，上清于4℃，320
×
g离心5分钟，沉淀用10ml30％percol重悬；4℃，800
×
g离心15分钟，离心升速和降速均调为5；细胞沉淀用pbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟；沉淀用红细胞裂解液裂解后，pbs清洗，加入含2％fbs的pbs重悬；调整细胞浓度为1
×
106个/ml，取出100μl细胞悬液与待检测抗体4℃避光孵育30分钟，2mlpbs洗一遍，4℃，800
×
g离心5分钟，沉淀用300μlpbs重悬后上机检测分析。

技术总结
本发明公开了一种四氯化碳诱导肝损伤的TLR5信号通路活化抑制模拟方法，包括建立小鼠肝损伤模型、RNA的提取及Real-timePCR检测mRNA水平、小鼠肝脏免疫细胞的制备和流式分析、肝组织HE及免疫组化染色和统计学处理五个步骤。本发明提供了一种TLR5信号通路活化对四氯化碳诱导的急性肝损伤的抑制作用的模拟方法，易于操作且效果明显，为后续开发基于TLR5靶点的肝脏疾病防治药物提供重要的理论基础和实验依据。和实验依据。和实验依据。


技术研发人员：吴雪 李慧 杨艳
受保护的技术使用者：淄博市中心医院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/10/6