一种与牦牛生长性状相关的SNP分子标记及其应用

一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.牦牛主要分布在生态环境极其严酷的高寒高山草原，是青藏高原及周边地区特有的牛种资源和主导畜种，不仅能够为当地人民提供肉、奶、毛等重要生活资料，其粪便也能够作为燃料，因此，牦牛被称为“全能家畜”。牦牛产业是我国青藏高原地区的特色主导产业和区域优势产业，对于藏区农牧业发展、人民增收具有重要意义。但由于牦牛分布区域、生产条件的限制，尤其受自然环境的影响，牦牛生产水平低，产业效能不强。因此，提升牦牛生产性能，促进牦牛产业发展具有重要意义。
3.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)是基因组dna序列最基本的变异形式，由dna序列中的单个碱基突变引起的，该突变将一个核苷酸替换为另一个核苷酸。snp在基因内或某一调控区域的出现可能对基因功能产生直接影响。因此，这些snp变异可以作为定位与某些性状相关的基因的生物标记，广泛应用于标记辅助育种、连锁分析和生物多样性研究
4.叉头转录因子1(forkhead box o 1，foxo1)基因是参与骨骼肌分化的调节因子和共有成分其作为早期分子调节因子，能参与激素的激活途径、成骨细胞的糖代谢途径，也是脂肪和肌肉组织代谢的递质。foxo1基因能调节转录活性，并且有许多磷酸化位点，其不仅通过参与翻译来调节脂肪生成，而且还通过多种蛋白质相互作用抑制脂肪生成。此外，foxo1是一种重要的营养敏感转录因子，可调节参与糖异生、糖原分解和能量稳态的胰岛素敏感基因的表达和活性，从而影响葡萄糖代谢。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记及其应用，通过寻找与牦牛生长性状相关的snp位点作为分子标记，为生长性状优秀的牦牛的选育提供可靠的工具，同时加快育种进程。具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记，述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。
7.第二方面，本发明提供了一种检测与牦牛生长性状相关的snp分子标记的试剂在检测牦牛生长性状中的应用，所述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。
8.优选地，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc。
9.优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。
10.优选地，所述含有snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的snp分子标记位于第593位。
11.第三方面，本发明提供了一种检测与牦牛生长性状相关的snp分子标记的试剂在牦牛生长性状早期育种中的应用，所述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。
12.优选地，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc。
13.优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。
14.优选地，所述含有snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的snp分子标记位于第593位。
15.第四方面，本发明提供了一种扩增含有上述第一方面所述snp分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛生长性状中的应用；所述的特异性引物对序列为：
16.f：5
’‑
ctgatcagtgcctgtatgtgctt-3’；
17.r：5
’‑
aggtccacagaaatcagagcttc-3’。
18.优选地，实现检测牦牛生长性状的方法包括：
19.(1)提取牦牛血液基因组dna为模板dna；
20.(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
21.(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc。
22.第五方面，本发明提供了一种扩增含有上述第一方面所述snp分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于牦牛生长性状早期育种中的应用；所述的特异性引物对序列为：
23.f：5
’‑
ctgatcagtgcctgtatgtgctt-3’；
24.r：5
’‑
aggtccacagaaatcagagcttc-3’。
25.优选地，实现牦牛生长性状早期育种的方法包括：
26.(1)提取牦牛血液基因组dna为模板dna；
27.(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
28.(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc；选取基因型为tt的牦牛个体进行早期育种。
29.本发明的有益效果是：本发明通过分析位点基因型与牦牛生长性状的相关性，发现与牦牛生长性状相关的snp位点，基因型为tt的牦牛个体的体重和胸围显著高于ct基因型个体生长性状的表型值(p《0.05)，并通过pcr与基因测序法可快速鉴定对应性状。因此，生产中可优先选择该位点基因型为tt型个体作为亲本进行规模养殖。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1本发明实施例提供的snp分子标记位点处的测序峰图；
32.图2本发明实施例提供的snp分子标记位点处的基因分型图。
具体实施方式
33.本发明通过对牦牛叉头转录因子1(forkhead box o 1)基因片段(序列为seq id no.1)上连续设计多对引物对牦牛dna进行pcr扩增，并对其进行基因测序，其中一对引物(seq id no.2和seq id no.3)扩增的目的片段进行基因型分析时发现了一个snp位点，通过mega5.1和seqman软件分析，筛查出一个snp位点位于序列seq id no.1的片段的第593位点处，位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位。通过pcr和基因测序对牦牛个体的dna进行snp位点的基因分型，再通过spss19.0软件分析牦牛个体的突变位点的基因型与生长性状的相关性，发现基因型为tt个体的体重和胸围显著高于ct基因型个体生长性状的表型值(p《0.05)。
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
35.实施例1检测牦牛foxo1基因snp分子标记位点
36.(1)阿什旦牦牛样本采集
37.本发明以阿什旦牦牛品种作为检测对象，从青海省大通种牛场采集了351头生长数据资料完善的阿什旦牦牛的血液样本。
38.(2)基因组dna的分离、提取、纯化
39.使用easy pure blood genomic dna kit试剂盒从阿什旦牦牛血液样本中提取基因组dna。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳和thermo scientific nano drop 2000c检测dna的质量和浓度。
40.(3)引物设计及筛选
41.根据genebank公布的牦牛foxo1基因(genebank登录号为nw__005394190.1)，利用引物设计软件primer 5.0在其dna序列上设计多对引物，对牦牛dna混池进行pcr扩增，并对基因测序结果进行分析，筛选出一对存在snp位点的引物，其引物序列信息如下：
42.f：5
’‑
ctgatcagtgcctgtatgtgctt-3’(seq id no.2所示)；
43.r：5
’‑
aggtccacagaaatcagagcttc-3’(seq id no.3所示)。
44.(4)目标基因片段pcr扩增
45.pcr反应体系为25μl：2
×
pcr supermix(+dye)12.5μl，dna模板(100ng/μl)1μl，上、下游引物(10μmol/l)各1μl，无酶无菌水9.5μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；
94℃变性30s，退火温度下退火30s(退火温度见表3-2)，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃冷却。扩增结束后将扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测。
46.(5)基因测序
47.经检测合格后的pcr反应液送往西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行双向的sanger测序。其扩增的目的序列如seq id no.1所示，snp位点位于seq id no.1所示序列的593位。突变位点处的测序峰图如图1所示。
48.实施例2牦牛foxo1基因snp分子标记位点不同基因型与生长性状的相关性
49.(1)基因分型
50.所有个体重复实施例1中的(4)、(5)步骤，根据基因测序结果确定不同个体的具体基因型。在检测群体中检测到三种基因型，基因型频率和等位基因频率如表1所示，群体基因分型结果如图2所示。
51.对351头牦牛血液dna样品采用pcr和基因测序进行基因分型发现，牦牛foxo1基因snp分子标记位点存在三种基因型，分别为纯合型cc、杂合型ct、纯合型tt。三种基因型频率为0.273(tt)、0.553(tc)和0.174(cc)，哈代-温伯格平衡检验结果如表1所示，表明，该位点处于hardy-weinberg平衡状态(p》0.05)。
52.表1牦牛foxo1基因snp位点的基因型和等位基因频率
[0053][0054]
(2)snp基因型与生长性状表型值关联分析
[0055]
利用spss19.0软件对seq id no.1的片段上的593位的snp位点的三种基因型与牦牛体重、体高、体斜长和胸围的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该snp位点基因型与生长性状的关联性，结果见表2。
[0056]
采用的模型如下：
[0057]
yj＝μ+gj+ej；其中yj表示观察到的生长性状值；gj代表基因型j的遗传效应；
μ
代表每个性状的总平均值；ej表示随即残差效应。各组数据间的差异采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean
±
se表示。
[0058]
表2牦牛foxo1基因多态性与生长性状的关联分析
[0059]
[0060]
注：在同一行中不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，具有相同小写字母表示差异不显著(p》0.05)。
[0061]
由表2可知，基因型为tt纯合型个体的体重和胸围显著高于ct与cc基因型个体生长性状的表型值(p》0.05)。
[0062]
通过检测本发明的snp位点所筛选的牦牛tt基因型个体，其生长性状显著优于ct型个体。因此，在牦牛育种过程中，可将tt型个体选留下来，从而提高牦牛生产性能。
[0063]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。2.一种检测与牦牛生长性状相关的snp分子标记的试剂在检测牦牛生长性状中的应用，其特征在于，所述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。3.一种检测与牦牛生长性状相关的snp分子标记的试剂在牦牛生长性状早期育种中的应用，其特征在于，所述snp分子标记位于牦牛参考基因组bosgru_v2.0版本genebank登录号为nw__005394190.1的第471466位，突变碱基为c或t。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述snp分子标记的核苷酸序列的引物对。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含有snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的snp分子标记位于第593位。7.扩增含有权利要求1所述snp分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛生长性状中的应用；所述的特异性引物对序列为：f：5
’‑
ctgatcagtgcctgtatgtgctt-3’；r：5
’‑
aggtccacagaaatcagagcttc-3’。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，实现检测牦牛生长性状的方法包括：(1)提取牦牛血液基因组dna为模板dna；(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc。9.扩增含有权利要求1所述snp分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于牦牛生长性状早期育种中的应用；所述的特异性引物对序列为：f：5
’‑
ctgatcagtgcctgtatgtgctt-3’；r：5
’‑
aggtccacagaaatcagagcttc-3’。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，实现牦牛生长性状早期育种的方法包括：(1)提取牦牛血液基因组dna为模板dna；(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛血液的基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；(3)将步骤(2)获得的pcr扩增产物纯化，进行基因分型检测，所述snp分子标记碱基为t时，基因型为tt；所述snp分子标记碱基为c时，基因型为cc或ct；所述基因型tt牦牛个体的体重和胸围显著高于基因型ct和cc；选取基因型为tt的牦牛个体进行早期育种。

技术总结
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种与牦牛生长性状相关的SNP分子标记及其应用。本申请所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组BosGru_v2.0版本GeneBank登录号为NW__005394190.1的第471466位，突变碱基为C或T。本发明还公开了该分子标记的检测方法及其在牦牛性状关联分析中的应用，该分子标记可应用于牦牛生长性状辅助选择育种，检测方法快速、准确；通过筛选该SNP分子标记的基因型能够加快牦牛相关生长性状的育种进展,节省育种成本,提高牦牛养殖的经济效益。种成本,提高牦牛养殖的经济效益。种成本,提高牦牛养殖的经济效益。


技术研发人员：梁春年 孟光耀 吴晓云 喇永富 褚敏 马晓明 包鹏甲 郭宪 裴杰
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/6