人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法

人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法
技术领域：
：1.本发明涉及一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，属于生物检测
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的dna肿瘤病毒。人乳头瘤病毒(hpv)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。hpv在99％宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同hpv基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且hpv感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。3.研究表明与基因型分析有关的是hpv基因组图谱中那些显示特定类型多态性的区域。hpv基因组图谱中存在多个类型特异性序列变异性区域，但编码主要衣壳蛋白的晚期区域基因l1似乎是最具多态性的1-4。此外，早期区域基因e6和e7存在序列多态性5-7。这些序列的差异赋予个体hpv类型不同程度的致癌转化潜力，它们也可用于开发特定类型的分子测试。l1基因片段最常用于基于pcr的基因分型分析1,3。引物选自位于多态性、类型特异性序列两侧的保守或共有序列。4.目前主要有3类用于检测hpv的核酸杂交方法。第一类是直接探针结合法，如有hpv类型特异性探针的sourthern印迹和点印迹等法8,9。但其缺点是灵敏度低、技术耗时且需要大量纯化的hpv探针。5.第二类是信号放大法，但该类技术是不属于公共领域的专有技术。如美国digene公司的杂交捕获法(hybridcapture)，hc2是其拥有的专有核酸杂交信号放大系统，是目前美国获得fda批准并在国际上临床最广泛使用的一种检测hpvdna的检测技术。该技术主要是将针对包含要检测的hpv基因型的单个dna序列的特定rna探针与单束hpvdna杂交，通过化学发光检测到rna/dna杂交物。hc2能检测到的hpv基因型可分为以下风险等级：5种低风险hpv6、11、42、43和44型；以及13种高/中风险hpv类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。hc2可以检测出混合高危型hpv，但是不能检测出单一高危hpv基因型，因此其在hpv基因型的细分上能力有限。另外，hc2检测存在着高比率的假阴性和假阳性。6.第三类方法是基于pcr的靶序列片段扩增技术，应用pcr对特异性hpv靶序列片段进行扩增，用特异性的寡核苷酸探针鉴别hpv型别。此类检测法的优点是：取样简便，检测及结果报告人为因素影响极少，适合在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛。缺点是大多数pcr方法虽然通常仅用于研究用途测试，但通常涉及使用获得专利的hpv序列，由于法律或专有技术限制，限制了它们作为体外诊断测试的适用性。7.该类目前主要检测方法有：特异性pcr(type-specificpcr)法：该法根据e6、e7基因的变异区设计型特异性的引物进行pcr分析(walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个hpv拷贝每反应，随hpv型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份pcr，则导致无法高通量的使用。8.pcr技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个pcr循环。随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量呈指数倍数增加。9.dna的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的dna，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在pcr循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环pcr实验中要多次改变。10.pcr技术具有广泛的生物学应用，例如：dna序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染等。然而，在实际应用中，无论的常规pcr反应还是多重pcr反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性dna污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。11.在pcr反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。12.此外，现有pcr技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如hpv)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。13.综上所述，目前还缺乏在封闭反应体系中，对pcr扩增产物简便有效地进行定量或半定量转移的方法。14.洪国藩院士研究团队曾于2012年申请发明专利：多级pcr检测hpv的方法和试剂盒，该发明技术方案的主要创新点为采用多级pcr反应管，包括二个或多个可封闭的pcr反应腔或隔室，并且在至少两个隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，连接通道用于让携带pcr扩增产物的固体颗粒从上游隔室转移至下游隔室；对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，构成一个封闭空间，可有效消除pcr交叉干扰。15.此外，根据洪院士团队以往经验，大约有7％的人会同时感染多种hpv亚型，此时一代测序会出现套峰，无法准确分型。基于针对不同亚型的病毒设计特异性引物进行分型pcr，即一份样本需要用20多个pcr反应进行鉴别，同时需要分别电泳。该方法工作量较大，不适用于大规模的检测。亟待研发出改进的鉴别方法。16.以上内容涉及的参考文献如下：17.1.meyert,arndtr,stockflethe,flammannht,wolfh,reischlu.strategyfortypinghumanpapillomavirusesbyrflpanalysisofpcrproductsandsubsequenthybridizationwithagenericprobe.biotechniques.1995；19(4)：632-639.18.2.radypl,aranyi,hughestk,tyringsk.type-specificprimer-mediateddirectsequencingofconsensusprimer-generatedpcrampliconsofhumanpapillomaviruses：anewapproachforthesimultaneousdetectionofmultipleviraltypeinfections.journalofvirologicalmethods.1995；53(2-3)：245-254.19.3.gravittpe,peytoncl,alessitq,etal.improvedamplificationofgenitalhumanpapillomaviruses.journalofclinicalmicrobiology.2000；38(1)：357-361.20.4.coutléef,gravittp,kornegayj,etal.useofpgmyprimersinl1consensuspcrimprovesdetectionofhumanpapillomavirusdnaingenitalsamples.journalofclinicalmicrobiology.2002；40(3)：902-907.21.5.stephenal,thompsonch,tattersallmh,cossartye,rosebr.analysisofmutationsintheurrande6/e7oncogenesofhpv16cervicalcancerisolatesfromcentralchina.internationaljournalofcancer.2000；86(5)：695-701.22.6.karlsenf,kalantarim,jenkinsa,etal.useofmultiplepcrprimersetsforoptimaldetectionofhumanpapillomavirus.journalofclinicalmicrobiology.1996；34(9)：2095-2100.23.7.chowvt,lohe,yeowm,tansy,chanr.identificationofmultiplegenitalhpvtypesandsequencevariantsbyconsensusandnestedtype-specificpcrcoupledwithcyclesequencing.pathology.2000；32(3)：204-208.24.8.southernem.detectionofspecificsequencesamongdnafragmentsseparatedbygelelectrophoresis.journalofmolecularbiology.1975；98(3)：503-517.25.9.schiffmanmh,bauerhm,lorinczat,etal.comparisonofsouthernblothybridizationandpolymerasechainreactionmethodsforthedetectionofhumanpapillomavirusdna.journalofclinicalmicrobiology.1991；29(3)：573-577.技术实现要素：26.本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强。27.本发明解决其技术问题的技术方案如下：28.一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，包括以下步骤：29.第一步、采用dna提取试剂盒从目标样本中提取核酸dna；30.第二步、在封闭的反应管的lcnpcr第一次反应空间中，以hpv基因组dna为模板，通过hpv特异性的第一引物对进行第一级pcr反应扩增，从而获得一级扩增产物p1；将第一扩增产物p1从lcnpcr第一次反应空间转移至反应管的lcnpcr第二次反应空间中，作为第二级pcr反应的模板；在lcnpcr第二次反应空间中，通过hpv特异性的第二引物对进行第二级pcr反应扩增，从而获得二级扩增产物p2；31.第二级pcr反应采用染料法，并监测融解曲线；如果融解曲线没有特异峰则说明该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的hpv序列与hpv标准序列进行比对鉴别出hpv的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则转至第三步；32.第三步、对二级扩增产物p2进行第三级pcr反应获得三级扩增产物p3，经二代测序确定样本所含hpv的各个亚型；33.其中，第二级pcr反应所用第二引物对的各引物末端含有便于第三级pcr反应加入样本标签的特定片段。34.本发明进一步完善的技术方案如下：35.优选地，反应管内设有材质与反应管相同的薄膜，该薄膜将反应管的反应空间分成彼此独立的lcnpcr第一次反应空间和lcnpcr第二次反应空间；反应管的管壁外部设有与lcnpcr第一次反应空间对应的凹向管内的凹记号。36.优选地，薄膜高度为反应管封闭后内部空间高度的五分之四；反应管内放置的磁珠采用44dc钢球,直径1mm；反应管外配套的磁力棒采用钕铁硼特强磁铁棒。37.优选地，第二级pcr反应采用的第二引物对为：gp6+-f序列为seqidno.1，以及my11-r序列为seqidno.2。38.优选地，第三级pcr反应采用的引物包括indexp5和indexp7。其中，indexp5包括：afa1序列为seqidno.3；afa2序列为seqidno.4；afa3序列为seqidno.5；afa4序列为seqidno.6；afa5序列为seqidno.7；afa6序列为seqidno.8；afa7序列为seqidno.9；以及afa8序列为seqidno.10。39.indexp7包括：hcrp1序列为seqidno.11；hcrp2序列为seqidno.12；hcrp3序列为seqidno.13；hcrp4序列为seqidno.14；hcrp5序列为seqidno.15；hcrp6序列为seqidno.16；hcrp7序列为seqidno.17；hcrp8序列为seqidno.18；hcrp9序列为seqidno.19；hcrp10序列为seqidno.20；hcrp11序列为seqidno.21；以及hcrp12序列为seqidno.22。40.优选地，第一级pcr反应采用的引物对为：my09序列为seqidno.23；my11序列为seqidno.24。41.与现有hpv的检测技术相比，本发明通过薄膜将反应管分为两个反应空间，即两次扩增反应置于同一管中进行，通过磁珠和磁力棒配合操作进行产物的转移，减少开盖次数，减少外部污染的可能性；同时，采用染料法替代电泳法，直接对待测的扩增产物进行一代测序，去除琼脂糖凝胶电泳步骤，减少实验花费时间，提高实验效率；此外，在实验使用的引物上进行了改进，加入了一段特定片段，便于产物二代测序，通过将一代测序与二代测序相结合，提高实验灵敏度和特异性，减少假阳性和假阴性结果的出现，确保了实验结果的可靠性和准确性。附图说明42.图1为现有技术illumina测序平台片段连接示意图。43.图2为本发明实施例1采用的lcnpcr单管结构示意图。图中，★为epperdoffpcr(200μl)反应管，①为lcnpcr第一次反应空间，②为lcnpcr第二次反应空间，为薄膜，为凹记号，为磁珠，为磁力棒。44.图3至图8为本发明实施例1的测序结果图。具体地，图3对应1号样本hpv-16；图4对应2号样本hpv52；图5对应3号样本hpv18；图6对应4号样本hpv16；图7对应5号样本hpv16；图8对应6号样本hpv68。具体实施方式45.下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。46.实施例147.本实施例具体内容如下：48.1、材料与方法49.1.1、dna提取50.按照选择的dna提取试剂盒说明书进行操作，从样本中提取dna，-20℃保存待用。51.1.2、引物设计与合成52.以下所有引物均由苏州鸿讯生物技术有限公司合成。53.my09：5’‑cgtccmarrggawactgatc-3’(seqidno.23)；54.my11：5’‑gcmcagggwcataayaatgg-3’(seqidno.24)。55.gp6+-f：5’‑acgacgctcttccgatctgaaaaataaactgtaaatcatattc-3’(seqidno.1)；56.my11-r：5’‑acgtgtgctcttccgatctgcmcagggwcataayaatgg-3’(seqidno.2)。57.indexp5：58.afa1：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactgaaccttacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.3)；59.afa2：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactgctaagtacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.4)；60.afa3：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactgttctctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.5)；61.afa4：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactaagacacacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.6)；62.afa5：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacacctaatcgaacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.7)；63.afa6：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacacctagaacaacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.8)；64.afa7：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactaagttccacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.9)；65.afa8：5’‑aatgatacggcgaccaccgagatctacactagacctaacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seqidno.10)。66.indexp7：67.hcrp1：5’‑caagcagaagacggcatacgagatgtcgtgatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.11)；68.hcrp2：5’‑caagcagaagacggcatacgagataccactgtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.12)；69.hcrp3：5’‑caagcagaagacggcatacgagattggatctggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.13)；70.hcrp4：5’‑caagcagaagacggcatacgagatccgtttgtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.14)；71.hcrp5：5’‑caagcagaagacggcatacgagattgctgggtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.15)；72.hcrp6：5’‑caagcagaagacggcatacgagatgaggggttgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.16)；73.hcrp7：5’‑caagcagaagacggcatacgagataggttggggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.17)；74.hcrp8：5’‑caagcagaagacggcatacgagatgtgtggtggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.18)；75.hcrp9：5’‑caagcagaagacggcatacgagattgggtttcgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.19)；76.hcrp10：5’‑caagcagaagacggcatacgagattggtcacagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.20)；77.hcrp11：5’‑caagcagaagacggcatacgagatttgaccctgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.21)；78.hcrp12：5’‑caagcagaagacggcatacgagatccactcctgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’(seqidno.22)。79.1.3、第一级pcr反应80.采用图2所示的lcnpcr单管。在封闭的epperdoffpcr(200μl)反应管的lcnpcr第一次反应空间中，以hpv基因组dna为模板，通过hpv特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物p1。具体为：81.反应体系20μl，my09(10μm)1μl，my11(10μm)1μl，2×lcnpcrmix10μl，ddh2o6μl，dna2μl，在pcr仪(博日，tc-96/g/h(b))中85℃预变性10min，85℃变性30s，40℃退火30s，65℃延伸60s，进行30个循环，接着65℃延伸10min，10℃放置得到p1产物。82.另外，图2所示的lcnpcr单管是带盖可封闭的epperdoffpcr(200μl)反应管，该反应管内设有材质与反应管相同的薄膜，该薄膜将反应管的反应空间分成彼此独立的lcnpcr第一次反应空间和lcnpcr第二次反应空间；反应管的管壁外部设有与lcnpcr第一次反应空间对应的很小的凹记号(凹向管内)，以此辨别两个反应空间；薄膜高度为反应管封闭后内部空间高度的五分之四；反应管内放置有磁珠，具体采用44dc钢球,直径1mm(可采购自纽因莱钢球有限公司)；反应管外配套设有磁力棒，具体采用钕铁硼特强磁铁棒(可采购自纽因莱钢球有限公司)。83.1.4、第二级pcr反应84.利用反应管外的钕铁硼特强磁铁棒以及反应管lcnpcr第一次反应空间中的钢球，将第一扩增产物p1从lcnpcr第一次反应空间转移至lcnpcr第二次反应空间中，作为第二级pcr的模板；在lcnpcr第二次反应空间中，通过hpv特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物p2。具体为：85.反应体系20μl，gp6+-f(10μm)1μl，my11-r(10μm)1μl，2×lcnpcrmixwithsbyrgreeni10μl，ddh2o6μl，p1产物dna1μl，在pcr仪(伯乐，cfx96deepwell)中95℃预变性3min，95℃变性5s，60℃退火延伸30s，采集信号，进行40个循环，加入融解曲线，最终得到p2产物。86.1.5、一代测序87.如果融解曲线有特异峰样本，则将p2产物上机测序(采用3730测序仪)，然后将测序结果与hpv标准序列(可从已公开的公用数据库获取)进行对比分析。所获dna序列以100％与基因库中标准hpv基因型dna相符作为hpv定型标准(即美国fda有关hpv定型的最高金标准)。如果测序结果显示杂峰或套峰，则进行第三级pcr反应。88.需要说明的是：现有技术的原发明方法是对p2产物进行电泳操作，由于样本量大，导致该步骤耗时耗力，不利于医院常规检测，本发明在二级反应体系加入sybrgreeni，如此即可无需电泳，直接通过融解曲线进行判断：如果融解曲线没有特异峰则说明该样本阴性；如果融解曲线有特异峰则对该样本的p2产物进行一代测序，从而获得hpv的序列，经与hpv标准序列进行比对鉴别出hpv的型别；如果融解曲线有杂峰或套峰，则对p2产物继续进行第三级pcr反应。89.1.6、第三级pcr反应90.对第二扩增产物p2进行第三级pcr反应得第三扩增产物p3，并对p3进行二代测序，可以区分不同亚型的hpv病毒，从而确定感染病毒的具体型别。具体为：91.反应体系25μl，indexp5(10μm)1μl，indexp7(10μm)1μl，amplitaqgolddna10×bufferⅱ2.5μl，2.5mmeachdntp2μl，25mmmgcl21.5μl，amplitaqgolddnapolymerase(5u/μl)0.1μl，p2产物dna17.9μl，在pcr仪(伯乐，t100)中95℃预变性7min，95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸90s，进行15个循环，10℃放置得到p3产物，对p3产物进行磁珠纯化得文库。92.1.7、二代测序93.将p3产物上机测序(采用illuminamiseq测序平台)，然后将测序结果与hpv标准序列(可从已公开的公用数据库获取)进行对比分析。所获dna序列以100％与基因库中标准hpv基因型dna相符作为hpv定型标准(即美国fda有关hpv定型的最高金标准)。94.需要说明的是：常规的二代测序是末端修复，加接头，再进行一轮pcr反应，得到样本的文库，进行测序，本发明在第二级pcr反应的引物末端加入了特定片段，便于第三步pcr反应加入样本标签，从而方便测序后拆出该样本的序列。95.接头的本质是一段短的碱基序列，作为桥梁连接待测dna片段与flow-cell。以illumina测序平台为例，包括三个部分(如图1所示)：与flow-cell上寡核苷酸链相同或互补的片段p5/p7；测序引物结合部分read1/2；用于区分不同样本的index。index是混样中不同样本的“身份证”，一般长6nt或8nt(现在一般8-10nt)，四种碱基的不同排列组合可以形成不同的index标识。96.由于接头序列过长，一轮pcr反应很难将接头加上目标片段，故本发明通过对第二级pcr反应引物序列进行改造，结合第三步pcr反应来加入接头序列。97.2、方法检测98.2.1、准确性检测99.采用已确认hpv基因型的九组样本进行实验，检验本发明方法的准确性。100.2.2、敏感性检测101.将阳性标准品梯度稀释，确认本发明方法的最佳检测范围。102.2.3、稳定性检测103.选择已确认hpv基因型的阳性样本进行不同批次、不同时间、不同人员的重复性试验，计算实验cv值，检测本发明方法的准确性和稳定性。104.3、方法检测结果105.3.1、准确性检测结果106.将已确认hpv基因型的九组样本作为检测对象，包括六组阳性样本和三组阴性样本。采用图2所示的lcnpcr单管进行检测，实验结果见表1，统计分析结果见表2。六组阳性样本测序结果见图3至图8。107.实验结果表明，本发明方法可以准确检测到六组阳性样本和三组阴性样本，且与一代测序法对比符合率为100％。证明本发明方法的准确性合格。108.表1lcnpcr单管检测方法的特异性table.1thespecificityoflcnpcrsingle-tubedetectionmethod[0109][0110]+：pcr阳性-：pcr阴性[0111]+:positivepcr-:negativepcr[0112]表2数据统计分析table.2statisticalanalysisofthedata[0113][0114]准确度百分比＝(6+3)/(6+0+0+3)×100％＝100％[0115]判断标准：与一代测序法对比符合率＝100％，准确性验证实验通过。[0116]3.2、敏感性检测结果[0117]根据现有试剂盒说明书标注的检测下限为1×103copies/ml，用hpv阴性人类基因组dna将阳性标准品梯度稀释至1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml和1×102copies/ml，每个梯度进行5次重复测定，进行敏感性检测。[0118]实验结果表明，样本浓度在1×102copies/ml至1×105copies/ml范围内时，本发明方法均可成功检测hpv基因型(结果见表3)，阳性检测率为100％。本发明方法的敏感性检测合格，且检测范围比现有的检测试剂盒灵敏度高一个等级，可以达到1×102copies/ml浓度的检测限。[0119]表3lcnpcr单管检测方法的敏感性table3thesensitivityoflcnpcrsingle-tubedetectionmethod[0120][0121]+：pcr阳性-：pcr阴性[0122]+:positivepcr-:negativepcr[0123]3.3、稳定性检测结果[0124]经过多次重复实验，使用已知结果的hpv样本，对不同批次、不同时间、不同人员进行了试验，结果表明本发明方法的稳定性非常好(结果见表4)。在不同的实验条件下，本发明方法的检测结果具有高度的一致性和可重复性。[0125]表4lcnpcr单管检测方法的稳定性table4thestabilityoflcnpcrsingle-tubedetectionmethod[0126][0127]+：pcr阳性-：pcr阴性[0128]+:positivepcr-:negativepcr[0129]4、二代测序检测结果及对比[0130]选取10例一代测序出现套峰的样本，分别用多管特异性引物(即一份样本需要用20多个pcr反应进行鉴别的原方法)与二代测序(本发明方法)进行检测，结果显示，本发明方法的二代测序检测结果完全覆盖了原方法的检测结果(如表5所示)，提示本发明方法可以替代原方法的分管pcr，在保证结果准确性的同时，耗时减少四分之三，大大提高了检测效率。[0131]由此可见，本发明不仅能覆盖分管pcr的24对hpv专一引物，还可以测出其他型别。同时本发明可通过二代测序技术高效地获取大量的基因组数据，从而帮助研究者更加深入地了解基因组的结构和功能，也为疾病的诊断和治疗提供了更加精准的基础。因此，本发明对hpv类型的检测以及对二代测序技术的应用不仅有利于医学的发展，也有助于推动科学的进步。[0132]表5hpv多重感染分管pcr与二代测序结果比较table5comparisonofhpvmultipleinfectionsdetectedbymultiplexpcrandngs.[0133][0134]综合以上各实施例，本发明的人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强；本发明通过薄膜将反应管分为两个反应空间，即两次扩增反应置于同一管中进行，通过磁珠和磁力棒配合操作进行产物的转移，减少开盖次数，减少外部污染的可能性；同时，采用染料法替代电泳法，直接对待测的扩增产物进行一代测序，去除琼脂糖凝胶电泳步骤，减少实验花费时间，提高实验效率；此外，在实验使用的引物上进行了改进，加入了一段特定片段，便于产物二代测序，通过将一代测序与二代测序相结合，提高实验灵敏度和特异性，减少假阳性和假阴性结果的出现，确保了实验结果的可靠性和准确性。[0135]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、采用dna提取试剂盒从目标样本中提取核酸dna；第二步、在封闭的反应管的lcnpcr第一次反应空间中，以hpv基因组dna为模板，通过hpv特异性的第一引物对进行第一级pcr反应扩增，从而获得一级扩增产物p1；将第一扩增产物p1从lcnpcr第一次反应空间转移至反应管的lcnpcr第二次反应空间中，作为第二级pcr反应的模板；在lcnpcr第二次反应空间中，通过hpv特异性的第二引物对进行第二级pcr反应扩增，从而获得二级扩增产物p2；第二级pcr反应采用染料法，并监测融解曲线；如果融解曲线没有特异峰则说明该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的hpv序列与hpv标准序列进行比对鉴别出hpv的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则转至第三步；第三步、对二级扩增产物p2进行第三级pcr反应获得三级扩增产物p3，经二代测序确定样本所含hpv的各个亚型；其中，第二级pcr反应所用第二引物对的各引物末端含有便于第三级pcr反应加入样本标签的特定片段。2.根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，所述反应管内设有材质与反应管相同的薄膜，该薄膜将反应管的反应空间分成彼此独立的lcnpcr第一次反应空间和lcnpcr第二次反应空间。3.根据权利要求2所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，所述反应管的管壁外部设有与lcnpcr第一次反应空间对应的凹向管内的凹记号。4.根据权利要求3所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，薄膜高度为反应管封闭后内部空间高度的五分之四；反应管内放置的磁珠采用44dc钢球,直径1mm；反应管外配套的磁力棒采用钕铁硼特强磁铁棒。5.根据权利要求1至4任一项所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，第二级pcr反应采用的第二引物对为：gp6+-f序列为seq id no.1，以及my11-r序列为seq id no.2。6.根据权利要求1至4任一项所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，第三级pcr反应采用的引物包括index p5和index p7。7.根据权利要求6所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，所述index p5包括：afa1序列为seq id no.3；afa2序列为seq id no.4；afa3序列为seq id no.5；afa4序列为seq id no.6；afa5序列为seq id no.7；afa6序列为seq id no.8；afa7序列为seq id no.9；以及afa8序列为seq id no.10。8.根据权利要求7所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，index p7包括：hcrp1序列为seq id no.11；hcrp2序列为seq id no.12；hcrp3序列为seq id no.13；hcrp4序列为seq id no.14；hcrp5序列为seq id no.15；hcrp6序列为seq id no.16；hcrp7序列为seq id no.17；hcrp8序列为seq id no.18；hcrp9序列为seq id no.19；hcrp10序列为seq id no.20；hcrp11序列为seq id no.21；以及hcrp12序列为seq id no.22。9.根据权利要求1至4任一项所述的一种人乳头瘤病毒hpv型别的鉴别方法，其特征是，第一级pcr反应采用的引物对为：my09序列为seq id no.23；my11序列为seq id no.24。

技术总结
本发明涉及人乳头瘤病毒HPV型别的鉴别方法，包括：从目标样本中提取DNA；在反应管的LcnPCR第一次反应空间中进行第一级PCR反应，不开盖转移一级扩增产物至LcnPCR第二次反应空间中进行第二级PCR反应；第二级PCR采用染料法，并监测融解曲线；若融解曲线无特异峰则该样本阴性；若融解曲线有特异峰则对二级扩增产物进行一代测序，将测得的HPV序列与HPV标准序列进行比对鉴别出HPV的型别；若融解曲线有杂峰或套峰，则对二级扩增产物进行第三级PCR反应获得三级扩增产物，经二代测序确定样本所含HPV的各亚型。本发明将一代测序与二代测序相结合，提高实验灵敏度和特异性，确保实验结果的可靠性和准确性。的可靠性和准确性。的可靠性和准确性。


技术研发人员：陈思 洪国藩 周恬君 朱明星 贺乐欣 李小洋 玛莎
受保护的技术使用者：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/6