一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法与流程

1.本发明属于化合物检测技术领域，涉及一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法。


背景技术：

2.罗哌卡因(ropivacaine，rvc)是一种纯s(-)异构体新型酰胺类局部麻醉药，pka为8.16，具有低脂溶性的特点，适用于硬膜外、腰麻、区域神经阻滞等多种麻醉方式用药和其他急、慢性疼痛的治疗；美洛昔康为一种用于治疗疼痛及减少发炎的非甾体抗炎药，通过减少产生导致疼痛、发烧和发炎的化学物质前列腺素以减轻疼痛。
3.两者同时用药存在美洛昔康溶出效率差、罗哌卡因具有一定毒副作用，并且两者在给药浓度方面差异等缺陷。中国发明专利申请cn116041342a公开了一种罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的新晶型，该一水合物具有稳定的形态和确定的熔点，化学稳定性好，耐高温和光照，且具备了制备固体制剂所需要的性能，给药浓度较高、溶出较好，可压性、崩解度均较好，贮存方便，使制剂的生产操作更为简便，质量更易控制。
4.目前，罗哌卡因和美洛昔康目前常用的检测方法主要是高效液相色谱法。中国发明专利cn110596272b公开了一种成人外用制品中16种局部麻醉成分的检测方法，主要采用高效液相色谱对酰胺类局部麻醉成分包括利多卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、丁吡卡因和普莫卡因，高效液相色谱检测条件为：使用亚3μm核壳填料的c18色谱柱；流动相a为磷酸氢二钾溶液，流动相b为甲醇乙腈，1:1v/v；检测波长为210nm；洗脱采用洗脱程序为：0-8min，95％-14％a；8-10min，14％a；流速为1.0-2.0ml/min；柱温为25-40℃；该法提高了检测回收率和准确度，操作过程简单、快速，能显著提高检测方法的灵敏度，实用性强。
5.中国发明专利申请cn107300599a公开了一种固相萃取-液相色谱联用筛查液体药物中酸性药物的方法，所述高效液相色谱检测测试样的色谱柱为hypersil ods c18柱，流动相a为去离子水，流动相b为乙腈∶5％的四甲基氢氧化铵∶水(400-600∶10∶1000)，并用磷酸调ph至3.5，流动相a和流动相b的体积比为20∶80，流动相流速为1-2ml/min；该法同时检测包括美洛昔康在内的多种成分，分离度高，出峰时间早，回收率高。
6.药物中罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量是其质量控制过程的至关重要的参数，目前尚未有相关方法可以对罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量进行检测；此外，罗哌卡因、美洛昔康与罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物由于极性、溶解性等性能存在明显差异，现有技术对于同时检测罗哌卡因、美洛昔康的方法并不适用于罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量的检测。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术存在的问题，以高效液相色谱hplc法为基础，通过优化色谱条件，完成了本发明的技术方案，提供了一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法，该方法稳定性好、精密度高且重复性高；填补了罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物质
量控制中含量检测技术的空白。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法，所述方法采用高效液相色谱hplc法进行检测；所述hplc的条件为：
10.流动相：流动相a为磷酸二氢钠溶液，流动相b为甲醇；
11.梯度洗脱，洗脱程序如下：
12.时间min流动相a/％流动相b/％0-660406-15.1208015.1-206040。
13.对于本发明的一些实施例，所述流动相a为8-12mmol/l的磷酸盐溶液，ph为2.0-3.0；优选为10mmol/l的磷酸盐溶液，ph为2.0。
14.对于本发明的一些实施例，所述hplc条件还包括：
15.色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6
×
150mm，5μm；
16.流动相流速为1.0-1.2ml/min；
17.柱温为35-40℃；
18.检测波长为210-220nm。
19.优选地，在本发明的一些实施例中，所述hplc条件为：
20.流动相流速为1.0ml/min；
21.柱温为35℃；
22.检测波长为220nm。
23.进一步地，所述罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法具体包括以下步骤：
24.(1)制备对照品溶液和供试品溶液；
25.(2)分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量；
26.(3)根据hplc记录的峰面积，按外标法计算罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量；
27.所述高效液相色谱法按照中国药典2015年版四部通则0512中所记载的要求进行。
28.对于本发明的一些实施例，所述对照品溶液包括：美洛昔康对照品溶液、罗哌卡因对照品溶液；美洛昔康对照品溶液和罗哌卡因对照品溶液的浓度均为0.2mg/ml。
29.对于本发明的一些实施例，所述供试品溶液为罗哌卡因/美洛昔康盐型一水合物溶液；浓度为0.2mg/ml。
30.由于本发明中罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物是依靠分子内氢键结合，在溶液状态是游离状态，使用美洛昔康对照品溶液、罗哌卡因对照品溶液去测含量，进一步计算得到罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物，结果更准确。
31.对于本发明的一些实施例，所述对照品溶液和供试品溶液制备采用稀释剂为：甲醇和0.4mol/l氢氧化钠溶液。
32.对于本发明的一些实施例，所述对照品溶液和供试品溶液制备采用稀释剂为甲醇
和0.4mol/l氢氧化钠溶液按体积比50:3的混合溶液。
33.由于罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物在不同溶剂中存在溶解性差异，中国药典中美洛昔康的有关物质方法的稀释剂为40％甲醇溶液100ml+0.4mol/l氢氧化钠6ml，而该稀释剂对罗哌卡因的溶解性较差，本发明选用甲醇和0.4mol/l氢氧化钠溶液的混合溶液作为该罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的稀释剂可大大提高罗哌卡因的溶解度。
34.对于本发明的一些实施例，对照品溶液和供试品溶液的注入量为10-20μl；优选为20μl。
35.在本发明的一些实施例中，所述罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物实际含量w
r0
按下述公式计算得到：
36.w
r0
＝w
t0
×wr1
+w
t0
×wr1
37.其中，w
t0
为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的理论含量；
38.w
r1
为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物中罗哌卡因的实际含量；
39.w
r2
为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物中美洛昔康的实际含量；
40.进一步地，
[0041][0042]
其中，274.401为罗哌卡因的分子量；
[0043]
351.401为美洛昔康的分子量；
[0044]
643.802为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的分子量；
[0045]
更进一步地，
[0046][0047][0048]
其中，a
t1
为对照品中罗哌卡因峰面积；
[0049]at2
为对照品中美洛昔康峰面积；
[0050]ar1
为供试品中罗哌卡因峰面积；
[0051]ar2
为供试品中美洛昔康峰面积；
[0052]
wt1为对照品中罗哌卡因的理论含量；
[0053]wt2
为对照品中美洛昔康的理论含量；
[0054]
再进一步地，
[0055][0056][0057]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0058]
1、本发明采用的以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以及特定的流动相和洗脱程序进行梯度洗脱，可以同时满足罗哌卡因碱性体系和美洛昔康酸性体系的分析；填补了罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量检测方法的技术空白；
[0059]
2、通过优化流动相a的ph值、流速、柱温等色谱条件，进一步提高了待测峰的分离度，从而提高了检测精度；
[0060]
3、由于罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物在溶液中以罗哌卡因和美洛昔康游离状态存在，而美洛昔康游离态在甲醇中溶解性较低，通过向甲醇中添加适量氢氧化钠溶液作为稀释剂，使得罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物溶解度大大提高，进而提高了检测结果的稳定性、精密度、重复性；
[0061]
4、本发明通过对照品罗哌卡因和美洛昔康的理论含量和峰面积计算得到的罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量结果准确、可靠，无需单独制备罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物对照品；
[0062]
5、本发明使得药物中罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物质量检测指标更加全面，利于更好地控制产品质量。
附图说明
[0063]
图1为实施例2中批号为qyst02-020-a1的罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的hplc结果图；
[0064]
图2为实施例2中批号为qyst02-033-a1的罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的hplc结果图。
具体实施方式
[0065]
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内；除非另有说明，实施例中提供的材料或试剂均为普通市售产品。
[0066]
(1)仪器：
[0067]
仪器型号：agilent1260series高效液相色谱仪；
[0068]
色谱柱：c18(xbridger4.6
×
250mm，5μm)；
[0069]
(2)化学试剂：
[0070]
对照品：罗哌卡因，中国药品生物制品检定所100866-202003；
[0071]
美洛昔康，中国药品生物制品检定所190025-202107；
[0072]
供试品：罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物，自制，批号：qyst02-020-a1、qyst02-033-a1；制备方法见申请号202211724956.7的中国发明专利申请实施例1，具体如下：
[0073]
将12.8g美洛昔康和10.0g罗哌卡因加入至2.7l丙酮(有机溶剂)中，70℃加热回流，搅拌使其完全溶解；将澄清溶液减压浓缩(45℃，-0.1mpa)至有固体析出，停止浓缩，加入2l水(反溶剂)，在25℃(析固温度)下搅拌17h(析固时间)后过滤，固体样品于50℃(干燥温度)真空干燥5h得罗哌卡因美洛昔康盐的一水合物i晶型；
[0074]
试剂：甲醇，色谱级，merck公司；
[0075]
磷酸氢二钠，分析纯，沪试。
[0076]
实施例1
[0077]
(1)制备溶剂：
[0078]
流动相a：量取磷酸氢二钠1.42mg，加入100ml水中，加磷酸调溶液ph至2.0，得到浓度为10mmol/l的磷酸氢二钠溶液；
[0079]
流动相b：甲醇；
[0080]
稀释剂：量取甲醇100ml，加入0.4mol/l氢氧化钠溶液6ml，摇匀备用；
[0081]
(2)对照品溶液：
[0082]
美洛昔康对照品溶液：称取约2mg美洛昔康对照品至10ml稀释剂中，溶解后，得0.2mg/ml美洛昔康对照品溶液，备用；
[0083]
罗哌卡因对照品溶液：称取约2mg罗哌卡因对照品至10ml稀释剂中，溶解后，得0.2mg/ml罗哌卡因对照品溶液，备用。
[0084]
(3)制备供试品溶液：
[0085]
分别取批号qyst02-020-a1和qyst02-033-a1的供试品罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物，研细，取粉末约20mg，精密称定，置5ml容量瓶中，超声处理10分钟，加稀释剂至10ml，摇匀，过滤，得2mg/ml的溶液，备用。
[0086]
实施例2
[0087]
按照中国药典2015年版四部通则0512中所记载的要求，分别精密吸取实施例1制备的对照品溶液及批号qyst02-020-a1和qyst02-033-a1的供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪进行检测；
[0088]
高效液相色谱条件如下：
[0089]
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6
×
150mm，5μm；柱温为35℃；流动相a为10mmol/l的磷酸氢二钠溶液，流动相b为甲醇；流速为1.0ml/min；检测波长为220nm；采用表1的洗脱程序进行梯度洗脱；
[0090]
表1流动相洗脱程序
[0091]
时间/min流动相a/％流动相b/％0-660406-15.1208015.1-206040
[0092]
批号qyst02-020-a1的高效液相色谱hplc结果如图1所示，罗哌卡因、美洛昔康的保留时间分别为4.515min、13.407min；批号qyst02-033-a1的高效液相色谱hplc结果如图2所示，罗哌卡因、美洛昔康的保留时间分别为4.556min、13.409min；根据hplc记录的峰面积，按外标法计算供试品中美洛昔康、罗哌卡因含量，通过美洛昔康、罗哌卡因含量计算得到罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物，结果见表2：
[0093]
表2罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量结果
[0094][0095]
实施例3
[0096]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱检测波长为210nm。
[0097]
实施例4
[0098]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱流速为1.2ml/min。
[0099]
对比例1
[0100]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱的流动相a为ph为2.0的0.1％三氟乙酸tfa溶液。
[0101]
对比例2
[0102]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱流速为0.8ml/min。
[0103]
对比例3
[0104]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱柱温为30℃。
[0105]
对比例4
[0106]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱的色谱柱为zorbax eclipse plus c18。
[0107]
对比例5
[0108]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱的色谱柱为infinitylab poroshell 120ec-c18。
[0109]
对比例6
[0110]
与实施例2相比，区别仅在于高效液相色谱的色谱柱为zorbax bonus-rp。
[0111]
以上各实施例和对比例的检测结果见表3：通过表3可知，本发明采用液相色谱条件下检测的美洛昔康和罗哌卡因两个对照品峰形比较好，溶剂峰与美洛昔康和罗哌卡因可以有效分离，且基线平稳，适合同时测定罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物中的罗哌卡因、美洛昔康的含量。
[0112]
表3不同液相色谱条件的检测结果
[0113]
[0114][0115]
稳定性、精密度、重复性、回收率试验：
[0116]
(1)稳定性试验：
[0117]
精密吸取所述的供试品溶液20ul，重复进样6次，分别于0、1、2、4、8小时注入液相色谱仪，按照实施例2所述的高效液相色谱条件检测，记录峰面积，计算罗哌卡因、美洛昔康的峰面积，rsd分别为1.20％，1.05％，表明供试品溶液在8h内稳定。
[0118]
(2)精密度试验：
[0119]
分别精密吸取罗哌卡因对照品溶液和美洛昔康对照品溶液各20ul，分别重复进样6次，按照实施例2所述的高效液相色谱条件检测，记录峰面积，计算罗哌卡因、美洛昔康的峰面积，rsd分别为0.62％，0.31％。
[0120]
(3)重复性试验：
[0121]
精密吸取供试品溶液20ul，重复进样6次，按照实施例2所述的高效液相色谱条件测定每份供试品的含量，记录峰面积，平均每份含罗哌卡因标示量的102.55％，rsd为0.21％；平均每份含美洛昔康美洛昔康标示量为97.97％，rsd为0.19％。
[0122]
(4)回收率试验：
[0123]
精密量取实施例1制备的罗哌卡因对照品溶液、美洛昔康对照品溶液各3份，体积分别为1ml、1.5ml、2ml，置于10ml容量瓶中，按照实施例2所述的高效液相色谱条件进行测定，计算回收率；罗哌卡因平均回收率为102.52％，rsd为0.31％；美洛昔康平均回收率为98.21％，rsd为0.63％。
[0124]
由此可见，在本发明的高效液相色谱条件下，对于罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的检测限低；稳定性、精密度、重复性和回收率高；且操作简单，实用性强，为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量检测提供了技术支持。
[0125]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法，其特征在于，采用高效液相色谱hplc法进行检测，所述hplc条件为：流动相：流动相a为磷酸二氢钠溶液，流动相b为甲醇；梯度洗脱，洗脱程序如下：时间min流动相a/％流动相b/％0-66040615.1208015.1-206040。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相a为8-12mmol/l的磷酸盐溶液，ph为2.0-3.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述hplc条件还包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，4.6
×
150mm，5μm；流动相流速为1.0-1.2ml/min；柱温为35-40℃；检测波长为210-220nm。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述hplc条件为：流动相流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为220nm。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)制备对照品溶液和供试品溶液；(2)分别取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量；(3)根据hplc记录的峰面积，按外标法计算罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液包括：美洛昔康对照品溶液、罗哌卡因对照品溶液；所述美洛昔康对照品溶液和罗哌卡因对照品溶液的浓度均为0.2mg/ml；所述供试品溶液为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物溶液；浓度为0.2mg/ml。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液和供试品溶液制备采用稀释剂为：甲醇和0.4mol/l氢氧化钠溶液的混合溶液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲醇和0.4mol/l氢氧化钠溶液的体积比为50:3。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对照品溶液和供试品溶液的注入量为10-20μl。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的含量w
r0
按照如下公式计算得到：w
r0
＝97.20％
×
w
r1
+97.20％
×
w
r2
其中，97.20％为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物的理论含量；w
r1
为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物中罗哌卡因的实际含量；w
r2
为罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物中美洛昔康的实际含量；所述w
r1
、w
r2
通过罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物样品中罗哌卡因、美洛昔康的峰面积
和对照品中罗哌卡因、美洛昔康的峰面积计算得到。

技术总结
本发明属于化合物检测技术领域，提供了一种检测罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量的方法。该方法色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为35-40℃；以磷酸氢二钠溶液-甲醇作为流动相进行梯度洗脱；流速为1.0-1.2mL/min；检测波长为210-220nm；通过罗哌卡因和美洛昔康为对照品直接计算得到罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物含量，方法简单、准确性高；该方法稳定性好、精密度高且重复性高；使罗哌卡因/美洛昔康盐的一水合物质量检测指标更加全面，利于更好地控制产品质量。利于更好地控制产品质量。利于更好地控制产品质量。


技术研发人员：唐田 陈柏州 管俊德 梁东丽 蒋娟娟 刘淑芬 郑月连
受保护的技术使用者：加立（深圳）生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/6