一种天冬氨酸酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种天冬氨酸酶突变体，及其用于催化丙烯酸加氨生产β-丙氨酸的用途。


背景技术：

2.β-丙氨酸又称3-氨基丙酸，是一种天然β型氨基酸，其是肌肉肽类物质肌肉组织中的重要成分之一。β-丙氨酸具有化学性质稳定、无毒等特点，广泛被应用于医药、食品、化工等行业。医药上β-丙氨酸可用于生产巴柳氮、帕米膦酸、胍基丙酸等药物；工业上许多重要化合物如3-羟基丙酸、泛酸、肌肽等也是以β-丙氨酸为重要前体或中间体合成的；在食品行业，β-丙氨酸作为一种食品添加剂，通常用于增强食品的味道和营养价值，还被广泛应用于增强肌肉耐力的运动营养补充剂中；此外，β-丙氨酸还可以直接用于生产聚β-丙氨酸，广泛应用于化妆品、水净化和建筑等领域。
3.β-丙氨酸制备方法包括化学合成法、生物酶转化法、微生物发酵法，其中，化学合成法为β-丙氨酸的主流制备方法，但该方法对设备要求较高且反应条件苛刻；微生物发酵法虽然条件温和、对环境友好，但尚达不到工业化生产水平。生物酶转化法主要有两条工艺路线，一是以l-天冬氨酸为底物，采用l-天冬氨酸-α-脱羧酶催化脱羧生成β-丙氨酸，该方法所使用的底物l-天冬氨酸价格昂贵，使得整个生产工艺的成本较高；二是以丙烯酸或丙烯腈为底物，采用天冬氨酸酶催化加氢制备β-丙氨酸。华恒生物在专利cn201710659654.9中公开了一种天冬氨酸酶突变体，在对来源于芽孢杆菌的野生型天冬氨酸酶的构效关系进行深入研究的基础上，对其关键活性位点做了大量的研究工作，通过半理性和非理性设计，确定了多个关键突变位点并对这些位点进行组合，得到具有较高催化丙烯酸加氨活性的天冬氨酸酶突变体，用于提高丙烯酸加氨生成β-丙氨酸的转化率。然而，以丙烯酸为底物的生物酶转化法中，底物丙烯酸和氨水混合时会发生酸碱中和反应放出大量的热，体系温度可达到80-90℃，而现有公开的天冬氨酸酶转化适用温度大都在50℃，需通入冷凝水对底物溶液体系降温至天冬氨酸酶转化适用温度后再加入天冬氨酸酶进行催化转化反应，此过程中需消耗冷凝水；此外，低的酶转化温度下，体系也容易为环境中的微生物污染，染菌风险高。因此，有必要开发一种酶学性能更好，适用于工业化生产的天冬氨酸酶。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种更适用于β-丙氨酸工业化生产，尤其是耐受高的转化温度的天冬氨酸酶突变体，及其用于催化丙烯酸生产β-丙氨酸的用途。
5.我司对天冬氨酸酶的结构及其与底物丙烯酸结合位点已做了大量的研究工作(如cn201710659654.9)，在以上工作的基础上，本发明对野生型天冬氨酸酶继续进行改造。本发明对天冬氨酸酶进行突变，并通过单点饱和突变模拟实验，确定以下关键位点突变：i41l、h42v、p43v、t187c、m321i、k324m、n326t、a422t，在对其酶学性能进行测定后，发现该突变体具有耐受高温的特性。
6.为实现上述目的，本发明提供了下述技术方案：
7.第一方面，本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，在野生型天冬氨酸酶氨基酸序列的基础上含有以下突变：i41l、h42v、p43v、t187c、m321i、k324m、n326t、a422t；所述野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，来源于芽孢杆菌。
8.所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.第二方面，本发明提供编码天冬氨酸酶突变体的核酸分子。
10.编码野生型天冬氨酸酶的核苷酸序列如seq id no:3所示。
11.编码天冬氨酸酶突变体的核苷酸序列如seq id no:4所示。
12.第三方面，本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体基因的重组载体。
13.所述重组载体可以是线性的或闭合的环状质粒；所述质粒可以是pet21a、pet22b、pet24a、pet28a等，但并不受限于此。
14.在本发明中，所述质粒选择的pet28a。
15.第四方面，本发明提供了一种表达天冬氨酸酶突变体的基因工程菌。
16.所述基因工程菌可以为大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母等；在本发明中，所述基因工程菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌k12 mg1655。
17.第五方面，本发明还提供了上述基因工程菌在生产β-丙氨酸中的用途。
18.第六方面，本发明还提供了通过上述天冬氨酸酶突变体或基因工程菌来制备β-丙氨酸的方法。
19.该方法中，是以丙烯酸为反应底物，在天冬氨酸酶的作用下，催化丙烯酸加氨反应。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在以下几个方面：
21.1.本发明天冬氨酸酶突变体相较于现有技术中公开的天冬氨酸酶具有更好稳定性，能够耐受更高的反应温度，能适应反应体系中的温度波动，具有更高的鲁棒性，更适于工业化生产。
22.2.采用本发明的天冬氨酸酶突变体，能够缩短酶转化反应的时间，高效合成β-丙氨酸。
23.3.本发明的天冬氨酸酶突变体能够耐受60℃高温，在此条件下反应体系不易染菌，且在该转化温度下，β-丙氨酸的得率较高；此外，该温度条件下，体系中残留的其它酶失活，从而最大程度上减少其它酶的干扰，减少副产物的产生，有利于目标产物β-丙氨酸的纯化。
具体实施方式
24.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
25.(1)β-丙氨酸的检测方法
26.β-丙氨酸的检测是采用液相色谱衍生法，检测条件和方法为：
27.1.色谱条件为：色谱柱xdb-c8(150mm)中性柱子，流动相乙酸钠溶液：甲醇＝70：30(体积比)，流速1.0ml/min，检测波长334nm，柱温30℃，进样量10ul；乙酸溶液的配制：取4.1g无水乙酸钠溶于1l超纯水。
28.2.样品衍生：(1)硼砂缓冲溶液的配制：取19.06g硼砂溶于超纯水定容至1l，用氢
氧化钠溶液调ph至9.5；(2)衍生剂的配制：取0.686g邻苯二甲醛+10ml无水乙醇+0.2944n-乙酰-l半光氨酸，用0.05mol/l硼砂缓冲液定容50ml，避光备用；(3)氨基酸样品衍生：在ep管中，依次加入硼砂缓冲剂300ul，样品250ul，衍生剂200ul。混匀后等待3-5min后进样。
29.(2)名词定义
30.酶活的定义：1分钟内催化丙烯酸加氨反应生成1μmolβ-丙氨酸定义为1u。
31.单位细胞酶活的定义：单位细胞浓度下，1分钟内催化丙烯酸加氨反应生成1μmolβ-丙氨酸定义为1u/od。
32.相对酶活：天冬氨酸酶突变体酶活与野生型天冬氨酸酶酶活的比值。
33.转化率＝(生成的β-丙氨酸的摩尔数/丙烯酸的初始摩尔数)
×
100％。
34.(3)酶活检测方法
35.将丙烯酸和14.8％氨水按照1.7：5.3的体积比混合配制成底物，取25ml底物，向其中加入粗酶蛋白(粗酶od＝120)，控制转化体系中粗酶的浓度为10od，在50℃下转化反应20min，取样检测。
36.实施例1：菌株构建
37.一、克隆
38.构建含有编码所述野生型天冬氨酸酶及其突变体基因的质粒，以大肠杆菌k12 mg1655为表达体系，将含编码天冬氨酸酶的质粒pet28a-aspb*bsu通过电击法转入大肠杆菌k12 mg1655中，其质粒构建及转化过程简述如下：
39.1.重组质粒的构建
40.首先通过生物信息学技术中的分子模拟对接寻找该酶活性口袋进行基因突变，全基因组合成野生型天冬氨酸酶和天冬氨酸酶突变体的核苷酸序列，以合成基因为模板，引物1和2扩增获得相应的核苷酸基因片段。
41.引物1tttgtttaactttaagaaggagatatacatgaataccgatgttcgtattgag引物2gtggtggtggtggtggtgctcgagttattttcttccagcaattcccg
42.用限制性内切酶ndei和xhoi双酶切pet28a载体获得的大小约5300bp的pet28a线性载体，将pet28a线性载体与pcr扩增得到的基因片段通过诺唯赞公司的clonexpress entry one step cloning kit同源重组酶连接，将重组好的体系加入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，待菌落长出后使用pet28a载体的鉴定引物进行初步鉴定，将条带正确的单克隆进行测序鉴定。
43.通过二代测序技术(ngs)来检测pcr扩增得到的基因片段的插入点。二代测序技术结果均表明，插入序列与预期一致，同时不含有非预期的蛋白序列，ngs的实验结果支持上述结论。插入片段的长度为1404bp，没有破坏已知基因序列。
44.2.克隆菌株的构建
45.将重组质粒通过电击法转入大肠杆菌k12 mg1655中，得到表达野生型天冬氨酸酶的重组大肠杆菌wt，和表达天冬氨酸酶突变体的重组大肠杆菌ahb-1。所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示，是在来源于芽孢杆菌的野生型天冬氨酸酶的氨基酸序列(如seq id no:1所示)上含有以下突变：i41l、h42v、p43v、t187c、m321i、k324m、n326t、a422t。
46.二、表达
47.使用自诱导培养基培养含有步骤一构建的重组质粒的宿主细胞。自诱导培养基的组成如下：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.27g/l，100％甘油20ml/l，葡萄糖0.5g/l，乳糖2g/l，氨苄青霉素钠50mg/l。将含有重组质粒的宿主细胞接种于自诱导培养基中，按照分批发酵的方式进行发酵。在30℃和200rpm条件下振荡培养20小时，得到菌液。
48.三、粗酶提取
49.采用离心法收集细胞，具体是将细胞培养液在4000g转速下，离心10分钟，收集细胞，得到粗酶。采用分光光度计测粗酶的od值。
50.实施例2：天冬氨酸酶突变体的酶学性能测试
51.1.酶活检测
52.将丙烯酸和14.8％氨水按照1.7：5.3的体积比混合配制成底物，取25ml底物，向其中加入粗酶蛋白(粗酶od＝120)，控制转化体系中粗酶的浓度为10od，在50℃下转化反应20min，取样检测，测定其催化丙烯酸加氨酶活。
53.天冬氨酸酶突变体催化丙烯酸加氨的相对酶活测定结果见表1。
54.表1
55.编号相对酶活wt1.00ahb-142.18
56.结果表明，与野生型天冬氨酸酶相比，所得突变体在50℃下的酶活提高了42倍。
57.2.耐高温稳定性
58.将粗酶在不同温度(50℃、55℃、60℃)下温育3h，催化丙烯酸加氨转化。在50℃下转化反应20min，取样检测(按照前述酶活检测方法进行检测)，测定其催化丙烯酸加氨酶活，计算酶活保持率，结果见表2。
59.表2
[0060][0061]
结果表明，与野生型天冬氨酸酶相比，所得突变体的热稳定性显著提高，在60℃下
温育3h仍具有高的酶活。
[0062]
3.耐ph稳定性实验
[0063]
用naoh调节粗酶ph至8、10、12，粗酶od＝120，放置3h，催化丙烯酸加氨转化。在50℃下转化反应20min，取样检测(按照前述酶活检测方法进行检测)，测定其催化丙烯酸加氨酶活，计算酶活保持率，结果见表3。
[0064]
表3
[0065][0066]
结果表明，与野生型天冬氨酸酶相比，所得突变体的耐受ph性更好，在ph＝10下放置3h仍具有高的酶活。
[0067]
4.丙烯酸加氨制备β-丙氨酸的转化率
[0068]
按照粗酶：丙烯酸：26％氨水＝1：2.78：4.52的质量比进行转化反应，粗酶od＝120，控制转化体系中粗酶的浓度为15od，分别在50℃、55℃、60℃下进行转化，在反应0min、1h、2h、3h取样，分别计算1h、2h和3h的转化率，结果见表4。
[0069]
表4
[0070]
[0071][0072]
从上表中可以看出，本技术ahb-1菌株粗酶在60℃下仍具有较好的催化丙烯酸加氨的活性，丙烯酸的转化率可达97.75％，且60℃、2h的转化率要高于50℃、3h下的转化率，缩短了反应时间。
[0073]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，在如seq id no:1所示的野生型天冬氨酸酶氨基酸序列的基础上含有以下突变：i41l、h42v、p43v、t187c、m321i、k324m、n326t、a422t。2.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列如seq id no:2所示。3.编码权利要求1或2所述的天冬氨酸酶突变体的核酸分子。4.根据权利要求3所述的天冬氨酸酶突变体的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no:4所示。5.一种含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体。6.一种表达权利要求1或2所述天冬氨酸酶突变体、权利要求3或4所述核酸分子、或权利要求5所述重组载体的基因工程菌。7.如权利要求1或2所述的天冬氨酸酶突变体、含有权利要求3或4所述核酸分子、含有权利要求5所述核酸分子的重组载体、权利要求6所述的基因工程菌在生产β-丙氨酸中的用途。8.一种制备β-丙氨酸的方法，通过权利要求1或2所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求6所述的基因工程菌来制备。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于以丙烯酸为反应底物。

技术总结
本发明公开了一种天冬氨酸酶突变体，是在野生型天冬氨酸酶氨基酸序列的基础上含有I41L、H42V、P43V、T187C、M321I、K324M、N326T、A422T这些位点突变，该突变体具有高的耐受温度，在60℃下仍具有高的催化丙烯酸加氨活性，从而能够缩短酶转化反应生成β-丙氨酸的反应时间，且在该反应条件下体系不易染菌。且在该反应条件下体系不易染菌。


技术研发人员：刘磊 樊义 夏丹丹
受保护的技术使用者：秦皇岛华恒生物工程有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/8