一种鸡星状病毒变异毒株及其应用

1.本发明涉及禽星状病毒毒株的分离和应用领域，具体涉及一种鸡星状病毒变异毒株及其应用。


背景技术：

2.鸡星状病毒(chicken astrovirus，castv)是星状病毒科禽星状病毒属中的一种小而圆、无包膜、单股正链rna病毒。castv分为a和b型，a型包括ai、aii和aiii3种基因型；b型则有bi、bii、biii、biv、bv和bvi6种基因型。自2004年被划分为禽星状病毒属的一个成员以来，各地纷纷报道了castv的感染。castv与肉鸡群生长不良、肠炎和腹泻有关，是能导致发育迟缓综合征的病原体之一。与其他rna病毒一样，castv易变异，进化出致病力和毒力强弱不等的毒株，可使鸡只因感染不同毒株而出现不同程度的临床症状，轻度呈消化不良，重则致死。病理解剖发现，肾脏、肝脏和肠道等内脏器官出现病变，其中较典型的病症有“白鸡”综合征、生长障碍与营养吸收不良综合症以及严重的内脏痛风。
3.对于castv感染引起的疾病的防控，除了严格的生物措施外，开发有效的疫苗对于该疾病的综合防控至关重要。但是，castv在体外培养中的增殖，如胚胎或细胞培养，是复杂且不可预测的，由此导致castv疫苗的研制比较困难。
4.另外，星状病毒感染后常常造成环境的污染，家禽疾病净化困难，常规消毒剂对其不敏感。因此，亟需建立快速敏感的检测体系用于castv的早期诊断，准确判定机体的感染状态，对未感染的动物进行有效保护。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明从发病的雏鸡中分离得到一株鸡星状病毒变异毒株，并对该鸡星状病毒变异毒株的细胞嗜性、致病性和免疫原性进行了考察，并建立了针对该鸡星状病毒变异毒株的荧光定量pcr检测方法，为鸡星状病毒的防治和监测提供了保障。
6.具体的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供了一株鸡星状病毒变异毒株，该病毒的分类命名为鸡星状病毒2022castv-sdau-1(chicken astrovirus 2022castv-sdau-1)，已于2023年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为cctcc no：v202337。
8.本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1为现有星状病毒的变异株，其能够导致雏鸡肾脏肿大出血并出现尿酸盐沉积，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落；肠系膜出血，肠系膜和胃粘膜毛细血管充血，除此之外，可以造成脾脏出血、腺胃炎及心脏炎性细胞浸润，心肌纤维断裂，排列紊乱；另外，部分鸡出现脑水肿现象。本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1具有广泛的细胞嗜性，能感染多种动物细胞并较好的增殖，同时于lmh细胞中可以产生明显的细胞病变；而且，本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1在lmh细胞中出现病变时间早，能够在短时间内进行大量增殖，因此，本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1可以作
为优异的疫苗株，用于疫苗的制备。基于此，上述鸡星状病毒变异毒株在制备疫苗中的应用也是本发明的保护范围。
9.上述应用中，所述疫苗是用于防治由鸡星状病毒2022castv-sdau-1引起的疾病。
10.本发明的第二方面，提供一种用于检测上述鸡星状病毒变异毒株的引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示。
11.本发明的第三方面，提供上述引物组合在构建检测上述鸡星状病毒变异毒株的荧光定量pcr反应体系中的应用。
12.上述应用中，所述荧光定量pcr反应体系包括：green premix pro taq hs qpcr mix 10μl，10μmol/μl上游引物、下游引物各0.4μl，rnase free ddh2o 8.2μl，待检测的样品dna模板1μl。
13.本发明的有益效果：
14.本发明首次分离得到一株鸡星状病毒变异毒株，经过pcr、rt-pcr试验和回归动物实验，确定了其新型鸡星状病毒变异毒株，在分子遗传学及其生物学特性上有着显著的差异，该研究为我国养鸡场对该病的综合防控提供基础。
附图说明
15.图1为实施例1中鸡星状病毒细胞病变图。
16.图2为实施例1中鸡星状病毒orf1b基因电泳图；图中m为dl1000 marker，1泳道为鸡星状病毒orf1b基因电泳图。
17.图3为pcr扩增预期片段序列。
18.图4为鸡星状病毒2022castv-sdau株与参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019株全基因组核苷酸对比图。
19.图5鸡星状病毒2022castv-sdau株与参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019株orf1a、orf1b和orf2氨基酸对比图。
20.图6为鸡星状病毒2022castv-sdau株与参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019株全基因组核苷酸遗传进化图。
21.图7为鸡星状病毒2022castv-sdau株与参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019株orf1a、orf1b和orf2的核苷酸遗传进化图。
22.图8为鸡星状病毒2022castv-sdau株荧光定量pcr的溶解曲线对比图(a)、溶解曲线组合(b)和扩增曲线(c)。
23.图9为接种鸡星状病毒2022castv-sdau株的雏鸡体重变化(a)及存活率(b)。
24.图10为接种鸡星状病毒2022castv-sdau株的雏鸡肾(a)、腺胃(b)、心脏(c)、十二指肠(d)、脑(e)、脾脏(f)的组织病理变化。
25.图11为病毒生长曲线图。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。
27.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
28.实施例1：鸡星状病毒变异毒株的分离、鉴定和序列分析
29.1.病料采集与处理：
30.2022年8月24日，从山东潍坊、泰安和青岛等地送检的5-15日龄生长发育不良的雏鸡进行病料采集，雏鸡生长矮小，精神沉郁，羽毛发育不全。剖检可见胸腺个别有出血，肾脏出现白色尿酸盐沉积，十二指肠及盲肠出血，空肠回肠偶见出血。
31.无菌取适量病死雏鹅的十二指肠和肾脏，加入5倍体积的无菌生理盐水，剪碎、充分匀浆，8000g离心15min，取上清经0.22μm滤器过滤除菌后，接种于80％密度的lmh细胞，感作30分钟后，换1％血清培养基(hyclone)于37℃、5％ co2培养箱中培养48h，继续盲传5代直至出现明显细胞病变为止(图1)。经检验无细菌污染，毒株命名为2022castv-sdau，-80℃保存备用。
32.2.pcr鉴定：
33.将接毒细胞离心，取沉淀，在1.5ml离心管中加入1ml trizol reagentrna提取液，混匀，室温放置15min。加入200μl氯仿，充分震荡混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，取上清液500μl转移至经depc处理的1.5ml离心管中。加入预冷的异丙醇500μl，-20℃静置30min后，12000rpm离心15min，弃掉上清。加入1m1 75％乙醇，8000rpm离心5min，倒掉液体。倒置于纸上干燥，将沉淀悬于30μl的rna-free water中，-80℃保存备用。按照反转录酶使用说明书对提取的rna进行反转录，将合成的cdna于-20℃保存备用。
34.分别用鸡性扎un该病毒禽肾炎病毒(anv)、呼肠孤病毒、轮状病毒、禽腺病毒i组(fadv-1)、传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡细小病毒(chpv)和新城疫病毒(ndv)特异性引物(表1)进行rt-pcr检测。
35.表1：病原特异性引物序列
[0036][0037]
注：引物序列中的“k”、“y”、“r”、“d”等为简并碱基，其中，k代表g/t，y代表c/t，r代
表a/g，d代表g/a/t。
[0038]
采用25μl pcr反应体系：premix taq(takara tagm version2.0)12.5μl，上、下游引物各1μl，cdna模板2μl，ddh2o补加至25μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃40s，循环35次；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。
[0039]
pcr反应结束后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果并拍照。电泳结果显示特异性目的片段大小为510bp，与预期片段大小相符(图2和图3)。表明试验中分离并检测到了鸡星状病毒。rt-pcr对禽肾炎病毒(anv)、呼肠孤病毒、轮状病毒、禽腺病毒i组(fadv-1)、传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡细小病毒(chpv)和新城疫病毒(ndv)外源病毒检测证明鸡星状病毒中不含有其它外源病毒污染(图2)。
[0040]
3.全基因组序列测定及同源性分析：
[0041]
用6对引物扩增病毒基因组片段(表2)，使用pcr试剂盒(beyotime)纯化扩增产物，连接到pgem-t载体上进行进一步测序分析，最终获得鸡星状病毒基因组全长。
[0042]
表2：6对引物扩增病毒基因组片段
[0043][0044][0045]
从genbank下载已知鸡星状病毒分离株的序列，利用dnaman软件预测各基因节段orf的位置和数量，推导氨基酸序列，用blastn分析各基因编码情况。采用megalign比对不同鸡源毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性，通过mega7.0构建进化树。将本发明筛选获得的鸡星状病毒(2022castv-sdau)与genbank上已发表的鸡星状病毒序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对(见图4)。
[0046]
结果表明，本发明分离到的鸡星状病毒2022castv-sdau株基因组全长7334bp，其核苷酸序列如seq id no.1所示。而参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019基因组全长7331bp(序列号:om469242)，两株病毒全基因组orf1a基因orf1b基因以及orf2基因序列均出现了不同程度的碱基突变或缺失(见图5)。本发明分离的鸡星状病毒2022castv-sdau株与参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019核苷酸和氨基酸序列同源性比对如下表3-5所示。
[0047]
表3：2022castv-sdau株与参考毒株核苷酸相似性比较表
[0048][0049]
表4：2022castv-sdau株与参考毒株氨基酸相似性比较表
[0050][0051]
表5：2022castv-sdau株与参考毒株氨基酸遗传距离比较表
[0052][0053]
决定鸡星状病毒抗原性的主要抗原基因orf2，鸡星状病毒2022castv-sdau株的orf2的核苷酸序列如seq id no.2所示，其氨基酸序列如seq id no.3所示，参考鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019株orf2基因编码的氨基酸序列号:uny48309.1)，其核苷酸及氨基酸同源性分别为92.1％和95.7％，见表3和表4。两株病毒按照星状病毒的分类依据(orf2编码的氨基酸遗传距离小于0.368～0.781划为同一种)，两者编码的氨基酸遗传距离为0.122，故划为同一病毒种(表5)，但高于星状病毒变异株划分依据下限0.05，全基因组核酸同源性低于93％(表3)，根据orf2氨基酸遗传距离大于0.05，全基因组核酸同源性低于93％作为划分变异株的依据，故将新分离的星状病毒2022castv-sdau株归为鸡星状病毒castv/pb15-hi11/switzerland/2019病毒的变异毒株。因两株病毒的生物学特性发生了明显改变，基于此，本发明依据病毒全基因组核昔酸同源性差异以及orf2氨基酸遗传距离，两者处于不同的进化分支(图6和图7)，是星状病毒种的变异株。
[0054]
对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：
[0055]
菌种名称：鸡星状病毒2022castv-sdau-1(chicken astrovirus 2022castv-sdau-1)
[0056]
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0057]
保藏机构简称：cctcc
[0058]
地址：中国武汉，武汉大学
[0059]
保藏日期：2023年5月9日
[0060]
保藏中心登记入册编号：cctcc no：v202337。
[0061]
实施例2：荧光定量pcr检测方法的建立
[0062]
为对鸡星状病毒2022castv-sdau株进行检测，根据鸡星状病毒2022castv-sdau株的保守序列设计特异性的检测引物，相应引物序列如下：
[0063]
上游引物castv forward：5
’‑
tcttcagcagcagcatac-3’，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
[0064]
下游引物castv reverse：5
’‑
atgttggcgttcctaatgt-3’，其核苷酸序列如seq id no.5所示；
[0065]
所述pcr扩增的反应体系如下：反应液每管20μl，含有green premix pro taq hs qpcr mix 10μl，10μmol/μl gyv3 forward、gyv3 reverse各0.4μl，rnase free ddh2o 8.2μl，待检测的样品dna模板1μl；
[0066]
所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；
[0067]
选择经castv鉴定引物鉴定为阳性的dna样品为模板，进行pcr扩增，
[0068]
扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定，使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根)进行纯化回收。将纯化的dna产物连接至puc15 vector中，构建重组质粒，于16℃中连接
50min，将连接castv目的片段的质粒进行10倍倍比稀释，进行荧光定量pcr扩增，生成荧光定量扩增曲线、溶解曲线并构建荧光定量标准曲线；以标准品起始拷贝数的常用对数(lgc)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)y＝-3.3267x+37.877(y：ct值，x：模板起始拷贝数)，回归系数r2＝0.99，获得其敏感性试验数据，结果显示，本发明的多重qpcr方法的最低检测线为3
×
102copies/ml；以puc15-castv作为阳性标准质粒；设空白作为阴性对照(如图8所示)。
[0069]
(2)结果判定：
[0070]
质控标准：阴性对照无ct值并且无扩增曲线；阳性对照的ct值应≤28.86，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
[0071]
结果描述及判定：无ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；ct值≤36.86，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
[0072]
(3)具体检测实例：
[0073]
2023年采集山东158份血清及泄殖腔棉拭子，使用荧光定量pcr进行相应检测。结果显示：血液和泄殖腔棉拭子荧光定量阳性率为32.7％和53.8％，说明该检测体系检测效果良好。
[0074]
表6：检测体系检测结果
[0075][0076]
实施例3：鸡星状病毒2022castv-sdau-1的特性考察
[0077]
1.对雏鸡的致病性：
[0078]
对雏鸡的致病性：将90只1日龄的健康雏鸡随机分为三组：oral组、intraperitoneal组和control组，oral组口服及腹腔注射新型鸡星状病毒2022castv-sdau-1的病毒液，0.2ml/只；intraperitoneal组腹腔注射新型鸡星状病毒2022castv-sdau-1的病毒液，0.2ml/只；control组注射等量的无菌生理盐水；观察各组雏鸡的临床表现，观察30日。
[0079]
oral组和intraperitoneal组明显比control组体重减轻(图9)；oral组的雏鸡在攻毒后第3日、第4日和第5日各死亡一只，死亡率达10％(3/30)；intraperitoneal组的雏鸡在攻毒后第3日、第4日和第6日各死亡2只，死亡率达到20％(4/30)(图9)。oral组和intraperitoneal组造成病变大体一致，剖检病死雏鸡，均可见肾脏肿大出血并出现尿酸盐沉积，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落；肠系膜出血，肠系膜和胃粘膜毛细血管充血，除此之外，可以造成脾脏出血、腺胃炎及心脏炎性细胞浸润，排列紊乱；另外，部分鸡出现脑水肿现象(图10)。对照组雏鸡均健活，无任何临床表现。
[0080]
2.病毒的细胞嗜性：
[0081]
为了确定鸡星状病毒2022castv-sdau-1的细胞嗜性，本研究运用细胞病变观察的方法检测鸡星状病毒2022castv-sdau-1在鸡肝癌细胞(lmh)及鸡胚肝细胞(cel)等不同细胞上的增殖情况，并于lmh细胞中制作该星状病毒变异株的病毒生长曲线(图11)，具体如下：
[0082]
(1)试验方法：
[0083]
健康细胞形成致密单层后，弃掉生长液，接种鸡星状病毒2022castv-sdau-1并吸附1h，期间间隔晃动，保证病毒吸附均匀。加入与生长液等量、含2％新生牛血清的病毒维持液，期间不再更换新的培养液；同时设未接病毒的健康细胞作为对照。
[0084]
置37℃培养箱中静置培养，每日观察并记录细胞病变情况，75％细胞出现病变时收获，通过冻融释放细胞内病毒，按reed-muench法计算病毒含量。
[0085]
(2)试验结果：
[0086]
鸡星状病毒2022castv-sdau-1在不同细胞上增殖的病毒含量结果见表6。
[0087]
表6：鸡星状病毒2022castv-sdau-1在不同细胞上增殖的病毒含量
[0088]
细胞种类tcid
50
lmh104cel10
3.8
[0089]
鸡星状病毒的纯化培养一直是病毒及疫苗研究中的难点，能否获得适应体外细胞培养的疫苗株是疫苗研制和生产的关键所在。与现有报道的鸡星状病毒不同的是，本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1具有广泛的细胞嗜性，能感染多种动物细胞并较好的增殖，同时于lmh细胞中可以产生明显的细胞病变；而且，本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1在lmh细胞中出现病变时间早，能够在短时间内进行大量增殖，因此，本发明的鸡星状病毒2022castv-sdau-1可以作为优异的疫苗株，用于疫苗的制备。
[0090]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一株鸡星状病毒变异毒株，其保藏编号为：cctcc no：v202337。2.权利要求1所述的鸡星状病毒变异毒株在制备疫苗中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疫苗用于防治由权利要求1所述的鸡星状病毒变异毒株引起的疾病。4.一种用于检测权利要求1所述鸡星状病毒变异毒株的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示。5.权利要求4所述的引物组合在构建检测权利要求1所述鸡星状病毒变异毒株的荧光定量pcr反应体系中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光定量pcr反应体系包括：green premix pro taq hs qpcr mix 10μl，10μmol/μl上游引物、下游引物各0.4μl，rnase free ddh2o 8.2μl，待检测的样品dna模板1μl。

技术总结
本发明公开了一种鸡星状病毒变异毒株及其应用，属于禽星状病毒毒株的分离和应用领域，本发明通过对临床雏鸡生长发育不良样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸡星状病毒株，其保藏编号为：CCTCC NO：V202337，在10％血清培养基的LMH细胞中传代至10代，其TCID


技术研发人员：成子强 毕晓庆 周德方 孟凡润 周静 孙士伟 丁龙鹰 宋振锐
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/8