一种具有降血糖效果的桔梗多糖及其制备方法

1.本发明涉及桔梗多糖制备领域，尤其涉及一种具有降血糖效果的桔梗多糖及其制备方法。


背景技术：

2.桔梗是多年生草本植物，属于药食同源的一种中药材，其根可入药，具有止咳祛痰、宣肺、排脓等作用。桔梗常被腌制为咸菜或者被用来制作泡菜，桔梗泡菜生产工业中，通常需要对桔梗进行去皮处理，此过程不可避免的产生了大量桔梗废料和残渣，目前，这些桔梗废料一般被掩埋或焚烧，对生态环境造成了严重污染，桔梗废料中同样含有黄酮、皂苷和多糖等营养成分，若对其进行整合开发，能够确保桔梗资源的最大化利用。
3.现有技术中公开了部分有关桔梗多糖制备的发明专利，申请号为201010178466.2的中国专利，公开了一种桔梗多糖的制备方法。本发明解决了现有桔梗多糖提取得率低、耗费时间长、多糖活性不高工、艺繁琐的问题。桔梗多糖的提取工艺的步骤为：选取桔梗干燥根，粉碎后的粉末经过脱脂后，再经微波辅助水提法提取桔梗中多糖提取物，脱蛋白后用超速离心机分离提取液，真空薄膜浓缩，透析浓缩后用真空冻干机进行冻干，即得桔梗多糖冻干粉末。
4.桔梗多糖提取、分离纯化的方法有很多，不同的提取制备方法，所得到的糖种类和结构也不尽相同，并且不同结构表现差异巨大得生物活性。本发明在前期研究已确定的桔梗多糖降血糖活性的基础上，对桔梗的降血糖目标成分进行富集纯化，得到一种力图提供一种高效富集纯化活性多糖的方法，推广应用，促进产业发展。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的桔梗多糖的提取效率不高、制备纯度较低以及制备工艺较为简单等缺点，而提出的一种具有降血糖效果的桔梗多糖及其制备方法。
6.为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
7.步骤一、桔梗根的预处理：将新鲜桔梗根洗净去除泥沙，再置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛后，获得预处理的桔梗粉末；
8.步骤二、桔梗多糖的酶法提取：将预处理后的桔梗粉末与水混合，调节料液比为1：20～1：40g/ml，调节温度30～70℃，添加复合酶后，快速混匀，置于水浴锅中浸提反应30～150min，反应结束后立即煮沸灭酶活10min，冷却至常温后，将浸提液离心20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入离心管中离心5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖；
9.步骤三、桔梗多糖的纯化：以5mg/ml的浓度上样至预平衡的sephacryl s－100凝
胶层析柱上，流速为1.3ml/min，用蒸馏水进行洗脱，采用自动收集系统收集洗脱液，每个管收集4ml，收集100管，采用蒽酮－硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，浓缩洗脱液，冷冻干燥后得到分子量均一的桔梗多糖。
10.优选的，上述步骤二中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm。
11.优选的，上述步骤二中，水的体积用量以预处理后的桔梗粉末质量计为20～40ml/g，酶解温度为30～70℃，酶解时间为30～150min。
12.优选的，上述步骤二中，料液比为30.94ml/g，酶解温度为51.04℃，酶解时间为88.78min。
13.优选的，上述步骤二中，所述复合酶是由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成。
14.优选的，果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1～3％，木瓜蛋白酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％，纤维素酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％。
15.优选的，纤维素酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，木瓜蛋白酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1.5％。
16.一种具有降血糖效果的桔梗多糖，所述桔梗多糖包括甘露糖2.472％、鼠李糖3.511％、葡萄糖醛酸4.041％、半乳糖醛酸6.057％、葡萄糖16.613％、半乳糖12.807％、木糖8.892％和阿拉伯糖42.816％；所述桔梗多糖还包括蛋白质和核酸等难以去除的杂质。
17.优选的，所述桔梗多糖对α－淀粉酶抑制活性ic50值为1.679mg/ml，所述桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶的ic50值为1.301mg/ml。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明提供了一种采用复合酶提取桔梗多糖的新方法，在单一酶提取多糖的单因素实验基础上，初步确定了三种酶的最佳提取条件范围，为提高试验效率，减少次数，采取正交试验法对复合酶添加量进行了优化。经验证试验得到最佳复合酶添加比例为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶1.5％，其桔梗多糖提取率为9.01％，多糖提取率较单一酶提高了11.0％～33.28％。本发明操作简单便捷、提取条件温和、能耗低、污染小，得到的桔梗多糖纯度达到97％以上，分子量小于4kda，是一种新型小分子多糖，同时提取得到的桔梗多糖对α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶活性的抑制效果，拓宽了桔梗多糖的应用领域。
附图说明
20.图1为本发明的单一酶与多糖提取率关系示意图；
21.图2为本发明的酶解温度与多糖提取率关系示意图；
22.图3为本发明的料液比与多糖提取率关系示意图；
23.图4为本发明的酶解时间与多糖提取率关系结构示意图；
24.图5为本发明的管数与吸光度关系示意图；
25.图6为本发明的浓度与α－淀粉酶的抑制活性的关系示意图；
26.图7为本发明的浓度与α－葡萄糖苷酶的抑制活性的关系示意图；
27.图8为本发明的制备方法流程示意图。
具体实施方式
28.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。
29.一种具有降血糖效果的桔梗多糖，所述桔梗多糖包括甘露糖2.472％、鼠李糖3.511％、葡萄糖醛酸4.041％、半乳糖醛酸6.057％、葡萄糖16.613％、半乳糖12.807％、木糖8.892％和阿拉伯糖42.816％；所述桔梗多糖还包括蛋白质和核酸等难以去除的杂质。
30.需要说明的是，所述桔梗多糖对α－淀粉酶抑制活性ic50值为1.679mg/ml，所述桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶的ic50值为1.301mg/ml。
31.如图8所示的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
32.步骤一、桔梗根的预处理：将新鲜桔梗根洗净去除泥沙，再置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛后，获得预处理的桔梗粉末；
33.步骤二、桔梗多糖的酶法提取：将预处理后的桔梗粉末与水混合，调节料液比为1：20～1：40g/ml，调节温度30～70℃，添加复合酶后，快速混匀，置于水浴锅中浸提反应30～150min，反应结束后立即煮沸灭酶活10min，冷却至常温后，将浸提液离心20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入离心管中离心5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖；
34.步骤三、桔梗多糖的纯化：以5mg/ml的浓度上样至预平衡的sephacryl s－100凝胶层析柱上，流速为1.3ml/min，用蒸馏水进行洗脱，采用自动收集系统收集洗脱液，每个管收集4ml，收集100管，采用蒽酮－硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，浓缩洗脱液，冷冻干燥后得到分子量均一的桔梗多糖。
35.作为本发明的进一步实施方案，上述步骤二中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm。
36.作为本发明的进一步实施方案，上述步骤二中，水的体积用量以预处理后的桔梗粉末质量计为20～40ml/g，酶解温度为30～70℃，酶解时间为30～150min。
37.作为本发明的进一步实施方案，料液比为30.94ml/g，酶解温度为51.04℃，酶解时间为88.78min。
38.作为本发明的进一步实施方案，上述步骤二中，所述复合酶是由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成。
39.需要说明的是，果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1～3％，木瓜蛋白酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％，纤维素酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％。
40.需要说明的是，纤维素酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，木瓜蛋白酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1.5％。
41.实施例1
42.单一酶法提取桔梗多糖的提取率
43.选择纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶合适的酶解温度、料液比以及酶解时间范围，以桔梗多糖提取率为指标进行单因素实验，分别研究酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量
计为：纤维素酶(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)，果胶酶(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)、木瓜蛋白酶(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)对桔梗多糖提取率的影响。
44.步骤一、桔梗根的预处理：将新鲜桔梗根洗净去除泥沙，再置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛后，获得预处理的桔梗粉末。
45.步骤二、单一酶解方法：取1g预处理后的桔梗粉末，ph为5.8，固定酶解温度为50℃，酶解时间为60min，料液比1：25g/ml，选择木瓜蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶按照质量比0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％进行单因素试验。反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入塑料离心管中离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为5min，离心完成后，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖，根据公式计算桔梗多糖提取率。
46.多糖提取率/％＝m1/m2
×
m3
×
100％
47.式中：m1为桔梗多糖质量；m2为桔梗粉末质量；m3为桔梗多糖含量。
48.结果见图1，实验得到单一酶最佳加入量为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶1.5％。
49.3、正交试验
50.根据试验结果，进行正交实验，筛选出复合酶配比的加入量对桔梗多糖提取率的影响，因素水平见表1，正交实验结果见表2。
51.表1正交实验设计表
[0052][0053]
表2复合酶配比的正交实验结果
[0054][0055][0056]
其中，表1中的水平是一个因素的可取值。上一步实验得出单一酶最佳加入量为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶1.5％，因此选择2、2、1.5上下的0.5的两个值进行实验。
[0057]
其中，表2中的k1，k2，k3每个因素各个水平下的指标总和，比如，k1表示“1”水平所对应的试验指标的数值平均值，其中6.758＝(6.447+7.035+6.792)/3，以此类推。r值表示极差，比如，1.017＝7.675－6.658，因为分析软件计算更为精确，所以图上数值为1.016。
[0058]
其中，正交实验(orthogonal experimental design)是一种设计实验的常用方法，旨在通过最小化因素间的相互干扰和交互作用，来确定各个因素对实验结果的独立影响。具体步骤如下：
[0059]
1、确定实验目的和研究因素
[0060]
首先，需要明确研究目的和需要考察的因素。本研究研究复合酶配比的最佳加入量，选取了纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶三个需要考察的因素。
[0061]
2、构建正交表
[0062]
根据考虑的因素，构建一个正交表，该表列出了所有可能的因素组合。正交表的设计要求各因素之间相互独立，这意味着每个因素的变化不会影响其他因素的变化。这可以保证实验结果的可靠性和准确性。
[0063]
3、进行实验
[0064]
按照正交表列出的因素组合，进行实验，并记录实验结果。实验需要进行多次，以保证结果的可靠性。在每次实验中，只改变一个因素，其他因素保持不变。
[0065]
4、统计分析数据
[0066]
将实验结果进行统计分析，得到各因素的影响程度，可以使用方差分析(anova)、spss等统计方法进行分析。
[0067]
5、判断因素的显著性
[0068]
通过比较各因素的影响程度，可以判断哪些因素对实验结果有显著影响，哪些因素影响较小。
[0069]
6、优化设计方案
[0070]
根据实验结果，可以对的设计方案进行优化，以达到最优的性能和效果。
[0071]
通过正交实验，探究单一酶复合添加比例对多糖提取率的影响，从而获得最佳复合酶添加量，由表1和表2可知，最佳条件为：纤维素酶2％、果胶酶2％、木瓜蛋白酶2％，最佳复合酶配比对桔梗多糖对提取率达到8.251％。
[0072]
实施例2
[0073]
复合酶法提取桔梗多糖单因素实验
[0074]
①
酶解温度对多糖提取率
[0075]
精密称定实施例1方法预处理后的脱脂粉末约1g，添加0.02g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.02g木瓜蛋白酶，固定料液比为1：25g/ml，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的酶解温度下提取60min，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入塑料离心管中离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖，采用实施例1方法计算桔梗多糖提取率。
[0076]
结果见图2，当酶解温度达到50℃时桔梗多糖提取率达到顶峰，该温度可能是复合酶在实验条件下的最适温度，因此选择酶解温度为40℃、50℃、60℃作为后续响应面实验。
[0077]
②
料液比对桔梗多糖提取率的影响
[0078]
精密称定实施例1方法预处理后的脱脂粉末约1g，添加0.02g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.02g木瓜蛋白酶，固定酶解温度为50℃，分别以1：20g/ml、1：25g/ml、1：30g/ml、1：35g/ml、1：40g/ml五个不同料液比超声提取60min，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入塑料离心管中离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗
粗多糖，采用实施例1方法计算桔梗多糖提取率。
[0079]
结果见图3，随着溶剂的增加，桔梗多糖的提取率当料液比达到1：30g/ml时桔梗多糖提取率达到顶峰，随后出现下降趋势，因此选择料液比为1：25g/ml、1：30g/ml、1：35g/ml作为后续响应面实验。
[0080]
③
酶解时间对桔梗多糖提取率的影响
[0081]
精密称定实施例1方法预处理后的脱脂粉末约1g，添加0.02g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.15g木瓜蛋白酶，在料液比1：25g/ml、酶解温度50℃条件下，分别提取30min、60min、90min、120min、150min，反应结束后立即煮沸灭酶活，冷却至常温后，将浸提液离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入塑料离心管中离心，其中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm，离心时间为5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖，采用实施例1方法计算桔梗多糖提取率。
[0082]
结果见图4，当酶解时间达到90min时桔梗多糖提取率达到顶峰，此时复合酶和桔梗粉末充分混合，因此选择酶解时间为60min、90min、120min作为后续响应面实验。
[0083]
实施例3
[0084]
复合酶法提取工艺的响应面优化设计
[0085]
根据单一酶法提取桔梗多糖的结果，为了优化复合桔梗多糖的酶法提取工艺，选择根据响应面设计原理，结合单因素实验，选取酶解温度、料液比、酶解时间这三个因素，进行三因素三水平的响应面实验设计。因素水平如表3，实验结果如表4。
[0086]
表3响应面实验因素水平表
[0087][0088]
表4响应面实验设计结果
[0089][0090][0091]
本实验采用design－expert.v8.0.6软件对数据进行回归拟合，对表4的数据进行二次多项式拟合，得到二次多元回归模型：
[0092]
yield＝9.49+0.29a+0.37b－0.041c－0.38ab－0.14ac－0.32bc－1.07a2－
[0093]
0.92b2－1.41c2[0094]
其中，a表示温度、b表示料液比、c表示时间。
[0095]
其中，二次多元回归模型是响应面实验中常用的建模方法之一，它可以通过多个因素的变化来预测响应变量的变化。在响应面实验中，二次多元回归模型的意义在于通过
建立一个包含多个因素的数学模型来描述响应变量与这些因素之间的关系，同时通过分析回归系数来确定不同因素对响应变量的影响大小和方向。这样可以帮助研究人员预测响应变量在不同因素水平下的表现，并为优化实验条件提供指导。此外，二次多元回归模型还可以通过分析回归方程的显著性来确定模型的拟合优度，从而判断该模型是否可靠。如果模型的拟合优度较高，则可以利用该模型进行预测和优化实验条件。二次多元回归模型是进行响应面实验设计得到最重要的结果之一。
[0096]
在复合酶添加量为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶2％，酶解时间118.20min，料液比25.32ml/g，温度58.19℃的条件下，二次多元回归模型得出的最佳提取率预测值为9.01％。为了验证预测值与实际值是否存在误差，于是在复合酶添加量为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶2％，酶解时间118.20min，料液比25.32ml/g，温度58.19℃的条件下，进行了三组验证性实验，得到多糖实际提取率均值为9.06％，预测值与实际值相对误差较小，表现出较好的重现性，表示该二次多元回归模型建立成功。
[0097]
对桔梗多糖提取率进行验证试验，得到优化的提取工艺：
[0098]
按桔梗多糖提取率对最优工艺进行3组平行验证试验，根据实际情况对最优条件进行调整，即复合酶添加量为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶2％，酶解时间88.78min，料液比30.94ml/g，酶解温度51.04℃，桔梗多糖提取率的最大预测值为9.01％，在上述条件下，进行3组验证性实验测得多糖提取率均值为9.06％，预测值与实际值相对误差较小，表现出较好的重现性；
[0099]
并且，只添加单一纤维素酶的情况下，桔梗多糖的最佳提取率为8.117％；只添加单一果胶酶的情况下，桔梗多糖的最佳提取率为7.51％；只添加单一木瓜蛋白酶的情况下，桔梗多糖的最佳提取率为6.76％。而采用复合酶提取桔梗多糖的提取率为9.01％。对此，采用复合酶提取桔梗多糖较单一纤维素酶提取桔梗多糖提高了(9.01－8.117)/8.117＝11.0％；
[0100]
采用复合酶提取桔梗多糖较单一果胶酶提取桔梗多糖提高了(9.01－7.51)/7.51＝19.97％；采用复合酶提取桔梗多糖较单一木瓜蛋白酶提取桔梗多糖提高了(9.01－6.76)/6.76＝33.28％。因此，多糖提取率较单一酶提高了11.0％－33.28％。
[0101]
实施例4
[0102]
复合酶提取的桔梗多糖结构性质的测定
[0103]
①
桔梗多糖的纯化
[0104]
凝胶渗透色谱通过调节样品与色谱柱中凝胶之间的交互作用，实现对分子量大小不同的多糖进行分离纯化。大分子多糖由于比凝胶颗粒的孔隙大不能进入孔隙，使得大分子组分先流出，而小分子组分更易被凝胶颗粒吸附，导致最后才被洗脱。桔梗粗多糖用sevage法脱蛋白后，以5mg/ml的浓度上样至预平衡的sephacryl s－100凝胶层析柱上，流速为1.3ml/min，用蒸馏水进行洗脱。采用自动收集系统收集洗脱液，蒽酮－硫酸法监测多糖，绘制多糖的洗脱曲线，如图5所示，合并峰位置对应管数的洗脱液，经蒸发浓缩，冷冻干燥后，得到纯化多糖组分，命名为pgp1。
[0105]
②
分子量的测定
[0106]
本实验采用高效液相色谱－蒸发光散射检测法(hplc－elsd法)测定pgp1的相对分子量。色谱条件：agilent 1100series高效液相色谱仪，alltech 3300elsd检测器；色谱
柱：agilent pl aquael－oh mixed－h柱(4.60mm
×
150mm，8μm)；流动相为超纯水；进样量20μl。
[0107]
标准曲线的制备：葡聚糖标准品的保留时间为横坐标，纵坐标为葡聚糖标准品的分子量对数值(log mw)绘制标准曲线，得到标准曲线方程为log mw＝－0.8854t+13.298，r2＝0.9999。线性良好可以用来计算多糖分子量。经过本实验得到的桔梗多糖pgp1的保留时间为10.998min，计算出分子量为3.6kda，是一种新型小分子多糖。
[0108]
③
单糖组成的测定
[0109]
取200μl质量浓度为4mg/ml的多糖溶液，加入100μl三氟乙酸(4mol/l)溶液，n2封管，于110℃烘箱中水解2h。水解完成后，加入400μl甲醇于70℃条件下用n2吹干，重复3次以去除三氟乙酸。加入100μl naoh(0.3mol/l)溶解残渣，再加入100μl的0.5mol/lpmp－甲醇溶液于70℃孵育60min。冷却至室温后，加入100μl的0.3mol/l的hcl溶液，调节ph。使用超纯水定容至2ml，再加入2ml氯仿进行萃取，保留上层水相，经0.22μm滤膜过滤后进样分析。色谱条件：agilent1100series高效液相色谱仪，dad检测器；色谱柱：hypersl od 25柱(4.60mm
×
250mm，5μm)；柱温27℃；流速0.9ml/min；流动相：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(ph6.8)－乙腈(84：16)；检测波长250nm；进样量20μl。比较样品与混合标准单糖图谱，确定单糖组成和含量。
[0110]
经过本实验验证，桔梗多糖pgp1的单糖组成为甘露糖2.472％、鼠李糖3.511％、葡萄糖醛酸4.041％、半乳糖醛酸6.057％、葡萄糖16.613％、半乳糖12.807％、木糖8.892％和阿拉伯糖42.816％。
[0111]
实施例5
[0112]
桔梗多糖降血糖活性评价
[0113]
①
桔梗多糖对α－淀粉酶的抑制活性
[0114]
取α－淀粉酶溶液(1.0u/ml)和等体积的不同浓度的桔梗多糖溶液均匀混合，在37℃条件下孵育10min后，向混合液中加入500μl，1％的可溶淀粉溶液，在室温条件下继续孵育10min。然后加入1ml的3，5－二硝基水杨酸颜色指示剂终止反应，沸水浴5min后加入10ml蒸馏水稀释混合液，于540nm波长处测定吸光度值。按以下公式计算多糖样品对α－淀粉酶的抑制率：
[0115]
α－淀粉酶抑制率(％)＝[1－(a1－a2)/a3]＊100
[0116]
其中，公式中a1是桔梗多糖、酶和淀粉混合液的吸光度值，a2是缓冲溶液代替酶溶液的吸光度值，a3是缓冲溶液代替样品溶液的吸光度值。本实验用阿卡波糖作为阳性对照。
[0117]
桔梗多糖对α－淀粉酶的抑制活性结果如图6所示，随着浓度的增加，桔梗多糖对α－淀粉酶活性均表现出一定的抑制效果，ic50值为1.679mg/ml。在浓度为10mg/ml时，桔梗多糖对α－淀粉酶活性抑制率为64.21
±
1.66％，达到同浓度维生素c组的83.43％，表现出显著的降血糖活性。
[0118]
②
桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶的抑制作用
[0119]
将100μl的α－葡萄糖苷酶溶液(0.5u/ml)与100μl不同浓度桔梗多糖溶液混合均匀，在室温条件下孵育10min，然后向混合溶液中加入100μl对硝基苯基α－d－吡喃葡萄糖苷溶液(pnpg)启动反应，混匀后在室温条件下孵育20min，最后向反应液中加入1ml碳酸钠溶液(1m)停止反应后，于405nm波长处测定吸光度值。按以下公式计算多糖样品对α－葡萄
糖苷酶的抑制率：
[0120]
α－葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1－(a1－a2)/a3]＊100
[0121]
公式中a1是桔梗多糖、酶和pnpg混合液的吸光度值；
[0122]
a2是缓冲溶液代替酶溶液后混合物的吸光度值；
[0123]
a3是缓冲溶液代替样品溶液的吸光度值。本实验用阿卡波糖作为阳性对照。
[0124]
桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶的抑制活性结果如图7所示，随着浓度的增加，桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶活性均表现出一定对抑制效果，ic50值为1.301mg/ml。在浓度为10mg/ml时，抑制率能达到68.37
±
0.387％，达到同浓度维生素c组的91.11％，该实验数据说明桔梗多糖具有较强的降血糖活性潜力。
[0125]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。

技术特征：
1.一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：步骤一、桔梗根的预处理：将新鲜桔梗根洗净去除泥沙，再置于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛后，获得预处理的桔梗粉末；步骤二、桔梗多糖的酶法提取：将预处理后的桔梗粉末与水混合，调节料液比为1：20～1：40g/ml，调节温度30～70℃，添加复合酶后，快速混匀，置于水浴锅中浸提反应30～150min，反应结束后立即煮沸灭酶活10min，冷却至常温后，将浸提液离心20min，过滤布除去桔梗粉末残渣，向得到的上清液中加入4倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱中冷藏过夜后，倒入离心管中离心5min，弃上清液，将得到的沉淀置于－80℃冰箱冷冻2h后，置于冻干机中，冷冻干燥至恒重，得到桔梗粗多糖；步骤三、桔梗多糖的纯化：以5mg/ml的浓度上样至预平衡的sephacryl s－100凝胶层析柱上，流速为1.3ml/min，用蒸馏水进行洗脱，采用自动收集系统收集洗脱液，每个管收集4ml，收集100管，采用蒽酮－硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，浓缩洗脱液，冷冻干燥后得到分子量均一的桔梗多糖。2.根据权利要求1所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：上述步骤二中，离心温度为4℃，离心转速为9500rpm。3.根据权利要求1所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：上述步骤二中，水的体积用量以预处理后的桔梗粉末质量计为20～40ml/g，酶解温度为30～70℃，酶解时间为30～150min。4.根据权利要求3所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：上述步骤二中，料液比为30.94ml/g，酶解温度为51.04℃，酶解时间为88.78min。5.根据权利要求1所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：上述步骤二中，所述复合酶是由果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶组成。6.根据权利要求5所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：所述果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1～3％，所述木瓜蛋白酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％，所述纤维素酶添加量以预处理后的桔梗粉末质量计为1～3％。7.根据权利要求6所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法，其特征在于：所述纤维素酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，所述果胶酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计2％，所述木瓜蛋白酶添加量以预处理后桔梗粉末质量计1.5％。8.根据权利要求1至7中所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖的制备方法制备得出的一种具有降血糖效果的桔梗多糖，其特征在于：所述桔梗多糖的分子量为3.13kda，所述桔梗多糖包括甘露糖2.472％、鼠李糖3.511％、葡萄糖醛酸4.041％、半乳糖醛酸6.057％、葡萄糖16.613％、半乳糖12.807％、木糖8.892％和阿拉伯糖42.816％。9.根据权利要求8所述的一种具有降血糖效果的桔梗多糖，其特征在于：所述桔梗多糖对α－淀粉酶抑制活性ic50值为1.679mg/ml，所述桔梗多糖对α－葡萄糖苷酶的ic50值为1.301mg/ml。

技术总结
本发明涉及桔梗多糖制备技术领域，尤其是一种具有降血糖效果的桔梗多糖及其制备方法，所述桔梗多糖包括甘露糖2.472％、鼠李糖3.511％、葡萄糖醛酸4.041％、半乳糖醛酸6.057％、葡萄糖16.613％、半乳糖12.807％、木糖8.892％和阿拉伯糖42.816％；本发明经验证试验得到最佳复合酶添加比例为纤维素酶2％，果胶酶2％，木瓜蛋白酶1.5％，其桔梗多糖提取率为9.01％，多糖提取率较单一酶提高了11.0％～33.28％。本发明操作简单便捷、提取条件温和、能耗低、污染小，得到的桔梗多糖纯度达到97％以上，分子量小于4KDa，是一种新型小分子多糖，同时提取得到的桔梗多糖对α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶活性的抑制效果，拓宽了桔梗多糖的应用领域。糖的应用领域。糖的应用领域。


技术研发人员：张彦青 李卫 房雷雷 杨坛 解军波
受保护的技术使用者：天津商业大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/10/8