虎杖苷在制备用于促基因甲基化的制剂中的应用

1.本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及虎杖苷在制备用于促基因甲基化的制剂中的应用。


背景技术：

2.骨髓增生异常综合征(mds)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，以无效造血、难治性血细胞减少以及高风险向急性白血病转化为特点，目前发病率已超过急性白血病，为血液系统最常见的致死性疾病。mds的发病与免疫紊乱，基因突变，染色体异常以及dna甲基化密切相关，其中dna甲基化受到越来越多的研究者关注。dna甲基化属于表观遗传学范畴，是指在dna甲基转移酶(主要包括dnmtt1，dnmt3a和dnmt3b三种酶)的作用下，由s-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体，cpg序列胞嘧啶选择性添加甲基基团形成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。dna甲基化能够影响基因的下游表达，同时由于dna甲基化是可逆的，因而也是理想的药物作用靶点。研究表明，dna异常甲基化是导致mds发病及进展的重要分子机制，针对mds异常甲基化的治疗是当前mds的重要治疗策略。
3.现有研究表明，mds有大量异常的高甲基化基因，基因异常高甲基化包括抑癌基因的高甲基化是mds出现造血紊乱的重要因素，而针对抑癌基因高甲基化的去甲基化治疗是目前临床上治疗mds的主要手段之一，主要代表药物包括地西他滨、阿扎胞苷，但是去甲基化治疗失败依然十分常见，亟需开发新型甲基化作用药物；另一方面，mds中存在大量异常的低甲基化基因，基因异常低甲基化尤其是癌基因的低甲基化也是导致mds进展的重要分子机制，然而目前缺乏针对mds异常低甲基化的促甲基化药物，因而开发针对癌基因异常低甲基化的促甲基化药物研究，有可能会弥补当前mds去甲基化治疗的不足。
4.虎杖属于清热解毒类中药，《药性论》言虎杖能“压一切热毒”，《本草拾遗》言其“主风在骨节间及血瘀”。虎杖中包含多种化合物成分，主要有二苯乙烯苷及其苷元、蒽醌苷及其苷元等重要活性成分。其中，虎杖苷属于二苯乙烯类，因其具有广泛的药理作用，受到众多研究者的关注。近年来有研究报道虎杖苷具有抗肿瘤作用，可以抑制肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌细胞的增殖、分化。然而其对mds的作用效应，国内外未见相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种虎杖苷的新用途。
6.为达上述目的，本发明提供了虎杖苷在制备用于促基因甲基化的制剂中的应用，
7.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述促基因甲基化为促mds恶性细胞的dna促甲基化。
8.本发明还提供了虎杖苷在制备用于提升细胞基因甲基化转移酶表达水平的制剂中的应用。
9.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述细胞为mds恶性细胞。
10.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述基因甲基化转移酶包括dnmt3a、
dnmt3b、dnmt1中的一种或多种。
11.本发明还提供了虎杖苷在制备用于抑制mds恶性细胞增殖和/或增加mds恶性细胞凋亡的制剂中的应用。
12.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述mds恶性细胞凋亡包括细胞早期凋亡和/或晚期凋亡。
13.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述mds恶性细胞来源于哺乳动物或人。
14.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述所述mds恶性细胞为skm-1细胞。
15.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述促甲基化药物为治疗癌症的药物。
16.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述癌症为骨髓增生异常综合征。
17.根据本发明一些具体实施方案，其中，所述虎杖苷具有式(i)所示结构：
[0018][0019]
本发明涉及的一些术语如下定义所示：
[0020]
骨髓增生异常综合征(mds)：是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，以无效造血、难治性血细胞减少以及高风险向急性白血病转化为特点，为血液系统常见的恶性肿瘤。
[0021]
dna甲基化：dna甲基化属于表观遗传学范畴，是指在dna甲基转移酶的作用下，由s-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体，cpg序列胞嘧啶选择性添加甲基基团形成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。
[0022]
去甲基化：5-甲基胞嘧啶在各种dna甲基化酶的介导下丢失甲基基团的生物学过程。
[0023]
促甲基化：5-胞嘧啶在各种dna甲基化酶的介导下获得甲基基团的生物学过程。
[0024]
skm-1细胞：目前公认的mds细胞株，该细胞株建立于1例mds转单核细胞白血病的患者。
[0025]
综上所述，本发明提供了虎杖苷在制备促甲基化药物中的应用。本发明的方案具有如下优点：
[0026]
(1)虎杖苷为植物来源药物，来源广泛，容易获取。
[0027]
(2)虎杖苷能够抑制mds恶性细胞的增值，增加mds恶性细胞的凋亡，因其植物来源属性，其本身的毒性作用一般比较轻微。
[0028]
(3)具有独特的促甲基化效应，不同于其它已经临床使用的去甲基化药物，如阿扎胞苷与地西他滨。
附图说明
[0029]
图1为30μmol
·
l-1
虎杖苷处理skm-1细胞后诱导的差异甲基化基因数目，包括450个高甲基化基因和177个低甲基化基因。
[0030]
图2为30μmol
·
l-1
虎杖苷处理组与dmso控制组差异甲基化基因的热图；其中g1代表dmso控制组，g3代表虎杖苷处理组，颜色越红表示甲基化值越高，颜色越蓝表示甲基化值越低。
[0031]
图3为30μmol
·
l-1
虎杖苷处理组与dmso控制组差异甲基化基因的火山图。红色代表有统计学差异的高甲基化基因，绿色代表有统计学差异的低甲基化基因。
[0032]
图4为各组skm-1细胞中dnmt3a，dnmt3b和dnmt1的蛋白表达电泳图。
[0033]
图5为虎杖苷对skm-1细胞dnmt3a的蛋白表达作用图。
[0034]
图6为虎杖苷对skm-1细胞dnmt3b的蛋白表达作用图。
[0035]
图7为虎杖苷对skm-1细胞dnmt1的蛋白表达作用图。
具体实施方式
[0036]
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
[0037]
各实施例中所用具有式(i)结构的虎杖苷，购于中国食品药品检定研究院，货号111575，纯度87.3％，溶解于二甲基亚砜(dmso)备用。
[0038][0039]
各实施例中所用skm-1细胞由江苏血液病研究所提供，属于人源mds细胞株，以含10％胎牛血清(美国gibco公司，货号：10100-147)的rpmi1640为培养液，在co2浓度为5％，37℃的培养箱中培养。
[0040]
实施例1
[0041]
虎杖苷抑制skm-1细胞的增殖：
[0042]
取指数生长期skm-1细胞，将细胞密度调至2
×
105个/ml，加入不同浓度虎杖苷溶液(虎杖苷终浓度分别为25、50、100、200μmol
·
l-1
)，另设置空白对照组与dmso控制组，实验复孔为5个，培养72h后，取出96孔板，加入细胞增殖与活性检测cck-8试剂(南京恩晶生物科技有限公司，e1ck-000208-10)，培养箱继续培养1h，在460nm处测定吸光度值，计算虎杖苷在体外对mds细胞株skm-1的抑制作用(表1)，数据提示，虎杖苷对skm-1细胞具有显著的抑制作用，证明了虎杖苷对mds的体外治疗效应。
[0043]
表1不同浓度虎杖苷对skm-1细胞的抑制率(n＝4)
[0044][0045]
注：与空白组比较*，p《0.05。
[0046]
实施例2
[0047]
虎杖苷增加skm-1细胞的凋亡：
[0048]
取指数生长期skm-1细胞，将细胞密度调至2
×
105个/ml，加入不同浓度虎杖苷溶液(虎杖苷终浓度分别为10，30μmol
·
l-1
)，另设置空白对照组与dmso控制组，培养72h后，与空白组比较，10μmol
·
l-1
虎杖苷不能增加skm-1细胞早期与晚期凋亡细胞的比例，30μmol
·
l-1
虎杖苷可增加skm-1细胞早期与晚期凋亡细胞的比例，差异有统计学意义(p＜0.01)，见表2。
[0049]
表2虎杖苷对skm-1细胞凋亡的影响(n＝3)
[0050][0051]
实施例3
[0052]
全基因组甲基化检测显示虎杖苷具有显著的促甲基化效应：
[0053]
取指数生长期skm-1细胞，将细胞密度调至2
×
105个/ml，实验分为两组：dmso控制组，30μmol
·
l-1
虎杖苷处理组，培养72h后提取dna进行全基因组范围的甲基化检测(甲基化850k芯片)，与dmso控制组相比，30μmol
·
l-1
共有627个基因的甲基化位点发生改变，其中450个基因为高甲基化基因，低甲基化基因177个，其中虎杖苷诱导的高甲基化基因占整个差异甲基化基因的71.8％，显示了虎杖苷的促甲基化效应(图1)。图2为热图，热图能够从总体上反应两组之间的差异甲基化情况，在本实施例中，与dmso控制组相比，虎杖苷处理组有更多的高甲基化基因；图3为虎杖苷处理组与dmso控制组差异甲基化基因的火山图，红色点代表高甲基化基因，绿色点代表低甲基化基因，黑色点代表基因甲基化程度无差异，火山图显示，虎杖苷处理组有更多的高甲基化基因。表3分别列出了差异程度最高的高甲基化与低甲基化基因(top20)。
[0054]
表3虎杖苷诱导的部分差异甲基化基因(top20)
[0055]
高甲基化基因差异甲基化值低甲基化基因差异甲基化值irs10.207208194cdc42se2-0.092095928
adarb10.17578487wwc2-0.092629947prdm20.171322652znf157-0.093200326tdrkh0.152538244ventxp1-0.095622002krt730.148141415pten-0.096063585map3k130.147540075naprt-0.096578469phf30.143946264isl1-0.097430488kiaa20120.143407812vps13b-0.097883057slitrk30.136868081hcp5-0.100238735rad210.136464191ppp6r3-0.10056003mcf2l0.135744392sept14-0.103926079atp1b30.13427177dab1-0.104135961jph20.132775051fam208b-0.105264436mgc232840.131444927rgs4-0.105345072hectd10.130863923tptep1-0.106468188c1qtnf10.126635065igf1r-0.10729783adam200.124070615gphn-0.109732574cntn20.122745168cdc42se2-0.110948819rnf1820.122417265ppap2a-0.111873334psma3-as10.121650224tll1-0.111883768
[0056]
实施例4
[0057]
虎杖苷促甲基化效应的具体机制：提高skm-1细胞dna甲基化转移酶表达取指数生长期skm-1细胞，将细胞密度调至2
×
105个/ml，加入不同浓度虎杖苷溶液(虎杖苷终浓度分别为0，10，30μmol
·
l-1
)，另设置dmso控制组，培养72h后进行蛋白表达检测(wb法)，观察虎杖苷对skm-1细胞dna甲基化转移酶dnmt3a，dnmt3b和dnmt1的表达(图4)。wb检测显示，与空白对照组(虎杖苷浓度为0)比较，10μmol
·
l-1
虎杖苷增加skm-1细胞dnmt3a的表达(p＜0.05)，对dnmt3b与dnmt1的表达有增加趋势，但是差异无统计学意义；30μmol
·
l-1
虎杖苷可增加dnmt1，dnmt3a和dnmt3b的表达，差异均有统计学意义(p＜0.05)(图5-图7)。

技术特征：
1.虎杖苷在制备用于促基因甲基化的制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述促基因甲基化为促mds恶性细胞的dna甲基化。3.虎杖苷在制备用于提升细胞基因甲基化转移酶表达水平的制剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述细胞为mds恶性细胞。5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述基因甲基化转移酶包括dnmt3a、dnmt3b、dnmt1中的一种或多种。6.虎杖苷在制备用于抑制mds恶性细胞增殖和/或增加mds恶性细胞凋亡的制剂中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述mds恶性细胞凋亡包括细胞早期凋亡和/或晚期凋亡。8.根据权利要求2、4或6所述的应用，其中，所述mds恶性细胞来源于哺乳动物或人。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述mds恶性细胞为skm-1细胞。10.根据权利要求1～9任意一项所述的应用，其中，所述虎杖苷具有式(i)所示结构：

技术总结
本发明提供了式(I)所示虎杖苷在制备促基因甲基化的制剂中的应用，虎杖苷能够抑制MDS恶性细胞的增值，增加MDS恶性细胞的凋亡，因其植物来源属性，其本身的毒性作用一般比较轻微，微，微，


技术研发人员：周庆兵
受保护的技术使用者：中国中医科学院西苑医院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/10/8