一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnbHLH107及其应用

一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107及其应用。


背景技术：

2.紫竹又称乌竹，喜温暖湿润气候，稍耐寒，秆为紫黑色、红紫色，具有重要的观赏价值，是中国古典园林建筑中常用的竹种之一。主要分布在浙江、江苏、安徽、福建、贵州和广州等地。紫竹集观赏、工艺品加工与竹材等众多优点于一体，可广泛用于家居、文体用品和工艺品等方面，是一种极具发展潜力的新兴竹类资源。随着生长发育紫竹秆表皮的颜色会逐渐加深，一般由绿色变为紫黑色，目前有关紫竹生长发育过程中秆色变化的关键调控基因功能研究尚未开展。
3.类黄酮(flavonoids)化合物是一类在植物中发现的天然多羟基酚类次生代谢物质，广泛分布于植物界，具有很高的生物活性。它的基本结构：两个苯环之间由含有3碳的吡喃环与15碳苯丙烷环相连接形成一个核心的c骨架结构。该骨架可在不同酶的酰基化、甲氧基化、羟基化或o-糖基化形成不同的种类，具体可分为六大类，分别是黄酮醇(flavonols)、花青素(anthocyanidins)、黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavones)和黄烷醇(flavanols)。类黄酮物质不仅是植物体内天然合成的重要次生代谢产物，还是植物体内十分重要的抗氧化剂，对于清除体内累积的活性氧，提高抗氧化活力具有重要的作用，类黄酮化合物的酚环部分可以发生不同程度的羟基化，使其具有接收电子的能力，从而最大程度地减少活性氧，对于提高植物的抗逆性具有关键的作用。除此之外，类黄酮物质还可以保护植物免受病原体和非生物胁迫的侵害，参与植物花色，果实色泽的形成，以及具有抗炎和抗癌的作用。
4.植物bhlh转录因子能够参与调控多种生理途径，如花器官发育、光形态建成、表皮细胞命运(毛状体发生、根毛形成)、气孔开关、激素应答、金属离子体内平衡等。然而，现有技术中未见报道有关紫竹bhlh基因及其用途。
5.本发明对pnbhlh107进行了克隆和分子机制研究，初步探究紫竹生长发育过程中类黄酮合成的分子机制，不仅为进一步解竹子秆色发育分子机制研究奠定基础，还可以为竹类乃至其他林木品种的观赏性状遗传改良奠定一定的研究基础。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107及其应用的技术方案。
7.本发明是通过以下技术方案实现：
8.本发明第一方面提供了一种紫竹类黄酮合成相关基因pnbhlh107，该核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明第二方面提供了上述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107的
编码蛋白，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.本发明第三方面提供了含有上述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107的载体。
11.本发明第四方面提供了上述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107或上述的载体在调控植物类黄酮化合物累积中的应用。
12.进一步，所述的应用，使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。
13.本发明第五方面提供了上述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107或上述的载体在调控竹子杆色中的应用。
14.进一步，所述的应用，使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。
15.本发明第六方面提供了一种调控植物类黄酮化合物累积的方法，使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnbhlh107。
16.进一步，所述的方法，具体包括：
17.1)采集一年生紫竹叶片，进行rna提取，反转录成cdna，克隆出pnbhlh107的cds序列，再将其连接pmd18-t载体进行测序，鉴定正确后连接过表达载体pc-1300gfp；
18.2)将构建的过表达载体转入植物愈伤组织中，使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。
19.本发明具有以下有益效果：
20.1、本发明首次从紫竹中获得pnbhlh107基因以及编码蛋白，并验证了其调控类黄酮化合物含量的生物学功能。
21.2、本发明首次将紫竹pnbhlh107基因在烟草中过量表达，运用pcr方法证明该基因已成功整合到烟草基因组中，即阳性植株。
22.3、本发明对转基因烟草和野生型烟草进行类黄酮化合物含量分析，结果表明转基因植株类黄酮化合物含量均较野生型高，说明pnbhlh107基因的过表达提高了转基因烟草类黄酮化合物含量的累积。
附图说明
23.图1pnbhlh107在紫竹发育过程的基因表达量，zz5：5月份紫竹秆表皮，zz6：6月份紫竹秆表皮，zz10：10月份紫竹秆表皮，zz12：12月份紫竹秆表皮。**代表极显著(p≤0.01)；
24.图2pnbhlh107转基因烟草株系阳性植株基因表达水平，**代表极显著(p≤0.01)；
25.图3pnbhlh107转基因株系烟草和野生型烟草株系的类黄酮化合物物质含量变化，**代表极显著(p≤0.01)；
26.图4pnbhlh107转基因烟草不同株系中类黄酮化合物合成途径关键基因的表达水平，*代表显著(p≤0.05)，**代表极显著(p≤0.01)。
具体实施方式
27.下面结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
28.实施例1：紫竹pnbhlh107基因的克隆
29.1、材料准备：紫竹叶片采集来自于浙江省杭州市临安区浙江农林大学东湖校区翠
竹园，置于-80℃保存，用于后续实验使用。
30.2、rna提取
31.参考杭州新景simgen生物有限公司rna提取试剂盒说明书进行rna的提取，具体步骤如下：
32.(1)将紫竹叶片放入灭菌后的研钵内进行研磨至粉末状，称取300mg样品于1.5mlrna-free离心管内，加入600μl已加β-巯基乙醇的bufferrct，旋涡震荡，使其充分溶解。
33.(2)向步骤(1)的1.5mlrna-free离心管内，加入600μlbufferex，充分震荡，使其混合均匀，12000rpm离心5min。
34.(3)取步骤(2)上清液400μl，转入新的1.5mlrna-free离心管内。
35.(4)在步骤(3)的上清液中加入400μlbufferk并混合均匀，将混合液全部转移到过滤柱中，盖上管盖，13500rpm离心2min。
36.(5)将步骤(4)的过滤柱丢弃，向滤液中加入700μl70％乙醇并直接用吸头混合均匀。
37.(6)吸取步骤(5)中混合液700μl加入到核酸纯化柱中，13000rpm离心1min。
38.(7)弃2ml离心管中的滤液，并将核酸纯化柱放回到2mlrna-free离心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸纯化柱中，13000rpm离心1min。
39.(8)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2mlrna-free离心管中，在核酸纯化柱中加入500μlbufferwa(已加入无水乙醇)，盖上管盖，13000rpm离心1min。
40.(9)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2mlrna-free离心管中，在核酸纯化柱中加入600μlbufferwbr(已加入无水乙醇)，盖上管盖，13000rpm离心1min。
41.(10)弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14000rpm离心1min。
42.(11)弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5mlrna-free离心管中，在纯化柱的膜中央加入40μlrnase-freewater，盖上管盖，室温静置1min，13000rpm离心1min。
43.3、rna反转录
44.参考novoscriptv plus all-in-one 1st strand cdna synthesis supermix(gdna purge)试剂盒说明书，具体步骤如下：
45.(1)去除基因组dna。
46.(2)
[0047][0048]
以上试剂均于冰上配制反应混合液，离心混匀后42℃孵育5min。
[0049]
(2)rna反转录cdna。
[0050]
在步骤一的pcr管中依次加入以下反应混合液，彻底混匀离心后，在50℃下反应
15min，75℃反应5min，冰上冷却。
[0051][0052]
(3)反转录完成cdna稀释10倍后，-20℃保存，用于后续实验。
[0053]
4、基因克隆
[0054]
(1)以毛竹基因组为参考数据库，在紫竹秆皮生长发育转录组数据中筛选出差异表达显著的ph02gene39864的同源基因，以此设计引物，序列如下：
[0055]
pnbhlh107-cds-f：atggctgcatgccaacattt(如seq id no.3所示)
[0056]
pnbhlh107-cds-r：ctatatggacatgattgagtaatgtgatt(如seq id no.4所示)
[0057]
(2)pcr扩增
[0058]
以紫竹叶片cdna为模板，使用相应的引物进行pcr扩增，反应程序为：95℃5min；95℃5s,60℃30s,72℃60s,32cycles；72℃10min。扩增体系为：
[0059][0060]
(3)制备1.2％琼脂糖凝胶，进行琼脂糖凝胶电泳实验，电压设置为125v，时间设置为20min，检测目的基因的片段大小是否符合预期，进行下一步割胶回收验证。
[0061]
(4)胶回收纯化，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳得到目的条带后，参考simgen生物公司dna胶回收试剂盒回收并纯化。
[0062]
(5)连接反应
[0063]
参考takara公司pmdtm18-tvectorcloningkit说明书，连接体系如下所示：
[0064][0065]
(6)连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α
[0066]
参考上海唯地生物技术有限公司大肠杆菌感受态dh5α转化说明书，具体步骤如下所示：
[0067]
①
将购置的大肠杆菌感受态dh5α于冰上冻融，加入10μl连接产物，轻弹管底混匀，冰上静置30min。
[0068]
②
42℃90s后冰上静置2min。
[0069]
③
加入300μl无抗lb培养基，220rpm，37℃振荡培养1h。
[0070]
④
取100μl左右培养液均匀涂布于luria-bertani(lb)培养基(含氨苄青霉素)，37℃培养12h。
[0071]
⑤
挑选单克隆菌落于1ml含有相应抗生素液体培养基离心管中，37℃，220rpm震荡培养4-5h，直到菌液浑浊，进行菌液pcr鉴定。
[0072]
⑥
将步骤5鉴定正确的阳性菌液送到上海生工生物公司测序，每条序列选取3个以上单克隆，减少pcr过程中错配对基因序列确认的影响。
[0073]
最终克隆得到的紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107的核苷酸序列如seq id no.1所示，紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0074]
实施例2：紫竹pnbhlh107表达模式分析
[0075]
紫竹秆色不同发育时期pnbhlh107表达模式采集紫竹同一年份不同时期(5月份，6月份，10月份，12月份)秆色发育样品，提取其秆表皮rna，反转录为cdna(方法参考实施例1)，对pnbhlh107在紫竹生长发育过程中，不同时期秆色变化中的表达量进行分析，结果如图1所示，在紫竹秆色变化的过程中，pnbhlh107基因的表达量呈现先增高再降低的趋势，推测pnbhlh107可能在紫竹秆色发育过程中发挥重要的作用。
[0076]
实施例3：pnbhlh107过表达载体构建
[0077]
取实施例1中来自于浙江省杭州市临安区浙江农林大学东湖校区翠竹园的一年生紫竹叶片，进行rna提取，反转录成cdna，克隆出pnbhlh107的cds序列，再将其连接pmd18-t载体进行测序，鉴定正确后连接过表达载体pc-1300gfp。
[0078]
实施例3：pnbhlh107基因异源转化烟草提高其类黄酮化合物含量的应用
[0079]
1、转基因烟草阳性植株筛选和培养
[0080]
(1)dna提取及pcr检测
[0081]
参照dna提取试剂盒说明书提取烟草叶片dna，具体步骤如下：
[0082]
①
将300～500mg烟草幼嫩叶片加入液氮，迅速将其研磨至粉末状。将1.5ml离心管用液氮预冷，称取100mg样品研磨成粉末状。
[0083]
②
磨后的样品中加入500μl 65℃预热的buffer pl，旋涡振荡30s混匀，65℃水浴10min，每隔3min，摇晃一次样品，使其充分裂解。
[0084]
③
加入350μl buffer k，盖上管盖，用力摇晃15s，旋涡振荡30s。13 000rpm离心5min。
[0085]
④
将步骤3中离心获得的上清液倒入核酸纯化柱中，再将核酸纯化柱置于2ml离心管中，盖上管盖，12 000rpm离心30s。
[0086]
⑤
弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500buffer wa(已经加入无水乙醇)，盖上管盖，12 000rpm离心30s。弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl buffer wb(已经加入无水乙醇)，12 000rpm离心30s。
[0087]
⑥
弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，盖上管盖。13 500rpm离心2min。
[0088]
⑦
弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个1.5ml离心管中，在纯化柱中加入20μl 65℃预热的buffer te，盖上管盖，室温静置2min，12 000rpm离心30s。将洗脱的dna储存于-20℃，用于后续实验。
[0089]
(2)rna提取及pnbhlh107基因表达量的检测
[0090]
①
参照实施例1中的rna提取方法进行转基因烟草rna的提取，这里不再赘述。
[0091]
②
将上述提取的rna进行pnbhlh107基因的表达量检测。由图2可知，不同pnbhlh107转基因烟草株系的表达量存在着较大差异。
[0092]
(3)烟草的遗传转化培养
[0093]
①
预培养：烟草种子于75％的酒精消毒30s，无菌水清洗1min，再使用84消毒液消毒3-5min，无菌水清洗3次，1min/次。将消毒后的烟草种子播种于萌发培养基上，23℃16h/8h(光照/黑暗)培养4-5周，将无菌烟草叶片用手术刀切成小块放接种于培养基上。
[0094]
②
农杆菌侵染，共培，诱导：取存于-80℃的农杆菌菌液，进行大量摇菌，收集菌落于烟草侵染液中，制备od600＝0.2的农杆菌重悬液，将预培养2-3d的烟草叶片接种于农杆菌悬浮液中侵染10-15min，将侵染后的烟草叶片接种于滤纸上，经晾干后接种于共培养基上，黑暗培养48-72h。将共培养2d后的叶片转入诱导培养基上诱导愈伤，约10d，待其长出愈伤组织。
[0095]
③
筛选抗性愈伤：挑选符合标准的愈伤组织，接种于对应抗性的筛选培养基上，培养时间15-30d，培养温度：21-25℃。
[0096]
④
分化及生根：将二筛生长旺盛的抗性愈伤组织接种至分化培养基上，4-5个愈伤/皿，23℃16h/8h(光照/黑暗)培养15-30d。分化过程中，待愈伤组织有幼苗形成，将其接种至壮苗培养基上生长7-10d。
[0097]
2、转基因烟草的类黄酮化合物含量测试
[0098]
参考北京solarbio生物公司植物类黄酮含量检测试剂盒说明书，对转基因植株的类黄酮含量进行测定，具体步骤如下：
[0099]
①
样本处理：
[0100]
将样本烘干至恒重，用粉碎仪将其粉碎，过30-50目筛后，称取约0.1g，加入1ml60％乙醇，使用超声提取法进行提取，超声功率为300w,粉碎5s，间隙8s，温度设置为60℃，提取30min。然后使用离心机离心(12000rpm，25℃，10min)，取上清，并用60％乙醇溶液将上清液定容至1ml，待测。
[0101]
②
类黄酮含量测定步骤：
[0102]
a.可见光光度计预热30min以上，波长调为470nm，调零。
[0103]
b.标准溶液的制备：将10mg/ml芦丁标准溶液用标准品稀释至1.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.078，0.039和0.02mg/ml备用。
[0104]
c.操作表如下：
[0105][0106]
③
类黄酮含量计算：
[0107]
a.标准曲线绘制：以芦丁浓度为横坐标，δa
′
为纵坐标绘制标准曲线y＝kx+b，将δa带入可求x(mg/ml)；
[0108]
b.类黄酮含量(mg/g)＝x
×
v/w(v：提取液体积，w：样本质量)。
[0109]
在类黄酮合成途径中，转录因子对类黄酮物质的合成具有一定的作用。为了探究pnbhlh107对类黄酮物质的合成的具体作用。我们通过实施例3构建了pnbhlh107过表达载体转入野生型烟草愈伤组织中，得到转基因烟草。我们对转基因烟草类黄酮化合物含量进行了测定，结果如图3所示。通过分析转基因烟草与野生型烟草中类黄酮化合物物质的含量变化，我们发现在烟草中过表达pnbhlh107可以显著提高转基因烟草中类黄酮化合物物质的合成。
[0110]
3、pnbhlh107转基因植株中苯丙氨酸合成途径相关基因的表达量分析
[0111]
在烟草类黄酮化合物合成途径中，结构基因发挥着重要的作用，比如：c4l,chs,chi,c4h,f3h,f3
′
h,fls,anr,dfr,ufgt等，且结构基因的表达一般会受到调节基因(转录因子)的调控。为了验证pnbhlh107基因是否参与类黄酮物质合成代谢途径，我们分别提取过表达、野生型烟草的rna，通过qrt-pcr手段检测上述基因表达量，结果如图4所示。通过相关基因的表达量分析，我们可以发现在多数过表达烟草株系中，类黄酮合成途径中相关基因(chs,fls,ufgt,f3h,f3
′
h,c4h,chi)表达量都有极显著的提高，其中在oe1与oe2两个株系中4cl基因的表达量轻微显著上调，在与oe1与oe6两个株系中anr基因的表达量轻微显著上调，综上所述，在烟草过表达pnbhlh107转基因株系中，烟草类黄酮合成途径中关键酶基因的表达量均被显著性上调，因此推测pnbhlh107可能在烟草的类黄酮合成途径中促进类黄酮物质的合成。
[0112]
以上结果表明转基因烟草类黄酮化合物的累积均显著高于野生型烟草，并且类黄酮化合物合成途径中关键酶基因的表达量显著提高。

技术特征：
1.一种紫竹类黄酮合成相关基因pnbhlh107，其特征在于：该核苷酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107的编码蛋白，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.含有权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107的载体。4.如权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107或权利要求3所述的载体在调控植物类黄酮化合物累积中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。6.如权利要求1所述的一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因pnbhlh107或权利要求3所述的载体在调控竹子杆色中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。8.一种调控植物类黄酮化合物累积的方法，其特征在于：使植物包含基因pnf3h或使植物过表达基因pnbhlh107。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：具体包括：1)采集一年生紫竹叶片，进行rna提取，反转录成cdna，克隆出pnbhlh107的cds序列，再将其连接pmd18-t载体进行测序，鉴定正确后连接过表达载体pc-1300gfp；2)将构建的过表达载体转入植物愈伤组织中，使植物包含基因pnbhlh107或使植物过表达基因pnbhlh107。

技术总结
一种紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnbHLH107及其应用，属于分子生物技术领域。本发明一方面提供了紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnbHLH107以及其编码蛋白，另一方面提供了紫竹类黄酮化合物合成相关基因PnbHLH107的用途。本发明提供了一种重要的并且可能具有普适性的调控紫竹类黄酮合成的基因资源，为培育紫竹秆色变化的植物品种提供了优秀的候选基因。因。因。


技术研发人员：侯丹 林新春 王豪杰 张朋威 黄芝诺
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/10/8