轮状病毒疫苗和生产轮状病毒疫苗的方法与流程

1.本公开属于生物制药
技术领域：
：，具体涉及一种轮状病毒疫苗和生产轮状病毒疫苗的方法。
背景技术：
：：2.轮状病毒感染是造成5岁以下婴幼儿严重脱水性腹泻的主要病因。轮状病毒疫苗是预防轮状病毒感染的主要方法。人对轮状病毒的免疫主要通过激发肠道免疫以分泌iga。而亚单位和灭活疫苗只能通过注射免疫，但注射免疫无法激发肠道分泌iga，因此不能针对因轮状病毒引起的腹泻提供保护。口服减毒活轮状病毒疫苗是目前唯一已上市的轮状病毒疫苗。3.高浓度、高质量的轮状病毒是生产以轮状病毒减毒及其衍生物为主要组分的减毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程载体疫苗及多价或联合疫苗的基础，因此适宜产业化的高效轮状减毒活疫苗制备工艺具有重大的经济价值和社会价值。然而，目前已有减毒轮状病毒疫苗工艺均无法达到以上要求。4.因此，亟需提供一种能够获得高滴度轮状病毒的培养方法。技术实现要素：5.为了解决上述技术问题，本公开提供了一种生产轮状病毒疫苗的方法。6.第一方面，本公开提供一种生产轮状病毒疫苗的方法，所述方法包括：7.将轮状病毒接种在细胞培养液中，所述细胞培养液中含有负载在微载体上的细胞；8.在维持胰酶的浓度在2～10mg/l，且ca2+的浓度在1mm以上的条件下，扩增轮状病毒，以收获含轮状病毒的上清液。9.在一些实施方案中，所述胰酶的浓度保持在2～8mg/l的范围内。10.在一些实施方案中，所述ca2+的浓度保持在1～2mm的范围内。11.在一些实施方案中，通过补加胰酶和/或ca2+的方式维持胰酶和/或ca2+的浓度。12.补加胰酶和ca2+是为了来维持培养液中胰酶和ca2+的浓度不低于其初始浓度，以提高轮状病毒滴度。13.补加ca2+时，以钙盐中ca2+的物质的量计。14.在一些实施方案中，以补加钙盐来维持ca2+浓度。钙盐选自磷酸钙、氯化钙、硫酸钙、硝酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙、琥珀酸钙和氨基酸螯合钙或其组合。15.在一些实施方案中，补加胰酶的方式为以不高于400μg/l/h的速度连续补加胰酶，或分批次补加胰酶。16.在一些实施方案中，补加ca2+的方式为以不高于0.6mm/天的速度连续补加ca2+。17.在一些实施方案中，轮状病毒的感染复数moi为0.001～0.1。18.在一些实施方案中，所述轮状病毒包括但不限于人轮状病毒、猿轮状病毒、牛轮状病毒、兔轮状病毒、猪轮状病毒、马轮状病毒、狗轮状病毒、山羊轮状病毒、鸟类轮状病毒和鼠科轮状病毒等。19.在一些实施方案中，轮状病毒包括但不限于人-牛重配轮状病毒、人-羊重配轮状病毒或人-猪重配轮状病毒。20.在一些实施方案中，轮状病毒选自g9型轮状病毒、g1型轮状病毒、g2型轮状病毒、g3型轮状病毒、g4型型轮状病毒和p1a[8]型型轮状病毒。[0021]在一些实施方案中，轮状病毒可以不经过激活而直接接种在所述培养液中。[0022]在一些实施方案中，在扩增轮状病毒的过程中，不外排培养液。[0023]在一些实施方案中，所述培养液的体积为2-1000l。例如在至少2l、至少5l、至少20l、至少50l、至少100l、至少200l、至少300l、至少500l、至少800l或至少1000l的培养液中扩增轮状病毒。[0024]在一些实施方案中，所述培养液的血清浓度≤0.05％，优选为所述培养液不含有血清。[0025]在一些实施方案中，所述培养液选自但不限于199培养基、mem培养基、dmem培养基和m199培养基。[0026]在一些实施方案中，所述培养液中还含有葡萄糖、谷氨酰胺、非必需氨基酸、生长因子中的一种或多种。[0027]在一些实施方案中，在扩增轮状病毒的过程中，还补加负载在微载体上的细胞、葡萄糖、谷氨酰胺、非必需氨基酸、生长因子或基础培养基中的至少一种。[0028]在一些实施方案中，所述生长因子包括表皮细胞生长因子和/或成纤维细胞生长因子。[0029]在一些实施方案中，所述方法还包括：所述细胞在含有微载体的培养基中培养，优选地，使细胞长满微载体。[0030]在一些实施方案中，所述细胞培养的条件为在35～38℃，ph7.0～7.4，溶氧35％～50％条件下培养。[0031]在一些实施方案中，所述细胞培养的条件还包括搅拌，优选为40～100rpm。[0032]在一些实施方案中，所述细胞的培养方式为换液培养。[0033]在一些实施方案中，所述换液培养为在所述细胞培养一段时间后，例如24小时后，使用血清含量不高于初始培养基中血清含量的培养基进行换液培养。[0034]在一些实施方案中，所述换液培养为排出一定工作体积，例如50％-75％工作体积的培养液上清后，补加等体积的新的培养基，即沉降换液培养。[0035]在一些实施方案中，所述换液培养为采用连续灌流的方式，排出原有的培养液上清，同时补加新的培养基，即灌流换液培养。[0036]在一些实施方案中，所述细胞在所述培养基的接种密度为0.2×106～1.0×106个细胞/ml。[0037]在一些实施方案中，所述微载体的用量为1～10g/l。[0038]在一些实施方案中，所述微载体选自基于葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素的多孔结构。[0039]在一些实施方案中，所述微载体选自cytodexcytpdex3d和cytopore[0040]在一些实施方案中，所述微载体选自cytodex和3d[0041]在一些实施方案中，所述细胞选自vero细胞、ma-104细胞、mrc5细胞、gbk细胞、293细胞、bhk细胞和cho细胞。[0042]在一些实施方案中，所述方法还包括对所述上清液进行均质和过滤，获得轮状病毒液。[0043]在一些实施方案中，所述均质的温度为-5～15℃，压力为50～500bar。[0044]在一些实施方案中，所述微滤使用的滤膜的孔径为0.2～1μm。[0045]在一些实施方案中，所述方法不包括：对所述上清液进行浓缩。[0046]在一些实施方案中，所述方法还包括：将所述轮状病毒液与保护剂混合。[0047]在一些实施方案中，所述保护剂包括20～60％的糖类，0.05～0.5mol/l的磷酸盐，和0.05～0.5mol/l的羧酸盐。[0048]在一些实施方案中，所述糖类选自蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、半乳糖、山梨糖醇和甘露糖或其组合。[0049]在一些实施方案中，所述羧酸盐选自柠檬酸盐和/或琥珀酸盐。[0050]在一些实施方案中，所述轮状病毒液与所述保护剂的比例1:1～1:10。[0051]第二方面，本公开提供由第一方面提供的方法制备的轮状病毒疫苗。[0052]本公开提供的生产轮状病毒疫苗的方法能够获得滴度在7.6以上的轮状病毒，满足六价重配后滴度在6.8以上具备免疫效果，因此不需要对收获液进行浓缩，避免了浓缩带来的轮状病毒滴度损失。[0053]本公开提供的方法制备的轮状病毒具有高滴度和高质量的优势。[0054]本公开提供的培养轮状病毒方法不需要进行细胞破碎即可收获高滴度轮状病毒。[0055]本公开提供的生产轮状病毒疫苗的方法不仅不需要对培养物上清进行浓缩，而且在培养物上清收获后的下游工艺段采用的均质和微滤工艺，能够减少对轮状病毒滴度的损耗，并且工艺简单，损耗低。轮状病毒电镜结果显示，轮状病毒完整性高。可见，本公开提供的生产轮状病毒疫苗的方法工艺简单，易于产业化。[0056]本公开提供的轮状病毒疫苗具有耐酸性能和稳定性，保持了轮状病毒抗原的免疫原性。附图说明[0057]图1显示了实施例1获得的轮状病毒培养液上清滴度的变化。[0058]图2显示了实施例1中各工艺段获得的料液中轮状病毒滴度和浊度的变化。[0059]图3显示了实施例1获得的轮状病毒的电子显微镜照片。[0060]图4显示了实施例2中各工艺段获得的料液中轮状病毒滴度的变化。[0061]图5显示了实施例5中匀浆前以及不同温度匀浆后的轮状病毒滴度的变化。[0062]图6显示了实施例6中不同配方的保护剂对轮状病毒的抗酸效果和稳定效果。图6中，a显示了不同配方的轮状免疫原性组合物的抗酸效果，b显示了不同配方的轮状免疫原性组合物的稳定效果。具体实施方式[0063]下面通过实施例对本公开作进一步说明，应该理解的是，本公开的实施例仅是用于说明本公开，而不是本公开的限制，在本公开的构思前提下对本公开的简单改进都属于本公开要求保护的范围。[0064]定义[0065]除非另外定义，否则在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。[0066]本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。[0067]本文所使用的术语“轮状病毒”(rotaviruse,rv)为双股rna(dsrna)病毒，属于呼肠孤病毒科(reoviridae)轮状病毒属(rotavirus)。轮状病毒是引起人类新生儿，以及猪、牛、羊等多种幼龄动物的急性胃肠道传染病的主要病原之一，临床表现以呕吐、腹泻、脱水为主要特征。[0068]轮状病毒为无囊膜，二十面体，直径约为70nm，电子显微镜观察，轮状病毒是带有短纤突且外缘光滑近似轮状的粒子。该病毒粒子由3层结构(外层衣壳、内层衣壳和核心)，中间包裹着11条双链核糖核酸片段，编码6个结构蛋白(vp1-vp4、vp6和vp7)和5个非结构蛋白(nsp1-nsp5)，vp1-vp3为髓芯蛋白。nsp4具有肠毒素作用，是引起腹泻的重要因素，vp4(p蛋白)和vp7(g蛋白)是特异抗原型别，可诱导中和抗体产生，发挥免疫保护作用。vp6具有群特异性抗原决定簇。根据抗原性的不同将rv分为a-g7个组(群)，a、b、g组(群)能引起人畜共患病，其他组(群)主要引起动物腹泻，少数感染人群。a组(群)是≤5岁儿童腹泻最常见的病原，可引起90％的rv腹泻。根据vp7抗原的不同可分为14种不同的g血清型和18种p血清型，人群中最常见的是g1、g2、g3、g4和g9血清型。在病毒的增殖过程中，11个基因片段可能会发生重配，甚至在动物和人的毒株之间也有重配发生，病毒重配是导致自然界中有大量不同病毒株的部分原因。感染人的轮状病毒大多属于a群，进一步可以将轮状病毒分为2个亚群为23个g(g1-g23)血清型(取决于vp7中和抗原)和31个p(p[1]-p[13])血清型(取决于vp4血凝素抗原)。g-p组合血清型由病毒的vp7和vp4共同决定，目前，g1p[8]、g2p[4]、g3p[8]、g4p[8]和g9p[8]5种血清型的轮状病毒是危害人类健康最为重要的毒株。[0069]本文所使用的术语“疫苗”旨在包括预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗是一种被给予以刺激对抗原的免疫应答的疫苗，所以如果随后将个体暴露于抗原，则预形成的免疫力将保护个体免受与所述抗原相关的相应疾病。治疗性疫苗被给予已患有抗原相关疾病的个体，其中所述疫苗可引起对抗原的免疫应答或加强对所述抗原的个体的现有免疫力，以治疗和/或改善疾病症状。[0070]本文所使用的术语“灭活疫苗”是先对病毒或细菌进行培养，然后用物理或化学的方法，将具有感染性的完整的病毒或细菌杀死，使其失去致病力而保留抗原性。灭活疫苗即可由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗。[0071]本文所使用的术语“轮状病毒载体疫苗”是指使用基因工程手段或重配方法获得的具有轮状病毒内壳或外壳骨架基因vp4、vp6和vp7基因及其基因编辑物的任意一条或一条以上的病毒或假病毒，以病毒或假病毒作为免疫原性物的免疫组合物。[0072]本文所使用的术语“氨基酸螯合钙”是指由多种氨基酸与无机钙盐通过化学合成反应而生产的一种有机钙类物质。[0073]本文所使用的术语“感染复数”(multiplicityofinfection，moi)用于测定噬菌体效价的宿主菌被称为指示菌，感染时噬菌体与指示菌细胞的数量比值称为感染复数，即每个细胞感染噬菌体的数目。[0074]本文所使用的术语“沉降换液”是指停止反应器搅拌，待细胞及细胞所生长载体沉降至反应器底部后，排出一定量的上清，补加培养液或其他溶液并重启搅拌。[0075]本文所使用的术语“灌流换液”是指不停止反应器搅拌，一边向反应器中流加培养液或其他溶液，一边排出罐内溶液。在本公开中，细胞及其所在微载体通过反应器内特殊装置(例如在排液口加入旋转滤网)截留而不流出或极少流出反应器的细胞换液。[0076]本文中所说的控制培养液中血清浓度，指在不计血清损耗的情况下，通过统计流入液中血清量和流出液中血清量，计算反应器中剩余血清量进而推算理论血清浓度。[0077]实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。[0078]实施例毒种：人牛重配轮状病毒毒种来源于nih(nationalinstitutesofhealth美国国立卫生院[0079]mvs-brv-1：人-牛轮状病毒g1血清型[0080]mvs-brv-4：人-牛轮状病毒g4血清型[0081]mvs-brv-10：人-牛轮状病毒g9血清型[0082]轮状病毒工作代毒种在nih肚中的基础上扩增传代培养而来。[0083]实施例1.g9型轮状病毒培养及病毒澄清液制备[0084]1)按照8×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有1g/lcytodex1微载体、以及含10％血清的199培养基的50l搅拌式生物反应器中，35℃，100rpm，ph7.0，溶氧50％培养。每24小时用含有2％血清的199培养基沉降换液75％工作体积，培养4天至细胞长满微载体。[0085]2)用无血清199培养基沉降换液5次。[0086]将g9型轮状病毒、胰酶和cacl2分别加入到反应器中。反应器内，根据细胞计数结果，g9型轮状病毒moi＝0.05，胰酶的终浓度为2mg/l，cacl2终浓度为2mmol/l，在ph7.0、60rpm、36℃条件下培养48小时。期间第18小时、30小时分别补加1mg/l胰酶。期间取样检测病毒培养液上清滴度。测得轮状病毒培养液上清的最高滴度约为8.9lgccid50/ml见图1。[0087]3)沉降收获轮状病毒培养物上清。轮状病毒培养物上清进行低温均质，冷水机温度设置为4℃，压力200bar，流速40l/h。均质机流出液流穿1μm滤器后，以0.2μm微滤膜过滤。由图2可知，下游工艺并未显著改变病毒滴度，但料液浊度显著下降。[0088]4)使用电子显微镜观察过滤后获得的轮状病毒，发现所获得的轮状病毒颗粒完整，具有明显的刺突结构并规律有序排列(图3)。[0089]实施例2.g1型轮状病毒反应器培养及病毒澄清液制备[0090]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将ma-104细胞接种至具有10g/lcytodex1微载体、以及含8％血清199培养基的10l提篮式搅拌式生物反应器(nbs公司产品)中，38℃，40rpm，ph7.4，溶氧35％培养。从接种细胞后的第2天起每天用含有2％血清的199培养基沉降换液75％工作体积，培养5天至细胞长满微载体。[0091]2)用含有1mmol/l钙盐的无血清199培养基沉降换液4次，此时理论血清残留量为0.0078％。[0092]3)根据细胞计数结果，将g1型轮状病毒、199培养基、胰酶和cacl2溶液混合后加入到反应器中。反应器内的病毒培养液中，根据细胞计数结果，g1型轮状病毒moi＝0.01，胰酶的终浓度2mg/l，cacl2终浓度为1mmol/l，在ph7.2、60rpm、37℃条件下培养60小时。期间使用蠕动泵按照约为200μg/l/h的流加速度连续补加无菌胰酶溶液。病毒培养液上清滴度约为8.2lgccid50/ml。[0093]4)沉降收获轮状病毒培养物上清。轮状病毒培养物上清流穿5μm微滤膜，进行低温均质，冷水机温度设置为2℃，压力500bar。均质机流出液采用0.45μm微滤膜过滤。在病毒培养液培养24h、48h和60h，均质后，以及0.45μm微滤膜过滤后的病毒滴度结果见图4。由图4所示的结果可知，下游工艺段中均质和滤膜过滤对病毒滴度几乎无影响，基本不会对病毒滴度造成损失。[0094]实施例3.g4型轮状病毒培养[0095]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有1g/l3dtabletrix微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积，换液4天。[0096]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0097]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒进行混合与37℃孵育1小时，将胰酶和轮状病毒的混合物加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.001，按照200μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为8mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为2mmol/l。在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养40小时。此时培养液上清轮状病毒滴度约为8.2lgccid50/ml。[0098]实施例4.g1型轮状病毒波浪式(wave)反应器培养[0099]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有10g/l3dtabletrix微载体、以及含5％血清mem培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。使用不含血清的mem培养基清洗长满vero细胞的cytodexi微载体。[0100]2)将长满vero细胞的微载体按照8g/l量导入培养袋中，加入胰酶终浓度为5mg/l、氯化钙终浓度为2mm的mem培养基，以moi＝0.01接种g1型轮状病毒，37℃，ph7.2通气培养轮状病毒48小时。检测轮状病毒培养液上清病毒滴度约为8.0lgccid50/ml。[0101]实施例5.g1型轮状病毒反应器培养及病毒澄清液制备[0102]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有10g/lcytodex1微载体、以及含8％血清199培养基的10l提篮式搅拌式生物反应器(nbs公司产品)中，38℃，40rpm，ph7.4，溶氧35％培养。从接种细胞后的第2天起每天用含有2％血清的199培养基沉降换液75％工作体积，培养5天至细胞长满微载体。[0103]2)用含有1mmol/l钙盐的无血清199培养基沉降换液4次，此时理论血清残留量为0.0078％。[0104]3)根据细胞计数结果，将g1型轮状病毒、胰酶和cacl2溶液混合后加入到反应器中。反应器内的病毒培养液中，根据细胞计数结果，g1型轮状病毒moi＝0.01，胰酶的终浓度1.5mg/l，cacl2终浓度为1mmol/l，在ph7.2、60rpm、37℃条件下培养60小时。期间使用蠕动泵按照约为200μg/l/h的流加速度连续补加无菌胰酶溶液。病毒培养液上清滴度约为6.2lgccid50/ml。[0105]实施例6.g1型轮状病毒反应器培养及病毒澄清液制备[0106]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有10g/lcytodex1微载体、以及含8％血清199培养基的10l提篮式搅拌式生物反应器(nbs公司产品)中，38℃，40rpm，ph7.4，溶氧35％培养。从接种细胞后的第2天起每天用含有2％血清的199培养基沉降换液75％工作体积，培养5天至细胞长满微载体。[0107]2)用含有1mmol/l钙盐的无血清199培养基沉降换液4次，此时理论血清残留量为0.0078％。[0108]3)根据细胞计数结果，将g1型轮状病毒、胰酶和cacl2溶液混合后加入到反应器中。反应器内的病毒培养液中，根据细胞计数结果，g1型轮状病毒moi＝0.01，胰酶的终浓度2mg/l，cacl2终浓度为0.5mmol/l，在ph7.2、60rpm、37℃条件下培养60小时。期间使用蠕动泵按照约为200μg/l/h的流加速度连续补加无菌胰酶溶液。病毒培养液上清滴度约为7.2lgccid50/ml。[0109]实施例7.g4型轮状病毒培养[0110]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有1g/l3dtabletrix微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积，换液4天。[0111]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0112]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒分别加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.01，按照400μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为8mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为2mmol/l。在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养40小时。此时培养液上清轮状病毒滴度约为8.2lgccid50/ml。[0113]实施例8.g4型轮状病毒培养[0114]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有1g/lsolohill微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积，换液4天。[0115]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0116]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒分别加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.01，按照400μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为8mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为2mmol/l。在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养40小时。此时培养液上清轮状病毒滴度约为8.0lgccid50/ml。[0117]实施例9.g4型轮状病毒培养[0118]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将vero细胞接种至具有10g/lsolohill微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积。[0119]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0120]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒分别加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.001，按照400μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为8mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为2mmol/l。在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养40小时。此时培养液上清轮状病毒滴度约为8.1lgccid50/ml。[0121]实施例10.g4型轮状病毒培养[0122]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将ma-104细胞接种至具有10g/lsolohill微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积。[0123]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0124]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒分别加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.001，按照200μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为12mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为2mmol/l。在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养，当培养到20h的时候，细胞完全脱落病毒滴度为5.2lgccid50/ml。[0125]实施例11.g4型轮状病毒培养[0126]1)按照4×105细胞/ml的接种密度将ma-104细胞接种至具有10g/lsolohill微载体、以及含5％血清199培养基的5l搅拌式生物反应器中，37℃，80rpm，ph7.2，溶氧50％培养。接种后第2天起，每天采用无血清的199培养基换液50％工作体积。[0127]2)第5天换液使用无血清199培养基沉降换液3次后，此时理论血清残留量为0.0024％。[0128]3)将10mg/l的胰酶和g4型轮状病毒分别加入反应器中，使得反应器内轮状病毒moi为0.001，按照200μg/l/h的速度连续补加胰酶，使得轮状病毒培养液中胰酶的终浓度为4mg/l，按照0.6mm/天加入cacl2。保持无血清199培养基中的cacl2的终浓度为0.1mol/l。加入cacl2培养液浑浊，在ph7.2、100rpm、37℃条件下培养，当培养到12h的时候，细胞完全脱落并结块病毒滴度为4.8lgccid50/ml。[0129]实施例12.均质温度对病毒滴度的影响[0130]将实施例1轮状病毒培养液上清按照2l/份分装。调整均质仪冷却液温度分别为25℃、15℃、5℃和-5℃，待温度稳定后，随机取一份分装好的轮状病毒液进行均质温度的试验，试验过程中统一匀浆参数为400bar，料液进行3次均质，检测最后一次匀出物的病毒滴度(图5)。结果显示，当在低温条件下进行均质时，病毒更稳定。在试验条件-5～15℃时轮状病毒滴度下降不明显，对轮状病毒的损失更小。[0131]实施例13.不同稳定剂对轮状病毒稳定性的影响[0132]按照如下配方配制疫苗保护剂：[0133]配方a:60％蔗糖、0.2mol/l磷酸钾盐、0.4mol/l琥珀酸钠，ph6.4；[0134]配方b:50％蔗糖、0.4mol/l磷酸钾盐、0.2mol/l琥珀酸钠，ph6.4；[0135]配方c：80％蔗糖、0.2mol/l磷酸钾盐、0.4mol/l柠檬酸钠，ph6.4；[0136]配方d：70％蔗糖、0.2mol/l磷酸钾盐、0.2mol/l柠檬酸钠，0.2mol/l琥珀酸钠，ph6.4。[0137]将配方a-d的保护剂分别与实施例2制备的轮状病毒液按照1:1混合，制备成轮状病毒免疫原性组合物，将2ml轮状病毒免疫原性组合物置于50ml盐酸中，不同时间取样测定轮状病毒滴度，以评价保护剂的抗酸效果(图6a)。将以上轮状病毒免疫原性混合物在37℃培养箱中放置7天，检测其轮状病毒滴度变化(图6b)。图6的结果表明，与无菌水的对照组相比，四组配方a-d均可提高轮状病毒的耐酸性和热稳定性。[0138]以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。[0139]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。[0140]此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：将轮状病毒接种在细胞培养液中，所述细胞培养液中含有负载在微载体上的细胞；在维持胰酶的浓度在2～10mg/l，且ca
2+
的浓度在1mm以上的条件下，扩增轮状病毒，以收获含轮状病毒的上清液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰酶的浓度保持在2～8mg/l的范围内；优选地，所述ca
2+
的浓度保持在1～2mm的范围内。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过补加胰酶和/或ca
2+
的方式维持胰酶和/或ca
2+
的浓度。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液的血清浓度≤0.05％，更优选地，所述细胞培养液不含有血清；优选地，所述细胞培养液选自199培养基、mem培养基、dmem培养基和m199培养基。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，轮状病毒的感染复数moi为0.001～0.1；优选地，轮状病毒选自g9型轮状病毒、g1型轮状病毒、g2型轮状病毒、g3型轮状病毒、g4型轮状病毒和p1a[8]型轮状病毒。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的用量为1～10g/l；优选地，所述微载体选自基于葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素的多孔结构；优选地，所述微载体选自cytodex cytpdex 3d和cytopore 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞选自vero细胞、ma-104细胞、mrc5细胞、gbk细胞、293细胞、bhk细胞和cho细胞。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述上清液进行均质和过滤，获得轮状病毒液；优选地，所述均质的温度为-5～15℃，压力为50～500bar；优选地，所述微滤使用的滤膜的孔径为0.2～1μm；优选地，所述方法不包括对所述上清液进行浓缩。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述轮状病毒液与保护剂混合；优选地，所述保护剂包括20～60％的糖类，0.05～0.5mol/l的磷酸盐，和0.05～0.5mol/l的羧酸盐；更优选地，所述糖类选自蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、半乳糖、山梨糖醇和甘露糖或其组合；更优选地，所述羧酸盐选自柠檬酸盐和/或琥珀酸盐；更优选地，所述轮状病毒液与所述保护剂的比例1:1～1:10。10.由权利要求1～9任一项所述的方法制备的轮状病毒疫苗。

技术总结
本公开涉及一种轮状病毒疫苗和生产轮状病毒疫苗的方法。生产轮状病毒疫苗的方法包括将轮状病毒接种在细胞培养液中，所述细胞培养液中含有负载在微载体上的细胞；在维持胰酶的浓度在2～10mg/L，且Ca


技术研发人员：宋俐霏 孟凡红 姚志东 栾春芳 樊艳明 沙雪艳 陈飞 陈娜
受保护的技术使用者：北京科兴中维生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/10/8