山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因及其引物与应用

1.本发明属于山药分子生物学技术领域，具体涉及一种山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因及其引物与应用。


背景技术：

2.qrt-pcr是分子生物学中研究基因表达最常规有效的手段之一，通过在pc r反应体系中添加特定的荧光基团，即可对整个pcr反应过程中产物变化进行实时监测，达到对目标基因的定性定量表达分析。它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、简单高效等优点，但会受到rna的质量、模板cdna的质量、引物的特异性和pcr扩增率等因素的影响，qrt-pcr过程中需要选用合适的内参基因进行校正和标准化。构成细胞骨架或者参与细胞基本代谢活动的基因常被用作内参基因，这些基因在表达上相对稳定。目前，常用的内参基因有很多，包括肌动蛋白(actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrog enase,gadph)和微管蛋白(tubulinbeta,tub)等的编码基因。
3.山药珠芽俗称零余子，是着生于茎蔓上的一种变态茎，是农业生产中重要的繁殖材料，也是农产品。山药珠芽的生长状况直接影响山药种植业的持续发展和种植者的经济收入。但是关于山药内参基因的报道甚少，山药珠芽生长期内参基因的报道未见。山药花青素相关基因daf3h和黄酮醇合成酶dafls1基因的表达研究使用了actin2、actin1作为内参基因，但这些文献尚未分析内参基因的稳定性。专利(专利号为zl202011469612.7)公开了山药f-box基因在山药不同组织荧光定量表达中的应用，另一个专利(专利号为202011469619.9)公开了山药cki-2基因在山药不同生长期叶片荧光定量表达中的应用，但是这两个专利并未涉及到山药f-box基因和cki-2基因在珠芽等其他组织生长期的稳定性。为了今后研究重要基因在山药不同生长期珠芽中的表达情况，需要找到稳定的内参基因。因此如何克服现有技术的不足是目前山药分子生物学技术领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因及其引物与应用。本发明筛选出在山药不同生长期珠芽表达较为稳定的内参基因，为今后开展山药珠芽生长发育和代谢的基因功能验证等研究工作提供参考依据。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因，所述内参基因f-box-2的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.进一步，优选的是，所述内参基因f-box-2的pcr扩增引物核苷酸序列：上游引物如seq id no.2所示；下游引物如seq id no.3所示。
8.本发明同时提供上述山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.s1、从候选内参基因中，选择e值接近零或者为零的11个基因序列；
10.s2、对步骤s1筛选的11个基因进行引物设计，并利用引物进行pcr扩增，验证引物的特异性；
11.s3、提取不同生长时期的珠芽的总rna，反转录合成第一链cdna，采用s2设计的引物进行实时荧光定量pcr分析，计算ct值，对步骤s1筛选的11个基因的表达稳定性进行分析；
12.s4、综合确定最稳定表达的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因。
13.进一步，优选的是，步骤s1中，11个基因为f-box-2、18ssrna、60sr na，bhlh、yls8、cki-2、26srna、act、elf、ubq、f-box。
14.进一步，优选的是，在步骤s2中，pcr反应体系为20μl：包括17.0μlgreenmix，1.0μlcdna，1.0μl10μmol/l上游引物，1.0μl10μmol/l下游引物；
15.反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃预延伸10s，循环30次。
16.进一步，优选的是，在步骤s3中，实时荧光定量pcr反应体系为20μl：包括10.0μlqpcrmastermixsybrgreenⅰ，1.0μlcdna，0.8μl10μmol/l上游引物，0.8μl10μmol/l下游引物，rox0.4μl，ddh2o7.0μl；
17.两步法反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。
18.进一步，优选的是，在步骤s4中，利用deltact、genorm、normfinder、bestkeeper、comparative
△
ct方法对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。
19.本发明还提供上述山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因在山药基因表达分析中的应用。
20.本发明另外提供上述山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因在山药种质资源改良中的应用。
21.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
22.第一，本发明增加了新的候选基因进行内参基因的筛选，并且找到了新的更稳定的基因。本发明选取筒状f-box蛋白2(tubby-like-f-boxprotein2，f-box-2)，18s核糖体rna(ribososome，18srna)，60s核糖体rna(ribosos ome，60srna)，转录因子(basichelix-loop-helix，bhlh)，ysl蛋白有丝分裂基因(mitosisproteinyls8，yls8)，蛋白激酶i(caseinkinasei，cki-2)，26s核糖体rna(ribososome，26srna)，肌动蛋白(actin，act)，真核起始因子(actineukaryoticinitiationfactor，elf)，多聚泛素酶基因(ubiquitin-pr oteinligase，ubq)，筒状f-box蛋白(tubby-like-f-boxprotein，f-box)这些基因作为山药不同生长期珠芽的候选基因，本研究发现f-box-2基因比已经公布的cki-2基因(该基因为不同生长期叶片的内参基因，专利号为zl202011469619.9)和f-box基因(该基因为不同组织的内参基因，专利号为zl202011469612.7)更稳定。f-box-2基因和f-box基因同源性低(同源性低于35％)，是不同的两个基因。
23.第二，本发明采用了新的植物材料(山药不同生长的珠芽)的内参基因。山药珠芽是山药种植中的繁殖材料和经济产品。本发明筛选到的山药不同生长期珠芽内参基因f-box-2，还提供了应用技术，为以后研究山药珠芽生长发育相关基因奠定了基础，这个基础是现有技术不可替代的。
24.第三，本发明使用了低roxqrt-pcr两步法结合多种内参基因筛选软件(genorm、normfinder及deltact)分别评估基因稳定性，最后经过refind er网站对前几个软件评估的稳定性综合评估，筛选出在山药不同生长期珠芽里表达极稳定的内参基因，能较大程度减小基因表达量评估的误差。
25.总之，本发明为后期开展山药珠芽生长发育和代谢代谢的基因功能验证等研究工作提供参考依据。
附图说明
26.图1为提取的rna电泳条带；图中5s代表5s核糖体rna，18s代表18s核糖体rna，28s代表28s核糖体rna；从图中可以看出，提取的rna电泳条带完整清晰，表明rna无降解，纯度浓度高；
27.图2为11个候选基因pcr扩增凝胶电泳图；图中m代表dnamaker，用以对比11个候选基因pcr扩增条带的分子量大小；
28.图3为f-box-2基因在山药不同生长期珠芽的plot峰；图中1是山药时期1珠芽顶部与基部的表皮，2是山药时期2珠芽顶部与基部的表皮，3是山药时期3珠芽顶部与基部的表皮，4是山药时期4珠芽顶部与基部的表皮，5是山药时期5珠芽顶部与基部的表皮；
29.图4为山药生长素运输载体基因在不同生长期珠芽的顶部和基部里的相对表达量；图中，(a)为山药不同生长期珠芽基部生长素运输载体基因表达量；(b)为山药不同生长期珠芽顶部生长素运输载体基因表达量。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
31.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
32.1实施材料
33.珠芽生长期内参基因筛选的材料为
‘
牛尾’山药5个生长期珠芽的顶部和基部表皮组织。第一个时期珠芽整体是半绿半白，基部为绿色，顶部为白色，直径[1.0mm，3.0mm)；第二个时期珠芽是半浅褐色半绿色，基部浅褐色，顶部浅绿偏白，直径[3.0mm，5.0mm)；第三个时期珠芽大部分为浅褐色，顶部白色偏绿，直径[5.0mm，7.0mm)；第四个时期珠芽为半褐色半绿色，基部深褐色，顶部绿色，直径[7.0mm，10.0mm)；第五个时期珠芽表皮基本为褐色，只有顶部一点呈现出褐绿色，直径大于等于10mm。各时期材料重复3次取样，称重后分装液氮速冻，保存至-80℃冰箱备用。
[0034]
2内参基因引物设计
[0035]
基于山药转录组cds数据，选择11个基因作为候选内参基因，包括筒状f-box蛋白2(tubby-like-f-boxprotein2，f-box-2)，18s核糖体rna(riboso some，18srna)，60s核糖体rna(ribososome，60srna)，转录因子(basichelix-loop-helix，bhlh)，ysl蛋白有丝分裂基因(mitosisproteinyls8，yl s8)，蛋白激酶i(caseinkinasei，cki-2)，26s核糖体rna
(ribososome，26srna)，肌动蛋白(actin，act)，真核起始因子(actineukaryoticinitiation factor，elf)，多聚泛素酶基因(ubiquitin-proteinligase，ubq)，筒状f-box蛋白(tubby-like-f-boxprotein，f-box)，获取的转录组序列通过ncbi中bla st-n进行核对，选择e值接近零或者为零的序列用于引物设计。按照qrt-pcr引物设计原则，primerblast在线设计引物序列(表1)，并委托昆明擎科生物技术有限公司合成相应引物。其中，f-box-2、18srna、60srna、bhlh、yls8、f-box、cki-2、26srna、act、elf、ubq的基因登录号分别为xm039261408.1、xm039289986、xm039287735.1、xm039289449.1、xm039269803.1、xm039258576.1、xm039261074、xm039273436.1、xm039277184.1、xm039279159.1、xm039258263.1。
[0036]
表1山药候选内参基因qrt-pcr引物序列
[0037][0038]
3总rna的提取与cdna第1链的合成
[0039]
参照eastep
tm
super总rna提取试剂盒(上海产)使用说明书提取山药不同生长期珠芽的总rna。通过质量浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性和纯度，使用denovixds-11仪检测rna浓度。cdna第1链的合成参照tsingke公司逆转录试剂盒goldenstar
tm
rt6cdnasynthesiskit说明书进行，获得cdna保存于-20℃冰箱。
[0040]
4引物特异性pcr验证
[0041]
以山药珠芽cdna为模板，pcr反应体系为20μl：包括17.0μlgreenmi x，1.0μlcdna，1.0μl上游引物(10μmol/l)，1.0μl下游引物(10μmol/l)。反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃预延伸10s，循环30次。
[0042]
5实时荧光定量pcr扩增
[0043]
试验利用abiquantstudio实时荧光定量pcr系统进行。qrt-pcr反应体系为20μl：
包括10.0μlqpcrmastermix(sybrgreenⅰ)，1.0μlcdna，0.8μl上游引物(10μmol/l)，0.8μl下游引物(10μmol/l)，rox0.4μl，ddh2o7.0μl。采用两步法反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃预延伸10s，循环40次。
[0044]
6数据处理
[0045]
通过excel2016软件对山药不同生长期珠芽的rt-qpcr数据整理和汇总；利用内参基因稳定性分析网址(http://www.ciidirsinaloa.com.mx/reffinder-master/)，其中包括deltact、genorm、normfinder和comparative
△
ct方法4个评估方法，评估不同内参基因的表达稳定性，具体分析步骤和参数设置参照吴建阳等(吴建阳等.利用genorm，normfinder和bestkeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法[j].现代农业科技,2017(5):4.)数据处理分析方法。
[0046]
7结果
[0047]
7.1rna纯度及浓度分析
[0048]
提取山药珠芽总rna，样品总rna的浓度为410.635
±
65.23ng/μl，凝胶电泳显示具有28srna、18srna及5srna三条完带(见图1)，测a
260
/a
230
＝1.987～2.264，a
260
/a
280
＝1.900～2.188，均符合要求，说明样本rna完整性好、浓度高，可用于后续实施。
[0049]
7.2内参基因pcr特异性分析
[0050]
以不同生长期珠芽的cdna为模板，11个候选基因引物经pcr后获得清晰且单一的条带(见图2)，说明引物特异性好可用于qrt-pcr实施。山药不同生长期珠芽的内参基因引物上机检验仅有单一信号峰，无杂峰和非特异性扩增现象，表明引物用于qrt-pcr准确性高。
[0051]
7.3内参基因的表达丰度分析
[0052]
基于已验证过的引物进行qrt-pcr扩增，通过分析候选内参基因的ct值来评估基因在山药不同生长期珠芽的表达丰度。山药不同生长期珠芽的候选内参基因的ct值在22.41～33.62间，ct的最大值和最小值的差值从低到高排序：elf＜f-box-2＜yls8＜60s＜26s＜act＜ubq＜cki-2《18srna《bhlh《f-box，说明f-box-2和elf的表达丰度高。由于ct值与表达丰度呈负相关，即ct差值越小则表达丰度越大。
[0053]
7.4内参基因表达的稳定性分析
[0054]
基于reffind在线评估基因的稳定性，各软件的稳定值与排序结果如表2。山药不同生长期珠芽内参基因f-box-2的稳定性在deltact、genorm、normf inder和bestkeeper4个评估值中均排第一，最终comparative
△
ct方法排第一，表明在山药不同生长期珠芽内参基因f-box-2是最稳定的基因。
[0055]
表2各软件对山药珠芽不同生长期内参基因ct值的评估结果
[0056][0057]
7.5内参基因表达的稳定性验证
[0058]
进行山药不同生长期珠芽组织里的f-box-2基因实时荧光定量pcr反应，通过峰高验证内参基因的稳定性。f-box-2的溶解曲线温度为81℃-83℃，plot峰在不同生长期表达高度差异较小(如图3)，说明f-box-2基因的稳定性可靠。
[0059]
7.6内参基因的应用
[0060]
以f-box-2基因为荧光定量的内参基因，对云南农业大学同源克隆所获得的山药7条山药生长素运输载体基因进行实时荧光定量pcr分析。这7条基因名称分别为doaux1、doaux2、doaux3、dopin1、dopin3、dopin6及dopin7，gene bank登录号依次为oq706632、oq722352、oq722353、oq740044、oq740045、oq740046、oq740047。进行qrt-pcr反应的体系为20μl：包括10.0μl qpcr master mix(sybr green)，1.0μl cdna，0.8μl上游引物(10μmol/l)，0.8μl下游引物(10μmol/l)，rox 0.4μl，ddh2o 7.0μl。两步法反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃预延伸10s，循环40次。
[0061]
测定基因ct值，然后使用下列公式计算样品目的基因的相对表达量：
[0062]
△
ct(试验样品)＝ct(试验样品，目的基因)－ct(试验样品内参基因的均值)；
[0063]
△
ct(对照样品)＝ct(对照样品，目的基因)－ct(对照样品内参基因的均值)；
[0064]
△△
ct＝
△
ct(试验样品)－
△
ct(对照样品均值)；
[0065][0066]
使用上述公式计算出各基因在不同生长期珠芽顶部与基部的相对表达量。
[0067]
结果发现这7条基因的相对表达量有显著变化趋势(如图4)，符合山药珠芽生长趋势。说明本实例的结果可靠，所筛选获得的f-box-2内参基因适用于山药珠芽不同生长期功能基因的实时荧光定量分析。
[0068]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
[0069]
序列表
[0070]
seq id no.1
[0071][0072][0073]
seq id no.2
[0074]
gaaacgagtc ttcaacttgc at 22
[0075]
seq id no.3
[0076]
gccatctgcc ttaccagctt 20

技术特征：
1.山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因，其特征在于，所述内参基因f-box-2的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因，其特征在于，所述内参基因f-box-2的pcr扩增引物核苷酸序列：上游引物如seq id no.2所示；下游引物如seq id no.3所示。3.权利要求1所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、从候选内参基因中，选择e值接近零或者为零的11个基因序列；s2、对步骤s1筛选的11个基因进行引物设计，并利用引物进行pcr扩增，验证引物的特异性；s3、提取不同生长时期的珠芽的总rna，反转录合成第一链cdna，采用s2设计的引物进行实时荧光定量pcr分析，计算ct值，对步骤s1筛选的11个基因的表达稳定性进行分析；s4、综合确定最稳定表达的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因。4.根据权利要求3所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，步骤s1中，11个基因为f-box-2、18ssrna、60srna、bhlh、yls8、cki-2、26srna、act、elf、ubq、f-box。5.根据权利要求3所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤s2中，pcr反应体系为20μl：包括17.0μl green mix，1.0μl cdna，1.0μl 10μmol/l上游引物，1.0μl 10μmol/l下游引物；反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃预延伸10s，循环30次。6.根据权利要求3所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤s3中，实时荧光定量pcr反应体系为20μl：包括10.0μl qpcr master mix sybr green
ꢀⅰ
，1.0μl cdna，0.8μl 10 μmol/l上游引物，0.8μl 10 μmol/l下游引物，rox 0.4μl，ddh2o 7.0μl；反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。7.根据权利要求3所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤s4中，利用delta ct、genorm、normfinder、bestkeeper、comparative
ꢀ△
ct方法对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。8.权利要求1所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因在山药基因表达分析中的应用。9.权利要求1所述的山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因在山药种质资源改良中的应用。

技术总结
本发明涉及一种山药不同生长期珠芽荧光定量的内参基因及其引物与应用，属于山药分子生物学技术领域。所述内参基因F-BOX-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述内参基因F-BOX-2的PCR扩增引物核苷酸序列：上游引物如SEQ ID NO.2所示；下游引物如SEQ ID NO.3所示。本发明筛选出在山药不同生长期珠芽里表达极稳定的内参基因，能最大程度减小基因表达量评估的误差，筛选出的内参基因的可靠性高，为以后研究山药珠芽生长发育相关基因奠定了基础。础。础。


技术研发人员：龙雯虹 孙一丁 尹冬 徐升胜 段延碧 陈佩 耿辉 施令祥 郭凤根 王仕玉
受保护的技术使用者：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 富源谷子地农业综合开发有限公司
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/10/8