一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法与流程

1.本发明属于农药残留检测技术领域，涉及一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法。


背景技术：

2.环吡氟草酮，分子式：c
20h19
clf3n3o3，cas号：1855929-45-1，属于对羟苯基丙酮酸双氧化酶(hppd)抑制剂类除草剂，通过抑制hppd的活性，使对羟基苯基丙酮酸转化为尿黑酸的过程受阻，从而导致生育酚及质体醌无法正常合成，影响靶标体内类胡萝卜素合成，导致叶片发白，最终使靶标植物死亡。环吡氟草酮可有效防除看麦娘、日本看麦娘、硬草、蜡烛草、棒头草、早熟禾等一年生禾本科杂草和繁缕、牛繁缕、野油菜、荠菜、碎米荠等一年生阔叶杂草。
[0003][0004]
环吡氟草酮于2018年8月在中国获得了农药登记，其产品于2018年底上市。gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了小麦中环吡氟草酮的残留限量为0.01mg/kg。但目前尚无适宜的方法对小麦中环吡氟草酮的残留量进行检测，因此，建立一种灵敏、准确的小麦中环吡氟草酮残留量的检测方法非常必要。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，以解决现有技术中环吡氟草酮残留量检测方法空白的问题。
[0006]
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007]
一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)制样：取待测小麦样品，粉碎后使其全部可通过425μm的标准网筛，放入聚乙烯瓶中，-18℃保存。
[0009]
(2)提取：取待测小麦样品，加水混匀，静置30min；加入乙腈(含1％甲酸，体积比)，振荡30min；加入质量比为4:1的无水硫酸镁和氯化钠剧烈振荡1min，离心，取上层乙腈相，氮吹至近干；加入40％甲醇溶液(体积比)，涡旋溶解残留物，待净化；所述水的加入比例为每1g小麦样品加入2ml的水；所述乙腈(含1％甲酸，体积比)的加入比例为每1g小麦样品加入2ml的乙腈(含1％甲酸，体积比)；所述待测小麦样品与所述加入无水硫酸镁和氯化钠的质量比为1:1；所述进行氮吹所取的乙腈相为4ml；所述40％甲醇溶液(体积比)的加入量为4ml。
[0010]
(3)净化：用甲醇和水活化平衡亲水亲脂聚合物固相萃取柱；将步骤(2)中待净化的样品溶液加入固相萃取柱中，弃去流出液；用40％甲醇溶液(体积比)淋洗固相萃取柱，弃
去淋洗液；加入甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干；加入甲醇，涡旋溶解残留物，过滤，得到待测样品液；所述用于活化平衡固相萃取柱的甲醇和水均为5ml；所述用于淋洗固相萃取柱的40％甲醇溶液(体积比)为5ml；所述用于洗脱的甲醇为5ml；所述用于溶解残留物的甲醇为2ml。
[0011]
(4)测定
[0012]
①
定性分析：采用液相色谱-串联质谱仪检测样品和基质匹配标准工作溶液，记录样品和基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的样品与基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮的相对离子丰度。当样品中检出与基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮色谱峰保留时间一致的色谱峰(变化范围在
±
2.5％之内)，并且相对离子丰度允许偏差不超过表1规定的范围，可以确定样品中检出环吡氟草酮。
[0013]
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0014]
相对丰度(％)》50％20％～50％10％～20％≤10％最大允许偏差(％)
±
20
±
25
±
30
±
50
[0015]
所述液相色谱-串联质谱检测条件为：
[0016]
(ⅰ)色谱条件
[0017]
a)色谱柱：acquity uplc beh c18(2.1mm
×
50mm，1.7μm)；
[0018]
b)流动相：a：水(含1％甲酸，体积比)，b：乙腈(含1％甲酸，体积比)，梯度洗脱；
[0019]
c)流速：0.3ml/min；
[0020]
d)柱温：40℃；
[0021]
e)进样量：1μl；
[0022]
梯度洗脱程序见表2。
[0023]
表2梯度洗脱程序
[0024]
时间/min流动相a/％流动相b/％09550.59553.5356555955.19557955
[0025]
(ⅱ)质谱条件
[0026]
a)离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0027]
b)检测方式：多反应监测(mrm)；
[0028]
c)扫描方式：正离子模式；
[0029]
d)离子化电压：4500v；
[0030]
e)离子源温度：350℃；
[0031]
f)气帘气压力：35psi；
[0032]
g)喷雾气压力：55psi；
[0033]
h)辅助气压力：60psi
[0034]
i)其他质谱参数见表3。
[0035]
表3环吡氟草酮定性、定量离子和质谱分析参数
[0036][0037]
*
定量离子对。
[0038]
所述基质匹配标准工作溶液配置步骤为：
[0039]
(ⅰ)标准中间溶液：准确移取1000mg/l的环吡氟草酮标准品50μl于50ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/l的标准中间溶液(1)；准确移取1000μl标准中间溶液(1)于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100μg/l的标准中间溶液(2)。
[0040]
(ⅱ)基质匹配标准工作溶液：分别准确移取0μl、20μl、50μl标准中间溶液(2)和15μl、50μl、70μl、100μl标准中间溶液(1)，用空白样品溶液稀释至1ml，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，环吡氟草酮浓度依次为0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、100ng/ml。
[0041]
空白样品溶液是指不含环吡氟草酮的样品经步骤(2)(3)处理后得到的样品溶液。
[0042]
②
定量测定：
[0043]
将基质匹配标准工作溶液分别用液相色谱-串联质谱仪进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以基质匹配标准工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
[0044]
样品溶液中环吡氟草酮的含量，用标准曲线外标法确定。样品中环吡氟草酮的含量按公式(1)进行计算。
[0045][0046]
式中：x表示样品中环吡氟草酮的含量，mg/kg；c表示从标准曲线中读出的样品溶液中环吡氟草酮的浓度，ng/ml；v1表示提取液体积，ml；v2表示进行氮吹所取的提取液体积，ml；v3表示定容体积，ml；m表示样品质量，g。
[0047]
本发明的有益效果为：
[0048]
本发明所述检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，采用固相萃取前处理技术，结合液相色谱-串联质谱检测技术，可对小麦中的环吡氟草酮残留量进行检测，环吡氟草酮的平均回收率为82.3％～85.3％，相对标准偏差(rsd)为1.4％～4.5％，检出限为0.002mg/kg。本方法具有灵敏、准确的优点。
[0049]
本发明所述检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法能满足gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定的小麦中环吡氟草酮残留限量的检测要求，可以为加强农残监管、保障食品安全提供有力的技术支撑。
附图说明
[0050]
图1为不含环吡氟草酮的小麦空白样品mrm色谱图；其中，(a)为环吡氟草酮定量离子，(b)为环吡氟草酮定性离子；
[0051]
图2为环吡氟草酮为2ng/ml的小麦基质标液的mrm色谱图；其中，(a)为环吡氟草酮定量离子，(b)为环吡氟草酮定性离子；
[0052]
图3为环吡氟草酮小麦基质标准曲线示意图。
具体实施方式
[0053]
本发明下述实施例中使用的仪器与试剂包括：
[0054]
ab sciex qtrap 6500液相色谱-质谱联用仪(美国ab sciex公司)；
[0055]
hs 501数显型摇床(德国ika集团)；
[0056]
cr22gⅱ型高速离心机(日本hitachi公司)；
[0057]
xw-80a漩涡混合器(上海精科实业有限公司)；
[0058]
pro超纯水系统(德国sartorus公司)；
[0059]
乙腈(色谱纯，美国thermo fisher scientific公司)；
[0060]
甲醇(色谱纯，北京百灵威科技有限公司)；
[0061]
甲酸(色谱纯，美国mreda technology公司)；
[0062]
氯化钠、无水硫酸镁(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；
[0063]
hlb固相萃取柱(200mg，6cc，美国waters公司)；
[0064]
环吡氟草酮标准物质(1000μg/ml，北京曼哈格生物科技有限公司)
[0065]
实施例：小麦中环吡氟草酮残留量的测定
[0066]
(1)制样
[0067]
取待测小麦样品，粉碎后使其全部可通过425μm的标准网筛，放入聚乙烯瓶中，-18℃保存。
[0068]
(2)提取
[0069]
称取待测小麦样品5g(精确至0.01g)，置于50ml具塞离心管中，加入10ml水混匀，静置30min；加入10ml乙腈(含1％甲酸，体积比)，300r/min振荡30min；加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，剧烈振荡1min，10000r/min离心3min；取4ml上层乙腈相，氮吹至近干；加入4ml 40％甲醇溶液(体积比)，涡旋溶解残留物，待净化。
[0070]
(3)净化
[0071]
用5ml甲醇和5ml水活化平衡hlb固相萃取柱；将步骤(2)中待净化的样品溶液加入固相萃取柱中，弃去流出液；用5ml 40％甲醇溶液(体积比)淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液；加入5ml甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干；加入2ml甲醇，涡旋溶解残留物，过0.22μm有机相滤膜，得到待测样品液；
[0072]
(4)标准中间溶液和基质匹配标准工作溶液的配制
[0073]
①
标准中间溶液：准确移取1000mg/l的环吡氟草酮标准品50μl于50ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/l的标准中间溶液(1)；准确移取1000μl标准中间溶液(1)于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100μg/l的标准中间溶液(2)。
[0074]
②
空白样品溶液：取不含环吡氟草酮的小麦样品，按照步骤(2)(3)处理后，得到空白样品溶液。小麦空白样品mrm色谱图见图1。
[0075]
③
基质匹配标准工作溶液：分别准确移取0μl、20μl、50μl标准中间溶液(2)和15μl、50μl、70μl、100μl标准中间溶液(1)，用空白样品溶液稀释至1ml，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，环吡氟草酮浓度依次为0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、100ng/ml。环吡氟草酮为2ng/ml的小麦基质标液的mrm色谱图见图2。
[0076]
(5)液相色谱-质谱/质谱法(hplc-ms/ms)测定
[0077]
将系列基质匹配标准工作溶液、小麦基质空白溶液和样品溶液分别注入hplc-ms/ms进行测定，建立基质匹配校正曲线，外标法定量。
[0078]
①
色谱条件为：
[0079]
色谱柱：acquity uplc beh c18(2.1mm
×
50mm，1.7μm)；
[0080]
流动相：a：水(含1％甲酸，体积比)，b：乙腈(含1％甲酸，体积比)，梯度洗脱；
[0081]
流速：0.3ml/min；
[0082]
柱温：40℃；
[0083]
进样量：1μl；
[0084]
梯度洗脱程序见表4。
[0085]
表4梯度洗脱程序
[0086]
时间/min流动相a/％流动相b/％09550.59553.5356555955.19557955
[0087]
②
质谱条件为：
[0088]
离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0089]
检测方式：多反应监测(mrm)；
[0090]
扫描方式：正离子模式；
[0091]
离子化电压：4500v；
[0092]
离子源温度：350℃；
[0093]
气帘气压力：35psi；
[0094]
喷雾气压力：55psi；
[0095]
辅助气压力：60psi；
[0096]
其他质谱参数见表5。
[0097]
表5环吡氟草酮定性、定量离子和质谱分析参数
[0098][0099]
*
定量离子对。
[0100]
得到的校正曲线如表6、图3所示。
[0101]
表6环吡氟草酮在小麦中的基质匹配校正曲线
[0102]
化合物回归方程线性范围(ng/ml)相关系数(r)环吡氟草酮y＝5.62882e4 x
–
1420.676500～1000.99888
[0103]
(6)加标回收率和重复性
[0104]
在不含环吡氟草酮的小麦样品中分别加入0.002mg/kg、0.006mg/kg、0.02mg/kg三个水平的环吡氟草酮标准溶液，静置30min后按上述步骤进行含量测定。每个添加水平平行测定6次。将测定结果与理论添加浓度进行比较，得到平均回收率及相对标准偏差，结果见表7。
[0105]
表7环吡氟草酮在小麦中的回收率及精密度(n＝6)
[0106][0107]
如表7所示，三个加标水平环吡氟草酮的平均回收率范围为82.3～85.3％，相对标准偏差范围为1.4％～4.5％，表明本实施例方法回收率与重复性均符合要求。
[0108]
(7)灵敏度
[0109]
以实际添加样品的最低检测限为检出限，本实施例中，环吡氟草酮在小麦中的检出限为0.002mg/kg。
[0110]
可见，本发明方法可有效对小麦中环吡氟草酮的残留量进行检测。
[0111]
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制样：取待测小麦样品，粉碎后使其全部能够通过425μm的标准网筛，放入聚乙烯瓶中，-18℃保存；(2)提取：取待测小麦样品加水混匀后静置；加入含甲酸的乙腈溶液振荡；加入质量比为4:1的无水硫酸镁和氯化钠剧烈振荡，离心，取上层乙腈相，氮吹至近干；加入甲醇溶液，涡旋溶解残留物，待净化(3)净化：选用甲醇和水活化平衡的固相萃取柱；将步骤(2)中待净化的样品溶液加入固相萃取柱中，弃去流出液；用甲醇溶液淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液；加入甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干；加入甲醇，涡旋溶解残留物，过滤，得到待测样品液；(4)测定
①
定性分析：采用液相色谱-串联质谱仪检测样品和基质匹配标准工作溶液，记录样品和基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的样品与基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮的相对离子丰度；当样品中检出与基质匹配标准工作溶液中环吡氟草酮色谱峰保留时间一致的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过表1规定的范围，可以确定样品中检出环吡氟草酮；表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对丰度(％)>50％20％～50％10％～20％≤10％最大允许偏差(％)
±
20
±
25
±
30
±
50
②
定量测定：将基质匹配标准工作溶液分别用液相色谱-串联质谱仪进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积；以基质匹配标准工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；样品溶液中环吡氟草酮的含量，用标准曲线外标法确定；样品中环吡氟草酮的含量按公式(1)进行计算；式中：x表示样品中环吡氟草酮的含量，mg/kg；c表示从标准曲线中读出的样品溶液中环吡氟草酮的浓度，ng/ml；v1表示提取液体积，ml；v2表示进行氮吹所取的提取液体积，ml；v3表示定容体积，ml；m表示样品质量，g。2.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，每1g小麦样品加入2ml的水，每1g小麦样品加入2ml的乙腈，进行氮吹所取的乙腈相为4ml；甲醇溶液的加入量为4ml。3.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述含甲酸的乙腈中甲酸体积分数为1％；所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为40％。4.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述无水硫酸镁、氯化钠质量加和与待测玉米样品的质量比为1:1。5.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述
的步骤(3)中，用于活化平衡固相萃取柱的甲醇和水均为5ml；用于淋洗固相萃取柱的甲醇溶液为5ml；用于洗脱的甲醇为5ml；用于溶解残留物的甲醇为2ml；所述的步骤(4)
①
定性分析中，液相色谱-串联质谱检测条件为：(ⅰ)色谱条件a)色谱柱：acquity uplc beh c18；b)流动相：a：水，其中含1vol％的甲酸，b：乙腈，其中含1vol％甲酸)，梯度洗脱；c)流速：0.3ml/min；d)柱温：40℃；e)进样量：1μl；(ⅱ)质谱条件离子源：电喷雾离子源esi；检测方式：多反应监测mrm；扫描方式：正离子模式；离子化电压：4500v；离子源温度：350℃；气帘气压力：35psi；喷雾气压力：55psi；辅助气压力：60psi其他质谱参数见表2；表2环吡氟草酮定性、定量离子和质谱分析参数
*
定量离子对。6.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述的固相萃取柱为亲水亲脂聚合物固相萃取柱，所述用于淋洗固相萃取柱的甲醇溶液中甲醇体积比为40％。7.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，基质匹配标准工作溶液配制步骤为：(ⅰ)标准中间溶液：准确移取1000mg/l的环吡氟草酮标准品50μl于50ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/l的标准中间溶液(1)；准确移取1000μl标准中间溶液(1)于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为100μg/l的标准中间溶液(2)；(ⅱ)基质匹配标准工作溶液：分别准确移取0μl、20μl、50μl标准中间溶液(2)和15μl、50μl、70μl、100μl标准中间溶液(1)，用空白样品溶液稀释至1ml，摇匀，作为系列基质匹配标准工作溶液，环吡氟草酮浓度依次为0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、100ng/ml；所述的空白样品溶液是指不含环吡氟草酮的样品经步骤(2)(3)处理后得到的样品溶液。
8.根据权利要求1所述的一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法，其特征在于，所述步骤(4)
①
定性分析过程中，梯度洗脱程序见表3；表3梯度洗脱程序时间/min流动相a/％流动相b/％09550.59553.5356555955.19557955。

技术总结
本发明属于农药残留检测技术领域，提供一种检测小麦中环吡氟草酮残留量的方法。本发明采用固相萃取前处理技术，结合液相色谱-串联质谱检测技术，可对小麦中的环吡氟草酮残留量进行检测，环吡氟草酮的平均回收率为82.3％～85.3％，相对标准偏差(RSD)为1.4％～4.5％，检出限为0.002mg/kg。本方法具有灵敏、准确的优点。点。点。


技术研发人员：边海涛 勇艳华 李海燕 郝苗 李鹏 董睿男 苏春敏 刘杨
受保护的技术使用者：大连市检验检测认证技术服务中心
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/10/8