一种植物多糖及在抗干细胞衰老、制备干细胞培养基中的应用的制作方法

1.本发明属于干细胞领域，涉及抗干细胞衰老，具体涉及一种植物多糖及在抗干细胞衰老、制备干细胞培养基中的应用。


背景技术：

2.干细胞是具有自我更新能力、在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞，包括胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞等。间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定条件下可向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌肉细胞等进行分化，有广泛应用前景。
3.在适当的条件下人脐带间充质干细胞可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、多巴胺能神经细胞、肝细胞样细胞、胰岛样细胞等方向分化，为其在神经系统疾病、心血管系统疾病、糖尿病、肝脏疾病、骨科疾病等方面奠定了实验研究基础。人脐带间充质干细胞还具有以下优点，如采集和运输方便，无异体排斥反应，无伦理争议等。
4.但是，包括脐带间充质干细胞在内的间充质干细胞在体外培养过程中较为容易衰老。为了抑制人脐带间充质干细胞体外培养衰老，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种植物多糖及在抗干细胞衰老、制备干细胞培养基中的应用。
6.本发明目的通过以下技术方案实现：
7.一种抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，制备步骤如下：将胡荽子粉碎，用二氯甲烷加热脱脂，再用纯净水对脱脂后的胡荽子粉末加热提取获得水提液；水提液减压浓缩，冷却后按照体积比1:4加入无水乙醇，混匀、静置获得沉淀；将沉淀用纯净水复溶，使用sevag法脱蛋白，透析，冷冻干燥，得到胡荽子多糖。
8.优选地，二氯甲烷脱脂步骤的参数为：料液比1g:30ml、提取温度90℃、提取时间3.5h。
9.优选地，纯净水提取步骤的参数为：料液比1g:30ml、提取温度90℃、提取时间3.5h。
10.优选地，使用旋转蒸发仪减压浓缩。
11.优选地，透析截留分子量为1000d。
12.上述抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖体外抗人脐带间充质干细胞衰老的用途。
13.上述任一抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖用于制备抗人脐带间充质干细胞衰老的培养基的用途。
14.有益技术效果：
15.1、本发明使用水提醇沉法从胡荽子中提取得到多糖，步骤简单，可操作性强；
16.2、本发明提供的胡荽子多糖具有抗人脐带间充质干细胞衰老的作用，且不会影响人脐带间充质干细胞的干性，具有开发成抗干细胞衰老的人脐带间充质干细胞培养基的应用前景。
附图说明
17.图1为胡荽子多糖sem图。
18.图2为倒置显微镜观察细胞生长形态。
19.图3为β-半乳糖甘酶染色结果。
20.图4为westernblot检测oct4、sox2蛋白表达水平。
具体实施方式
21.实施例1：多糖制备
22.胡荽子购自安徽亳州药材市场，经鉴定为伞形科植物芫荽的干燥果实。
23.将胡荽子粉碎，用二氯甲烷在料液比为1g:30ml、提取温度90℃、提取时间3.5h的条件下脱脂，再用纯净水在料液比为1g:30ml、提取温度为90℃、提取时间为3.5h的条件下对脱脂后的胡荽子粉末提取获得水提液。水提液用旋转蒸发仪浓缩，冷却后按照体积比1:4加入无水乙醇，混匀、静置获得沉淀。将沉淀用纯净水复溶，使用sevag法脱蛋白，透析(截留分子量1000d)，冷冻干燥，得到胡荽子多糖。
24.sem图如图1所示，呈现不规则片状。干燥保存备用。
25.实施例2：活性测定
26.一、实验材料
27.胎牛血清fbs购自gibco。α-mem培养液购自invitrogen公司。
28.cd73-pe、cd90-pe、cd105-fitc、cd34-fitc、cd45-fitc抗体购自abcam。
29.葡萄糖、β-半乳糖甘酶染色试剂、trizol试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
30.胡荽子多糖按照实施例1方法制备，干燥保存备用。
31.oct4、sox2、gapdh一抗、二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。
32.二、实验方法
33.1、人脐带间充质干细胞培养和鉴定
34.使用生理盐水将足月顺产新生儿脐带清洗3遍，去除血管中及表面的血液，然后将脐带放于75％的医用酒精中浸泡约30s，取出脐带用生理盐水清洗3遍后剥离华氏胶，将其切成约2mm
×
2mm小块，置于直径10cm培养皿中，加10ml含10％胎牛血清的α-mem培养液，置于37℃、5％co2培养条件中培养、传代。取第3代细胞，倒置显微镜下观察细胞生长形态，用抗体cd73-pe、cd90-pe、cd105-fitc、cd34-fitc、cd45-fitc标记，流式细胞仪检测细胞免疫表型。
35.2、衰老模型造模和分组
36.取第3代人脐带间充质干细胞，用含10％胎牛血清和25mmol/l葡萄糖以及0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml胡荽子多糖的α-mem培养液于37℃、5％co2培养条件中培养96h。含有0μg/ml胡荽子多糖的培养组为模型组，含有20μg/ml或50μg/ml胡荽子多糖的培养组为抗衰老组。同时设置对照组，对照组使用含有10％胎牛血清的α-mem培养液于37℃、5％co2培养条
件中培养96h。
37.3、半乳糖苷酶染色测定干细胞衰老
38.取上述模型组、抗衰老组、对照组人脐带间充质干细胞，胰酶消化后用pbs重悬，计数，按1
×
105个/孔接种于6孔板中，pbs洗涤1次，每孔加入1mlβ-半乳糖甘酶染色固定液，室温固定1h，吸除固定液，pbs洗涤细胞3次，每次3min，吸尽pbs后每孔加入1ml染色工作液，避光于37℃摇床上缓慢摇晃孵育过夜，次日显微镜下观察细胞染色情况，并计算每个视野内染色阳性细胞数量，阳性率(％)＝(视野中阳性细胞数量/视野中总细胞数量)
×
100％。
39.4、westernblot
40.取第3代人脐带间充质干细胞，用含10％胎牛血清和0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml胡荽子多糖的α-mem培养液于37℃、5％co2培养条件中培养96h，提取总蛋白，bca法进行蛋白定量。各组取等量总蛋白上样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加质量分数5％脱脂奶粉，室温低速摇床封闭1h。加稀释的oct4、sox2、gapdh一抗，4℃孵育过夜。tbst洗膜4次，每次10min。加稀释的igg二抗，室温下孵育2h。加ecl发光液显影，胶片曝光，洗片，拍照。
41.5、统计学分析
42.采用spss19.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值
±
标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。p《0.05为差异具有统计学意义。
43.三、实验结果
44.1、人脐带间充质干细胞鉴定
45.倒置显微镜下观察细胞生长形态如图2所示，梭形旋涡状生长，符合人脐带间充质干细胞生长特点。流式细胞仪检测显示cd73-pe、cd90-pe、cd105-fitc表达率在97％以上，cd34-fitc、cd45-fitc表达率在2％以内，符合人脐带间充质干细胞免疫表型。
46.2、多糖抗干细胞衰老
47.β-半乳糖甘酶染色结果如图3所示，模型组染色阳性率显著高于对照组，说明衰老造模成功；与模型组相比，抗衰老组染色阳性率显著降低，说明胡荽子多糖具有抗人脐带间充质干细胞衰老的作用，并且呈现剂量依赖性特点。
48.3、oct4、sox2蛋白表达
49.westernblot结果如图4所示，各组人脐带间充质干细胞中维持干细胞干性的核心蛋白oct4、sox2差异不明显，说明胡荽子多糖对人脐带间充质干细胞的干性影响不明显。
50.综合上述实验，胡荽子多糖具有抗人脐带间充质干细胞衰老的作用，且不会影响人脐带间充质干细胞的干性，具有开发成抗干细胞衰老的人脐带间充质干细胞培养基的应用前景。
51.以上实施例是为了具体介绍本发明的实质性内容。本领域技术人员应当知道，不应将本发明保护范围局限于以上具体实施例。

技术特征：
1.一种抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，其特征在于，制备步骤如下：将胡荽子粉碎，用二氯甲烷加热脱脂，再用纯净水对脱脂后的胡荽子粉末加热提取获得水提液；水提液减压浓缩，冷却后按照体积比1:4加入无水乙醇，混匀、静置获得沉淀；将沉淀用纯净水复溶，使用sevag法脱蛋白，透析，冷冻干燥，得到胡荽子多糖。2.根据权利要求1所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，其特征在于，二氯甲烷脱脂步骤的参数为：料液比1g:30ml、提取温度90℃、提取时间3.5h。3.根据权利要求1所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，其特征在于，纯净水提取步骤的参数为：料液比1g:30ml、提取温度90℃、提取时间3.5h。4.根据权利要求1所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，其特征在于：使用旋转蒸发仪减压浓缩。5.根据权利要求1所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖，其特征在于：透析截留分子量为1000d。6.权利要求1-5任一所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖体外抗人脐带间充质干细胞衰老的用途。7.权利要求1-5任一所述的抗人脐带间充质干细胞衰老的植物多糖用于制备抗人脐带间充质干细胞衰老的培养基的用途。

技术总结
本发明公开了一种植物多糖及在抗干细胞衰老、制备干细胞培养基中的应用，该植物多糖制备步骤如下：将胡荽子粉碎，用二氯甲烷加热脱脂，再用纯净水对脱脂后的胡荽子粉末加热提取获得水提液；水提液减压浓缩，冷却后按照体积比1:4加入无水乙醇，混匀、静置获得沉淀；将沉淀用纯净水复溶，使用Sevag法脱蛋白，透析，冷冻干燥即得。该胡荽子多糖具有抗人脐带间充质干细胞衰老的作用，且不会影响人脐带间充质干细胞的干性，具有开发成抗干细胞衰老的人脐带间充质干细胞培养基的应用前景。带间充质干细胞培养基的应用前景。带间充质干细胞培养基的应用前景。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：南京良纬生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/10/8