一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料及其制备

1.本发明属于纳米材料、生物催化及分析检测技术领域，具体涉及一种负载铱纳米团簇的金属有机框架纳米复合材料及其制备和应用。


背景技术：

2.用于高灵敏度和快速检测不同分析物的比色传感器在包括环境污染、食品工业、生化分析、生物医学等各个领域发挥着关键作用，其适用于资源有限地区或初级医疗机构的疾病诊断，因为对昂贵的仪器没有要求。得益于优异的催化活性、高灵敏度和底物特异性的优点，天然酶，如葡萄糖氧化酶(gox)、氧化酶(oxd)和过氧化物酶(pod)已被证实是用于设计检测多种生物标志物的高效生物传感器的活性组分，用于检测包括葡萄糖、过氧化氢(h2o2)、黄嘌呤、乳酸盐等分析物，尽管天然酶在比色检测中具有高灵敏度，但其固有缺点(如成本高、不稳定性以及生产储存困难)仍然限制了其应用。
3.尽管天然酶的应用受到严重限制，但其催化中心，尤其是金属酶的催化中心，为构建模拟酶的纳米材料提供了思路和见解。近年来，各种基于过渡金属的纳米结构已被探索用于检测生物标志物，例如贵金属纳米材料(银和金纳米颗粒，pd@pt纳米枝晶等)、金属氧化物(fe3o4、ceo2、moo3、co3o4和mno2等)、金属氢氧化物(cu(oh)2)、碳基单原子材料(fe、co、zn-n-c)等。然而，设计具有高催化活性、选择性和稳定性的仿酶纳米材料仍然是一个巨大的挑战。
4.纳米团簇是指由几个到几百个乃至上千个原子、分子或者离子结合在一起，构成的相对稳定的非刚性结合体，是单个原子分子到宏观固体的过渡态。其基本物理效应包括：尺寸效应、表面、界面效应和量子尺寸效应等。现有技术中有将金属纳米团簇用于制备检测传感器，如cn114324266公开了一种纳米金团簇制备及其在生物小分子增敏检测方法，所得金纳米团簇可作为尿酸传感器。
5.但是上述现有技术中已经公开的这些仿酶纳米材料在用作h2o2比色检测器时，均未考虑仿酶材料中可能同时存在的仿氧化酶活性将对h2o2活性检测有所干扰，从而并不能实现准确地检测h2o2。
6.ir(铱)是一种稀有元素，化学性质稳定；现有技术如cn113466189a中指出，ir纳米酶具有串联酶活性，即ir纳米酶同时具有仿过氧化物酶和仿氧化酶双重活性；由上述分析可知，正是由于具有串联酶活性，使得其用于比色诊断h2o2相关生物标志物时，不够灵敏且检测范围相对较窄。


技术实现要素：

7.针对上述缺陷，本发明将铱以纳米团簇的形式均匀锚定在金属有机框架mof上得到一种仿酶材料，所得负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料只具有pod活性而没有oxd活性，从而形成了一种过氧化物酶仿酶纳米材料(模拟酶纳米反应器)，由于只具有pod活性而没有oxd活性，因此使得其能够超灵敏地比色检测过氧化氢相关生物标志物。
8.本发明的技术方案：
9.本发明要解决的第一个技术问题是提供一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，所述仿酶材料是将铱(ir)纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架(mof)上制得。
10.进一步，所述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料具有过氧化物酶活性，没有氧化酶活性。
11.进一步，所述金属有机框架mof选自：ti-mof、fe-mof、mn-mof、co-mof或cu-mof。
12.进一步，所述铱纳米团簇的粒径大小为2～50nm。
13.本发明要解决的第二个技术问题是提供上述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料的制备方法，所述制备方法为：将铱的盐溶液和mof分散液混匀，于20～150℃反应5～48小时；然后收集沉淀并经洗涤干燥即得所述仿酶纳米材料。
14.进一步，所述铱的盐和mof的质量比为：5～100：200。
15.进一步，所述铱的盐溶液中的盐包括：铱的氯化盐、硫酸盐、硝酸盐、或乙酰丙酮盐等。
16.具体的，所述铱的盐溶液中的盐选自：氯化铱、乙酰丙酮铱、氯铱酸水合物、醋酸铱或氯铱酸钠六水合物。
17.本发明中，所述金属有机框架mof采用现有技术中常用的制备方法制得即可。
18.本发明要解决的第三个技术问题是指出上述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料在h2o2、l-半胱氨酸、葡萄糖、肿瘤、病毒、血红蛋白、妊娠或酒精的精准比色检测中的用途。
19.本发明要解决的第四个技术问题是提供一种过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖检测传感器(纳米反应器)，所述传感器的活性组分为上述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料。
20.本发明要解决的第五个技术问题是提供一种过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖的检测方法，所述检测方法为：利用上述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料的过氧化物酶活性催化目标物，通过比色法检测目标物的浓度，所述目标物为过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖。
21.本发明要解决的第六个技术问题是提供一种提高铱活性位点过氧化物酶活性的方法，所述方法为：将铱纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架mof上。ir纳米酶具有串联酶活性，即ir纳米酶同时具有仿过氧化物酶和仿氧化酶双重活性，使得其用于比色诊断h2o2相关生物标志物时，不够灵敏且检测范围相对较窄；本发明发现，当将铱以纳米团簇的形式均匀锚定在金属有机框架mof上时，所得仿生酶纳米材料具有pod活性而没有oxd活性，使得其能够超灵敏地比色检测过氧化氢相关生物标志物。
22.本发明的有益效果：
23.本发明将ir纳米团簇均匀稳定地锚定在有机金属骨架mof上制得了一种新型的仿酶纳米材料(如ir
ncs
@ti-mof)，其能够作为pod模拟纳米反应器，替代天然酶用于多种生物标志物的高效和选择性比色检测。由于所得仿酶纳米材料中存在的金属-n/o配位和过渡金属团簇的独特酶性质，使得仿酶纳米材料显示出优异和独特的pod模拟活性，因此显示出优异的pod检测活性和良好的底物选择性。由于所述仿酶纳米材料具有过氧化物酶活性，而没有氧化酶活性，因此能够用于精准地比色诊断h2o2相关生物标志物。
24.可见，本发明不仅为医疗资源有限的地区提供了高度灵敏和廉价的比色生物传感器，而且将为工程化可定制的模拟酶纳米反应器提供新的途径，作为准确和快速诊断的有力工具。
附图说明：
25.图1为本发明实施例1中ir
ncs
@ti-mof的合成示意图及其用作纳米反应器的比色检测原理示意图。
26.图2为本发明实施例1中ti-mof和ir
ncs
@ti-mof的pxrd图。
27.图3为本发明实施例1所得材料的sem图：(a)ti-mof的sem图；(b)和(c)ir
ncs
@ti-mof的sem图。
28.图4(a)和(b)为本发明实施例1所得ir
ncs
@ti-mof的hrtem图。
29.图5为本发明实施例1所得纳米材料ir
ncs
@ti-mof的eds线扫图。
30.图6为本发明实施例1所得ir
ncs
@ti-mof的edsmapping(插入比例尺为1μm)图。
31.图7(a)为实施例1所得的ir
ncs
@ti-mof的红外光谱图；(b)ti-mof的n2等温吸附-脱附曲线图。
32.图8为实施例1所得材料(a)ti-mof和(b)ir
ncs
@ti-mof的xps扫描全谱图。
33.图9为实施例1所得材料(a)ti-mof和(b)ir
ncs
@ti-mof的高分辨率xpsc1s谱图。
34.图10为本发明实施例1所得材料(a)n1s、(b)ti2p和(c)ir4f的高分辨xps图。
35.图11为实施例1所得材料ti-mof和ir
ncs
@ti-mof的高分辨率o1s谱的xpso1s谱：。
36.图12为用tmb比色法评估并比较了本发明实施例1所得材料的pod和oxd仿酶活性的结果：(a)以tmb为底物的pod和oxd仿酶活性的吸光度光谱，图中，ir
ncs
@ti-mof指：h2o2+tmb+ir
ncs
@ti-mof，ti-mof指：h2o2+tmb+ti-mof，对照组指：h2o2+tmb；(b)不同浓度ir
ncs
@ti-mof的pod活性的时间依赖性；(c)不同浓度ir
ncs
@ti-mof的pod活性结果图。
[0037][0038]
图13为实施例1所得材料的pod活性结果及其稳定性结果：(a)ir
ncs
@ti-mof在不同温度下的pod活性；(b)ir
ncs
@ti-mof在pod活性测试期间的溶液稳定性；(c，d)在磷酸盐缓冲液(ph7.4)和rpmi1640培养基中孵育2天后的sem图。
[0039]
图14为实施例1所得ir
ncs
@ti-mof材料的类pod活性的稳态动力学结果：tmb作为底物时的michaelis-menten曲线(a)、双倒数曲线(b)和动力学参数(c)；h2o2作为底物时的michaelis-menten曲线(d)、双倒数曲线(e)、和动力学参数(f)。
[0040]
图15为实施例1所得ir
ncs
@ti-mof材料pod催化过程的产物检测结果：在pod模拟试验期间使用bq和nan3作为猝灭剂(a)的自由基猝灭过程，图中，1：h2o2+tmb；2：h2o2+tmb+ir
ncs
@ti-mof；3：h2o2+tmb+ir
ncs
@ti-mof+bq；4：h2o2+tmb+ir
ncs
@ti-mof+nan3；(b)使用he和(c)使用dpa探针检测
·o2-和1o2的荧光强度和吸光度图。
[0041]
图16为实施例1所得ir
ncs
@ti-mof材料h2o2的比色检测结果：(a)在pod模拟试验中使用不同浓度的h2o2时，ir
ncs
@ti-mof体系吸光度的浓度依赖性曲线；(b)h2o2的线性相关图。
[0042]
图17为实施例1所得ir
ncs
@ti-mof材料检测l-半胱氨酸的结果：(a)在pod模拟试验中使用不同浓度的l-半胱氨酸时，ir
ncs
@ti-mof体系吸光度的浓度依赖性曲线；(b)l-半胱
氨酸的线性相关图；(c)ir
ncs
@ti-mof与早期报道的pod模拟纳米材料用于l-半胱氨酸检测的比较；(d)l-半胱氨酸比色检测的选择性。
[0043]
图18为实施例1所得材料ir
ncs
@ti-mof检测葡萄糖的结果：(a)在pod模拟试验中使用不同浓度的葡萄糖时，ir
ncs
@ti-mof体系吸光度的浓度依赖性曲线；(b)葡萄糖的线性相关图；(c)ir
ncs
@ti-mof与早期报道的pod模拟纳米材料用于葡萄糖检测的比较；(d)葡萄糖比色检测的选择性。
具体实施方式
[0044]
本发明提出了一种新型仿酶纳米材料，通过将ir过渡金属纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架mof中(即通过配位辅助策略合成了一种新型的仿酶纳米材料如ir
ncs
@ti-mof)制得；其可作为pod模拟纳米反应器，用于比色诊断h2o2相关生物标志物。系统的比色测试表明本发明所得仿酶纳米材料纳米反应器显示出对多种h2o2相关生物标志物的高效的诊断活性和底物选择性，其检测限非常低：h2o2在0～900μm范围内为14.12μm，l-半胱氨酸在0～50μm的范围内为3.41μm；葡萄糖在0～600μm内为20.0μm。同时，金属有机框架(如ti-mof)结构的良好稳定性也使纳米反应器能够在苛刻条件下(如高低温、酸性条件)高效工作。
[0045]
本发明所得的仿酶纳米材料由于仅有pod活性而没有oxd活性，在h2o2存在条件下，仿pod酶催化剂催化h2o2产生活性氧，进一步催化tmb转变为氧化oxtmb；而oxd与pod区别就是不需要h2o2，催化剂直接催化o2等产生活性氧，催化tmb转变为氧化oxtmb(比色检测中也会变成蓝色)；因此当将仿oxd酶催化剂材料作为h2o2检测器使用时，可能会存在待测液体中即使不存在h2o2，由于其会直接催化o2等产生活性氧，也会出现催化tmb转变为蓝色oxtmb的情况，从而不能精准地用于检测h2o2。而本发明所得的新型仿酶纳米材料，由于其具有pod活性而没有oxd活性，这种高效专一的pod活性，可以避免oxd存在带来的性能干扰，因此展现出高效的、宽的检测范围(h2o2检测范围:0～900μm)。
[0046]
另外，本发明所得仿酶材料中金属ir含量相对较低(xps数据显示1.62at％)，展现了高的pod活性(基于h2o2仿酶动力学参数：v
max
＝1.7μms-1
；km＝3.94mm；ton＝39.64
×
10-3
s-1
)，促使检测范围更宽。同时在生物体内应用时，ti-mof好的生物相容性，不会在体内长期存留，代谢较快，无一定副作用。
[0047]
此外，ti-mof等金属有机框架为过渡金属如ir催化位点的均匀负载提供了高孔隙率、坚固性和良好生物安全性的条件；此外，得益于ti-mof的ir
ncs-n/o配位环境(即金属-n的配位作用，金属-o的配位作用)和ir团簇的独特酶性质，ir
ncs
@ti-mof显示出独特的类pod活性，从而证明了其优异的pod检测活性和底物选择性。与现有公开的pod模拟物相比，ir
ncs
@ti-mof显示出优异的传感性能，具有诊断活性和底物选择性，从而能够对多种h2o2相关生物标志物进行超灵敏的测定。
[0048]
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
[0049]
本发明实施例中用到的材料与试剂：
[0050]
钛酸四丁酯(tbot)、2-氨基对苯二甲酸、3，3
′
，5，5
′‑
四甲基联苯胺(tmb，99.9％)、5，5-二甲基-1-吡咯烷-n-氧化物(dmpo，97.0％)、苯醌(bq)、nan3和gox(来自黑曲霉)从阿
拉丁试剂(中国上海)获得。氯化铱(ircl3·
xh2o)从安耐吉化学(中国上海)获得。甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖购自科隆化学(中国成都)。所有其他化学品均从阿拉丁试剂中获得，并按收到的状态使用，无需进一步纯化，实验中使用的去离子纯水(18.2mω
·
cm)由milli-q academic系统(milliporecorp.，billerica，ma，usa)生产。
[0051]
实施例1：
[0052]
ti-mof的合成(溶剂热法)：将含有0.543g2-氨基对苯二甲酸的9mldmf(n,n-二甲基甲酰胺)与含有0.26ml的丁醇钛的1ml甲醇混合；然后将混合物超声处理约20分钟，并在150℃的高压釜中进一步水热处理48h；然后用dmf和乙醇洗涤沉淀物，并在真空下干燥得ti-mof。
[0053]
仿酶纳米材料ir
ncs
@ti-mof的合成：将200mgti-mof分散在具有40ml乙醇的烧瓶中，连续超声处理10min；然后将3mlircl3·
xh2o(cas:10025-83-9)水溶液(浓度为10mgml-1
)倒入上述溶液中；超声处理10分钟后，将混合物转移到100ml聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在80℃下反应24小时；收集沉淀物并用h2o和乙醇溶液洗涤至少3次，然后在60℃的真空下干燥过夜制得ir
ncs
@ti-mof。
[0054]
ir
ncs
@ti-mof的合成示意图如图1所示，本发明通过溶剂热法合成的ti-mof，也称为nh
2-mil-125，具有ti前体和2-氨基对苯二甲酸(nh
2-bdc)的配体；此外，基于ir-n/o配位，ir催化位点通过协调辅助策略可以均匀地锚定在ti-mof载体上得到ir
ncs
@ti-mof。
[0055]
试验例1ir
ncs
@ti-mof的结构表征：
[0056]
1)检测方法：
[0057]
使用hitachiregulus8220进行扫描电子显微镜(sem)。透射电子显微镜(tem)、像差校正高角度环形暗场扫描tem(achaadf-stem)和能量色散光谱(eds)元素分布通过在200kv下运行的talosf200xtem显微镜(美国fei有限公司)进行，并通过无gms分析进行分析。
[0058]
使用x射线衍射(xrd，dx-2700bh，中国丹东浩元仪器)分析了2θ范围为5～80
°
内的cukα辐射，x射线光电子能谱(xps)在k-alpha
tm
+x射线光电子光谱仪系统中进行测试，配有半球180
°
双焦点分析仪和128-通道探测器。
[0059]
在傅里叶变换红外光谱分析中使用nicolet-ls50分光光度计(nicol，us)在4000～500cm-1
范围内对ti-mof和ir
ncs
@ti-mof进行分析，分辨率为2cm-1
。
[0060]
n2吸附分析在quantachromeautosorbiq仪器上进行；在实际测量之前，所有粉末样品在150℃下脱气过夜。
[0061]
通过使用bet计算来计算表面积。基于狭缝/圆柱形孔的qsdft模型，从等温线的吸附分支记录孔径分布(psd)图。
[0062]
2)检测结果：
[0063]
x射线衍射图显示，在锚定ir位点后，ti-mof的晶体结构没有显著变化(图2)。扫描电子显微镜图像显示，ti-mof和ir
ncs
@ti-mof显示具有代表性的盘状纳米片，直径约为395nm，厚度约为112nm(图3)。高分辨率透射电子显微镜图像显示，ir团簇(粒径约3nm)均匀分布在ir
ncs
@ti-mof，且0.1921nm的晶格条纹间距与ir(200)平面非常一致(图4)。ir
ncs
@ti-mof的线扫描元素信号和能量色散光谱(eds)映射如图5和图6所示，进一步揭示了c、n、o、
ti、ir的均匀分布，从而表明ir均匀地锚定在ti-mof上。
[0064]
傅里叶变换红外光谱表明，在3000～3700cm-1
范围内的带宽变化表明ir原子和-nh2基团之间的配位(图7a)；-cooh基团的不同峰形状表明了-cooh的o原子和ir原子之间的相互作用。bet数据表明，ti-mof具有1408.04m2g-1
的较高表面积，和约0.567nm的平均孔径(图7b)。
[0065]
x射线光电子能谱(xps)测试以研究化学成分和电子状态，结果如图8～10以及表1。图10a中ir
ncs
@ti-mof的n1s谱表明了-nh-+
从402.6ev到401.7ev的明显结合能偏移，证实了ir-n的配位，这与ft-ir的结果一致。ti2p和o1s的光谱表明，ir
ncs
@ti-mof与原始ti-mof相比，由于ti原子周围的ir-o原子之间的相互作用，ti和o物种向低结合能偏移(图10b和图11)。ir4f光谱显示(图10c)，ir原子中的氧化态主要由ir0和ir
n+
组成，表明形成了n/o配位的ir团簇。
[0066]
表1通过xps测量确定的实施例1所得仿酶纳米材料中的元素含量
[0067][0068]
试验例2ir
ncs
@ti-mof的酶模拟传感活性：
[0069]
1)检测方法：
[0070]
pod模拟催化试验方法：ir
ncs
@ti-mof溶液(10mgml-1
，10μl)加入到1990μl乙酸钠-乙酸(naoac-hoac)缓冲液(ph4.5，100mm)中，该缓冲液中含有h2o2(0.1m，25μl)和tmb(10mgml-1
，24μl)；然后，将一部分混合物用于652nm处的紫外可见光谱吸光度测量。
[0071]
2)检测结果：
[0072]
如图12a所示，ir
ncs
@ti-mof显示出非常高效的tmb氧化活性，在652nm处具有最高的特征吸收峰，而ti-mof显示出非常差的pod模拟活性。同时ir
ncs
@ti-mof还表现出浓度和时间依赖性的酶模拟性能(图12b，c)，且没有明显的oxd活性。
[0073]
另外，本发明所得仿酶纳米材料(纳米反应器)在苛刻的反应条件下仍具有高催化活性，例如在宽温度范围内(图13a)。为了验证ir
ncs
@ti-mof的长期结构稳定性，将ir
ncs
@ti-mof样品在naoac-hoac缓冲液中孵育30天后(ph4.5)，pod模拟活性没有减弱，表明它具有良好的pod模拟稳定性(图13b)。ir
ncs
@ti-mof在各种水介质中孵育后，没有明显的结构变化，表明其稳定的结构有利于生物传感(图13c和d)。
[0074]
通过催化常数(km)、最大反应速率(v
max
)和周转数(ton)这些动力学参数进一步揭示了类pod活性的稳态动力学，结果如表2和图14所示，ir
ncs
@ti-mof分别以tmb(图14a，b)和h2o2(图14d，e)为底物，michaelis
–
menten动力学的双倒数图显示出良好的线性拟合关系；动力学参数的结果表明ir
ncs
@ti-mof的pod模拟活性具有快速反应动力学(图14c，f)。
[0075]
表2irncs@ti-mof以h2o2，tmb为底物时的动力学参数
[0076][0077]
试验例3活性中间体确定：
[0078]
1)检测方法：
[0079]
自由基猝灭实验通过苯醌(bq，一种
·o2-猝灭剂)和叠氮化钠(nan3，一种1o2猝灭)进行检测。
[0080]
用氢乙烷(he)检测
·o2-：he是一种特异性探针，可与
·o2-反应生成荧光乙锭，在470nm激发，在610nm发射；首先，将1.5mlir
ncs
@ti-mof-buffer溶液(100μg
·
ml-1，0.1m naoac-hoac缓冲液(ph4.5))与1.5μl0.1mh2o2水溶液在37℃下混合40分钟；然后将1.5mlhe乙醇溶液(1mg
·
ml-1
)添加到体系中。随后，在荧光测量之前，将溶液涡旋混合并保持不受干扰40分钟。
[0081]1o2生成的定量分析：对于1o2检测，5μgml-1
ir
ncs
@ti-mofnaoac-hoac缓冲溶液与1mgml-1
dpa和0.1mh2o2以20:1:1的体积比混合，然后使用uv-vis分光光度计进行分析。
[0082]
2)检测结果：
[0083]
添加对苯醌和叠氮化钠后，在652nm处oxtmb的强度值降低，证实了生成的主要产物是
·o2-和1o2，且1o2的量高于
·o2-(图15a)。
[0084]
使用氢乙烷(he)探针进一步证实了
·o2-的生成(图15b)，加入ir
ncs
@ti-mof后610nm处的荧光强度明显增加，证明了
·o2-的存在。使用9，10-二苯醌(dpa)作为探针，进一步检测1o2的生成(图15c)。随着反应时间的增加，1o2逐渐生成。可见，本发明已经证明，
·o2-和1o2是pod模拟过程中的主要产物。
[0085]
试验例4ir
ncs
@ti-mof用于h2o2的比色检测：
[0086]
1)检测方法：
[0087]
将ir
ncs
@ti-mof(10mgml-1
，10μl)、tmb(10mgml-1
，24μl)和不同浓度的h2o2(0.1m)加入缓冲液(100mm，ph4.5)中以展示显色反应。用缓冲液(ph4.5)将混合物的最终体积调节至2ml。lod计算公式为lod＝3σ/k，其中σ是实验的标准偏差，k是线性曲线的斜率。
[0088]
2)检测结果：
[0089]
如图16a所示，652nm处的特征吸收峰随着h2o2浓度的增加而逐渐增加。观察到吸光度与h2o2浓度(0～900μm)之间的比例线性相关，相关系数为0.9963(图16b)。经过计算，h2o2的lod为14.12μm，相对标准偏差为0.8％；表明本发明所得ir
ncs
@ti-mof表现出对h2o2的超高检测活性。
[0090]
对照cn113457659b专利(过渡金属单原子纳米酶及其制备方法和用途)，当将其所得ir单原子纳米酶置于不含h2o2的待测液体中，由于其同时具有oxd和pod活性(参见a library of ros-catalytic metalloenzyme mimics with atomic metal centers.adv.mater.,2021,34,2200255.)，因此也会变成蓝色；而将本发明实施例1所得仿酶纳米材料置于相同的不含h2o2的待测液体中检测时，由于本发明纳米材料只有pod活性，因此其不产生蓝色；可见，本发明所得仿酶纳米材料能够用于h2o2的精准检测。
[0091]
试验例5 ir
ncs
@ti-mof用于l-半胱氨酸的比色检测：
[0092]
1)检测方法：
[0093]
将tmb(10mg ml-1
，24μl)、h2o2(0.1m，25μl)和不同浓度的l-半胱氨酸添加到缓冲液(100mm，ph4.5)中；用缓冲液将混合物的最终体积调节至2ml；然后将ir
ncs
@ti-mof(10mg ml-1
，10μl)加入反应溶液中。孵育10分钟后，将200μl反应溶液添加到96孔板中，并在微孔板读取器中记录652nm处的吸光度。为了研究材料对l-半胱氨酸的底物选择性，选择甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、丝氨酸和谷氨酸的水溶液(5mm)作为干扰物质。
[0094]
2)检测结果：
[0095]
图17a显示，oxtmb的吸光度随着l-半胱氨酸浓度在0至1000μm范围内逐渐降低，揭示了浓度依赖性抑制规律。吸光度和l-半胱氨酸浓度之间的线性关系如图17b所示。lod值和检测范围分别为3.41μm和0～50μm，相对标准偏差为1.5％，优于目前报道的pod模拟纳米材料(图17c)，验证了ir
ncs
@ti-mof优异的检测能力。此外，本发明还验证了ir
ncs
@ti-mof对l-半胱氨酸检测的特异性，当l-半胱氨酸被甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、丝氨酸和谷氨酸取代时，oxtmb的吸光度(在652nm处)显示出与对照组相似的趋势，验证了ir
ncs
@ti-mof对l-半胱氨酸的比色检测具有良好的选择性(图17d)。
[0096]
试验例6 ir
ncs
@ti-mof用于用于葡萄糖的比色检测：
[0097]
1)检测方法：
[0098]
通过结合gox和pod模拟酶进行葡萄糖级联传感。将gox(4mgml-1
，25μl)和不同葡萄糖浓度加入1.9ml乙酸钠-乙酸缓冲液(0.1m，ph 4.5)中，然后在37℃下孵育10分钟。之后，将ir
ncs
@ti-mof(10mg ml-1，20μl)和tmb(10mg ml-1
，24μl)加入混合溶液中并孵育20分钟；为了研究葡萄糖的底物选择性，选择nacl、kcl、蔗糖、麦芽糖、乳糖和谷胱甘肽水溶液(5mm)作为干扰物质。
[0099]
2)检测结果：
[0100]
图18显示吸光度对不同葡萄糖浓度的依赖性，显示出正相关，证实了该方法检测葡萄糖的高灵敏度。在0-600μm范围内，葡萄糖的低检测限为20μm(图18b)，这也低于目前报道的pod模拟纳米材料(图18c)。类似地，当选择nacl、kcl、蔗糖、麦芽糖、乳糖和谷胱甘肽作为干扰物质时，oxtmb的吸光度显示出与对照相似的趋势，验证了ir
ncs
@ti-mof对于葡萄糖检测具有良好的选择性(图18d)。
[0101]
实施例2：
[0102]
mn-mof的合成：mn-mof通过溶剂热法合成的，具体方法为：将含有192mgmn(no3)2·
4h2o的25ml乙醇与含有87.5mg的均三苯甲酸的25ml乙醇混合；然后将混合物超声处理约30min，并在160℃的高压釜中进一步水热处理12h；然后用乙醇洗涤沉淀物，并在真空下干燥。
[0103]
仿酶纳米材料ir
ncs
@mn-mof的合成：将500mgmn-mof分散在具有40ml乙醇的烧瓶中，连续超声处理10min；然后将20mlircl3·
xh2o水溶液(浓度为10mgml-1
)倒入上述溶液中；超声处理10min后，将混合物转移到100ml聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在150℃下反应12h；收集沉淀物并用h2o和乙醇溶液洗涤至少3次，然后在60℃的真空下干燥过夜制得ir
ncs
@mn-mof。结果发现，所得ir
ncs
@mn-mof仅有pod活性而没有oxd活性。
[0104]
综上可知，本发明所得仿酶纳米材料能够替代天然酶用于生物标志物的高效和选择性比色检测；所得仿酶纳米材料ir
ncs
@ti-mof显示出优异和独特的pod模拟活性，这主要
源于ti-mof中ir
ncs-n/o配位和ir团簇的独特酶性质，因此使所得仿酶纳米材料显示出优异的pod检测活性和良好的底物选择性。系统的比色测试表明基于ir
ncs
@ti-mof的纳米反应器显示出对多种h2o2相关生物标志物的高效的诊断活性和底物选择性，其检测限非常低：h2o2在0～900μm范围内为14.12μm，l-半胱氨酸在0～50μm的范围内为3.41μm；葡萄糖在0～600μm内为20.0μm。同时，ti-mof结构的良好稳定性也使纳米反应器能够在苛刻条件下高效工作。

技术特征：
1.一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，其特征在于，所述仿酶材料是将铱纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架上制得。2.根据权利要求1所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，其特征在于，所述负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料具有过氧化物酶活性，没有氧化酶活性。3.根据权利要求1或2所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，其特征在于，所述金属有机框架选自：ti-mof、fe-mof、mn-mof、co-mof或cu-mof。4.根据权利要求1～3任一项所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，其特征在于，所述铱纳米团簇的粒径大小为2～50nm。5.权利要求1～4任一项所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将铱的盐溶液和金属有机框架的分散液混匀，于20～150℃反应5～48小时；然后收集沉淀并经洗涤干燥即得所述仿酶纳米材料。6.根据权利要求5所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料的制备方法，其特征在于，所述铱的盐溶液中铱盐和金属有机框架的质量比为：5～100：200；进一步，所述铱的盐溶液中的盐包括：铱的氯化盐、硫酸盐、硝酸盐或乙酰丙酮盐；进一步，所述铱的盐溶液中的盐选自：氯化铱、乙酰丙酮铱、氯铱酸水合物、醋酸铱或氯铱酸钠六水合物。7.权利要求1～4任一项所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料在h2o2、l-半胱氨酸、葡萄糖、肿瘤、病毒、血红蛋白、妊娠或酒精的精准比色检测中的用途。8.一种过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖检测传感器，其特征在于，所述传感器的活性组分为权利要求1～4任一项所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料。9.一种过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖的检测方法，其特征在于，所述检测方法为：利用权利要求1～4任一项所述的一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料的过氧化物酶活性催化目标物，通过比色法检测目标物的浓度，所述目标物为过氧化氢、l-半胱氨酸或葡萄糖。10.一种提高铱活性位点过氧化物酶活性的方法，其特征在于，所述方法为：将铱纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架上。

技术总结
本发明属于纳米材料、生物催化及分析检测技术领域，具体涉及一种负载铱纳米团簇的金属有机框架纳米复合材料及其制备和应用。本发明提供一种负载铱纳米团簇的金属有机框架仿酶材料，所述仿酶材料是将铱纳米团簇均匀稳定地锚定在金属有机框架上制得。本发明将Ir纳米团簇均匀稳定地锚定在有机金属骨架上制得了一种新型的仿酶纳米材料，其能够作为POD模拟纳米反应器，替代天然酶用于多种生物标志物的高效和选择性比色检测。效和选择性比色检测。效和选择性比色检测。


技术研发人员：李邻 穆盛东 程冲 何超 马朗 白明茹 刘习奎 李爽 罗祥林
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2022.11.27
技术公布日：2023/10/8