补体C3抗原结合蛋白的制作方法

补体c3抗原结合蛋白
发明领域
1.本发明涉及靶向补体c3的抗原结合蛋白及治疗补体c3介导的疾病的方法。
2.发明背景
3.在治疗某些眼部疾病及病症中的主要挑战是将治疗性分子递送至视网膜深层。递送受许多因素阻碍，包括眼睛内的许多物理边界。这些边界包括角膜及结膜上皮、血液-房水障壁(bab)及血液-视网膜障壁(brb)，诸如毛细管内皮细胞(内部brb)及视网膜色素上皮细胞(rpe细胞，外部brb)(参见例如jiang等人,int j ophthalmol.2018；11(6):1038-1044)。对视网膜进行的递送尤其具有重要性的眼部疾病为补体介导的疾病，诸如地图状萎缩(ga)。
4.地图状萎缩(ga)为年龄相关的黄斑变性(amd)的晚期形式，其特征在于黄斑中的视网膜色素上皮细胞及光感受器受损。一旦ga涉及中央窝，则发生不可逆的视力损失。甚至在视力受影响之前，患有ga的早期阶段的患者通常经历视觉功能缺陷。
5.尚未完全知晓地图状萎缩的潜在病理生理学；然而，认为补体活性失调为一种促成因素。已证实与对照物相比，ga患者的玻璃体样品、布鲁赫膜(bruch’s membrane)及脉络膜的其他部分中的若干补体活化产物(包括c3a、c5a、c5b-9及补体因子h(cfh))的水平升高。此外，已报导，在ga中，补体抑制剂(如cd59，一种攻膜复合物(mac)形成的膜结合抑制剂)及膜辅因子蛋白质(mcp，一种对补体因子i(cfi)具有辅因子活性的膜结合补体调节剂)的水平降低。
6.目前，尚无经批准的用于ga的治疗。已研究多种以补体途径为目标的研究性方法，但皆未获批准或被证实有效。此类方法的一些实例包括依库丽单抗(eculizumab)/soliris(alexion)、lfg-316(novartis/morphosys)、arc-1905(ophthotech)、pot-4(al-78898a；alcon)及兰帕珠单抗(lampalizumab)(fcfd45142)。
7.最近，apl-2ii期临床试验(临床试验nct02503332，“地图状萎缩患者中的apl-2疗法的研究(filly”))的结果进一步暗示ga的发病机制中的补体途径且证实经由补体抑制来减少ga恶化的积极治疗作用。这些结果还表明，以c3(其为所有补体途径的汇聚点；参见图1)为中心的补体级联的apl-2抑制可具有比引起补体途径的部分抑制的抑制剂更有效地治疗ga的潜力。然而，通过apl-2实现的ga中病变生长的减少仍是少量的。apl-2具有可能限制其有效性的特征。apl-2，一种环状十三肽坎普他汀(compstatin)(补体组分c3的抑制剂)的聚乙二醇化衍生物，具有350kda的较大分子量当量及约7.8nm的流体力学半径，使得其难以深入地穿透至视网膜中。可能由于3.5mm的低浓度，apl-2仅具有1个月的有效期。apl-2也是聚乙二醇化分子，由此增加其黏度且可能使其难以注射至眼睛中。因此，需要更有效地减少ga恶化。
8.ga治疗中的一个主要挑战为所观察到的在视网膜较深层中发生的补体活性失调。我们假设可能需要对疾病相关视网膜组织(即，视网膜色素上皮细胞(rpe)、布鲁赫膜及脉络膜的其他部分)的更好穿透性以实现更大程度地减少ga中的病变生长。为此，小抗体片段与其他生物制剂及抗体相比具有若干优点。小抗体形式可实现：1)对相关视网膜组织的更
好的眼内穿透性；及2)以每mg或ml计，经由玻璃体内注射递送更多的药物。
9.发明概述
10.本发明提供对补体c3具有特异性的抗原结合蛋白。
11.在一个方面中，本发明提供结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段，其中该抗原结合蛋白或其片段能够抑制补体活化途径，包括经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)。
12.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。
13.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3上的表位，其中此类结合阻止c3转化酶的形成。
14.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够与一或多种抗原结合蛋白(包括m0122、m0123、m0124、m0228及m0251)竞争。
15.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含单链可变片段(scfv)、fab片段、fab’片段、fv片段、双功能抗体、小抗体模拟物或单域抗体，诸如sdab、sdfv、纳米抗体、v-nar或vhh。在优选的实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含scfv或vhh。
16.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含与由以下组成的群中的序列具有至少80％同一性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。
17.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含与由以下组成的群中的序列具有至少80％同一性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。
18.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含可变重链(vh)及可变轻链(vl)，其中该vh包含选自由seq id no:1、4、7、13及19组成的组的cdr-h1序列；选自由seq id no:2、5、8、14及20组成的组的cdr-h2序列；选自由seq id no:3、6、9、15及21组成的组的cdr-h3序列；且其中该vl包含选自由seq id no:10、16及22组成的组的cdr-l1序列；选自由seq id no:11、17及23组成的组的cdr-l2序列及选自由seq id no:12、18及24组成的组的cdr-l3序列。
19.在某些实施方案中，该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％相似性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列至少80％相似性。
20.在某些实施方案中，该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％同一性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列具有至少80％相似性。
21.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:7的cdr-h1序列、seq id no:8的cdr-h2序列及seq id no:9的cdr-h3序列；且其中该vl包含seq id no:10的cdr-l1序列、seq id no:11的cdr-l2序列及seq id no:12的cdr-l3序列。
22.在某些实施方案中，该vh包含seq id no:27的氨基酸序列且该vl包含seq id no:28的氨基酸序列。
23.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:13的cdr-h1序列、seq id no:14的cdr-h2序列及seq id no:15的cdr-h3序列；且其中该
vl包含seq id no:16的cdr-l1序列、seq id no:17的cdr-l2序列及seq id no:18的cdr-l3序列。
24.在某些实施方案中，该vh包含seq id no:29的氨基酸序列且该vl包含seq id no:30的氨基酸序列。
25.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:19的cdr-h1序列、seq id no:20的cdr-h2序列及seq id no:21的cdr-h3序列；且其中该vl包含seq id no:22的cdr-l1序列、seq id no:23的cdr-l2序列及seq id no:24的cdr-l3序列。
26.在某些实施方案中，该vh包含seq id no:31的氨基酸序列且该vl包含seq id no:32的氨基酸序列。
27.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含vhh域，其中该vhh域包含seq id no:1的cdr-h1序列、seq id no:2的cdr-h2序列及seq id no:3的cdr-h3序列。
28.在某些实施方案中，该vhh域包含seq id no:25的氨基酸序列。
29.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含vhh域，其中该vhh域包含seq id no:4的cdr-h1序列、seq id no:5的cdr-h2序列及seq id no:6的cdr-h3序列。
30.在某些实施方案中，该vhh域包含seq id no:26的氨基酸序列。
31.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3及c3b的结合亲和力为至少约10-8
m。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3及c3b的结合亲和力为约10-9
m至约10-14
m。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3及c3b的结合亲和力为约10-10
m至约10-12
m。在某些实施方案中，抗原结合蛋白或其片段对c3及c3b具有大致等效的结合亲和力。在某些实施方案中，对c3的结合亲和力在对c3b的结合亲和力的十分的一以内。
32.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力为约10-4m或更弱。在某些实施方案中，与对c3及c3b的结合亲和力相比，该抗原结合蛋白或其片段对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力较弱。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b不具有结合亲和力。
33.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制cp、lp及ap补体途径的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
34.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够等效或大致等效地抑制cp、lp及ap补体途径的活性。在某些实施方案中，抑制cp、lp及ap补体途径的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
35.在某些实施方案中，通过与在不存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的红细胞溶血水平相比，测量在存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的红细胞溶血水平来测定cp、lp及ap补体途径的活性。
36.在某些实施方案中，通过与在不存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的攻膜复合物(mac)形成相比，测量在存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的mac形成来测定cp、lp及ap补体途径的活性。
37.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制c3转化酶的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
38.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制c3转化酶扩增环。
39.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够穿透布鲁赫膜。
40.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制脉络膜c3活性。
41.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约60kda或更低。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约20kda至约30kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约10kda至约20kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约25kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约15kda。
42.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段与食蟹猕猴(cynomolgus monkey)c3具有交叉反应性。
43.在一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含上文所描述的抗原结合蛋白或其片段及药学上可接受的载剂。因此，一个方面是本发明的结合蛋白质用于制备用于治疗个体中的补体c3介导的疾病或病症的药物组合物的用途。
44.在某些实施方案中，药物组合物具有低黏度。
45.在某些实施方案中，该黏度在约1cp至约50cp之间。在某些实施方案中，黏度小于或等于约20cp。
46.在一个方面中，本发明提供编码上文所描述的抗原结合蛋白或其片段的分离的核酸分子。
47.在另一方面中，本发明提供包含上文所描述的核酸分子的表达载体。
48.在另一方面中，本发明提供包含上文所描述的表达载体的宿主细胞。
49.在另一方面中，提供用于制造如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段的方法，其包括
50.i)在允许本文中所描述的蛋白质的表达的条件下培养如上文所描述的宿主细胞；及
51.ii)回收该蛋白质；及任选地
52.iii)进一步纯化及/或修饰及/或配制该蛋白质。
53.在一个方面中，本发明提供用于治疗个体中的补体c3介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的个体施用上文所描述的抗原结合蛋白或其片段。因此，本发明还提供如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段，其供在治疗补体c3介导的疾病或病症的方法中使用。在某些实施方案中，经由局部、结膜下、玻璃体内、眼球后及/或前房内施用来施用该抗原结合蛋白或其片段。
54.在某些实施方案中，补体c3介导的疾病或病症选自由以下组成的组：年龄相关的黄斑变性、地图状萎缩、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、自体免疫葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎、类风湿性关节炎、牛皮癣及动脉粥样硬化。
55.在一个方面中，本发明提供用于抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)的活性的方法，该方法包括使补体c3与结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段接触。因此，本发明提供如本文中所描述的抗原结合蛋白或其片段，其供在通过抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)的活性来治疗补体c3介导的疾病或病症的方法中使用。本发明还提供如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段，其供通过抑制脉络
膜局部补体c3的活性来治疗补体c3介导的疾病或病症的方法中使用。
56.在一个方面中，本发明提供用于抑制脉络膜局部补体c3的活性的方法，该方法包括眼内施用结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段。
57.在本文中所描述的方法的某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。
58.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3上的表位，其中此类结合阻止c3转化酶的形成。
59.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够与一或多种抗原结合蛋白(包括m0122、m0123、m0124、m0228及m0251)竞争。
60.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含单链可变片段(scfv)、fab片段或vhh。
61.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含与由以下组成的组中的序列具有至少80％相似性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。
62.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含与由以下组成的组中的序列具有至少80％同一性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。
63.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段包含可变重链(vh)及可变轻链(vl)，其中该vh包含选自由seq id no:1、4、7、13及19组成的组的cdr-h1序列；选自由seq id no:2、5、8、14及20组成的组的cdr-h2序列；选自由seq id no:3、6、9、15及21组成的组的cdr-h3序列；且其中该vl包含选自由seq id no:10、16及22组成的组的cdr-l1序列；选自由seq id no:11、17及23组成的组的cdr-l2序列及选自由seq id no:12、18及24组成的组的cdr-l3序列。
64.在某些实施方案中，该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％相似性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列至少80％相似性。
65.在某些实施方案中，该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％同一性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列具有至少80％同一性。
66.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够穿透布鲁赫膜。
67.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制脉络膜c3活性。
68.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约60kda或更低，诸如约50kda或更低、约40kda或更低、约35kda或更低、约30kda或更低、约25kda或更低、约20kda或更低、约15kda或更低。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约20kda至约30kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约10kda至约20kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约25kda。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段的分子量为约15kda。
69.在一个方面中，本发明提供用于检测生物样品中的c3及c3b中的一或两者的方法，其包括
70.(a)使样品与至少一种如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段接触；
71.(b)允许样品中的c3及c3b中的一或两者与抗原结合蛋白或其片段之间形成复合物；及
72.(c)检测该抗原结合蛋白或其片段。在优选的实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。
73.在一个实施例中，通过可检测信号来检测抗原结合蛋白或其片段。
74.在一个实施例中，通过elisa、免疫细胞化学(icc)、免疫组织化学(ihc)、蛋白质印记(western blotting)及/或流式细胞术来检测抗原结合蛋白或其片段。
75.生物样品可为组织样品，例如人受试者的视网膜组织，诸如固定组织样品。固定组织样品可为福尔马林(formalin)固定及石蜡包埋的组织样品。
76.在一个方面中，提供用于检测c3的试剂盒，其包含如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段及使用说明书。
附图说明
77.将结合附图由说明性实施方案的以下详细说明更全面地理解本发明的前述及其他特征及优点。在申请且支付必要费用后，专利局将提供具有彩色图式的本专利或专利申请出版物的副本。
78.图1描绘三种补体途径：经典(cp)、凝集素(lp)及替代(ap)途径，其在c3处汇聚。
79.图2描绘用于产生抗c3抗体库的方法。
80.图3a-图3b描绘elisa测定法，其确认兔及美洲驼中的针对c3的极佳免疫反应。图3a描绘用于测试自人血浆分离的c3蛋白质的elisa测定法。图3b描绘elisa测定法，其用于测试注射有图3a中所示的经分离的人c3的兔(上部小图)及美洲驼(下部小图)的血清中是否存在抗c3抗体。
81.图4a描绘抗c3抗体库的概述且图4b展示cdr-h3氨基酸长度多样性。
82.图5描绘用于筛选抗c3抗体的方法。
83.图6描绘针对抑制人血清中的所有三种补体途径的能力进行的对靶向c3的候选抗体的筛选。各抗体以2μm的浓度使用。
84.图7a-图7d说明抑制所有三种补体途径的四种抗c3抗体识别c3上的三种不同表位。图7a描绘以下竞争测定法，其证实m0122与其他3种抗c3抗体中的每一者之间不存在竞争。图7b描绘以下竞争测定法，其证实m0124与其他3种抗c3抗体中的每一者之间不存在竞争。图7c描绘竞争测定法，其证实m0228与m0251之间存在竞争，但与m0124及m0122之间不存在竞争。图7d描绘以下竞争测定法，其证实m0123与m0251之间及m0123与m0228之间存在竞争，但与m0124及m0122之间不存在竞争。
85.图8a-图8b描绘m0122、m0124及m0228直接结合于c3及c3b二者。图8a描绘以下elisa测定法，其证明m0122、m0124及m0228直接结合于c3。图8b描绘以下elisa测定法，其证明m0122、m0124及m0228直接结合于c3b。
86.图9a-图9b描绘m0122、m0124及m0228有效抑制经典及替代途径。图9a描绘m0122、m0124及m0228有效抑制经典途径。图9b描绘m0122、m0124及m0228有效抑制替代途径。
87.图10描绘m0122、m0124及m0228的亲和力参数。
88.图11描绘视网膜及脉络膜(包括布鲁赫膜)的解剖结构的示意图。本发明的抗
c3scfv抗体描绘为能够穿透布鲁赫膜且更深地进入脉络膜，而比较性c3结合治疗剂apl-2不能穿透布鲁赫膜。相同原理适用于本发明的其他抗原结合蛋白形式。
89.图12描绘与本发明的scfv相比的所示的补体结合治疗剂的流体动力学半径与穿透性之间的负相关性。
90.图13a及图13b描绘scfv与apl-2替代物的在穿透布鲁赫膜方面的比较。图13a展示碘化钡染色(peg)，图13b展示考马斯染色(coomassie staining)(蛋白质)。apl2-替代物包含40kda线性peg上的一个apl-1部分。sc-样品室，dc-扩散物室，lc-内参考物(sc中的初始浓度)。
91.图14a-图14c描绘m0122、m0124及m0251有效抑制食蟹猕猴血清中的经典、替代及凝集素途径。图14a描绘m0122、m0124及m0251有效抑制所有三种途径。各抗体以2μm的浓度使用。图14b描绘m0122、m0124及m0251有效抑制经典途径。图14c描绘m0122、m0124及m0251有效抑制替代途径。
92.图15a-图15b描述m0122、m0124及m0251结合于食蟹猕猴c3。图15a描绘m0122、m0124。图15b描绘m0251。
93.图16描述m0122、m0123及m0124有效抑制凝集素途径。
94.发明详述
95.提供对补体c3及补体c3裂解产物c3b具有结合特异性的抗原结合蛋白。还提供用于治疗或预防补体c3介导的疾病及病症的方法。
96.在某些方面中，本文中所描述的抗原结合蛋白能够抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)。本文中所描述的抗原结合蛋白可同时抑制所有三种途径。本文中所描述的抗原结合蛋白可抑制眼睛的脉络膜中的所有三种途径。
97.通常，与本文中所描述的细胞及组织培养物、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交结合使用的命名法是本领域熟知及常用的。除非另外指示，否则本文中所提供的方法及技术是通常根据本领域熟知的常规方法且如本说明书通篇所引用及论述的各种一般及更特定文献中所描述来进行。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书如本领域通常所实现或如本文中所描述来进行的。与本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及药物及药物化学结合使用的命名法以及其实验室程序及技术是本领域熟知且常用的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送以及患者治疗。
98.除非本文中另外定义，否则本文中所使用的科学及技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。如果发生任何潜在分岐，则本文中所提供的定义优先于任何词典或外部定义。除非另外为情形所需，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则使用“或”意指“及/或”。术语“包括(including)”以及其他形式(诸如“包括(includes)”及“包括(included)”)的使用不具有限制性。
99.为了使本发明可更易于理解，首先对某些术语进行了定义。
100.抗原结合蛋白
101.如本文中所使用，术语“抗体”或“抗原结合蛋白”是指与抗原或表位特异性结合或发生免疫性反应的免疫球蛋白分子，且包括多克隆及单克隆抗体以及功能性抗体片段，包括但不限于片段抗原结合(fab)片段、f(ab’)2片段、fab’片段、fv片段、重组igg(rigg)片
段、单链可变片段(scfv)及单域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米抗体、vhh)片段。术语“抗体”包括免疫球蛋白的经基因工程改造或以其他方式修饰的形式，诸如细胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体、异缀合抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、串联二-scfv、串联三-scfv)及其类似物。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。如本文中所使用的术语“抗体片段”包括经设计以选择性地结合抗原的人工蛋白质，即，抗体模拟物。通常，将一或多个cdr移植至非ig骨架，由此模拟来自亲本抗体的cdr构型。此类抗体模拟物的非限制性实例包括波动调节的亲和蛋白质(flap)、单功能抗体及亲和体。抗体模拟物可包含一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文中所描述的cdr。
102.如本文中所使用，“fab片段”为抗体片段，其包含有包含轻链(cl)的可变轻链(vl)域及恒定域的轻链片段以及重链的可变重链(vh)域及第一恒定域(ch1)。fab片段通常具有约50kda的分子量及约3.0nm的流体力学半径。
103.如本文中所使用，“单链可变片段”(scfv)为包含连接至轻链可变域(vl)的重链可变域(vh)的抗原结合蛋白。scfv的vh及vl域经由本领域认可的任何适当的接头连接。此类接头包括但不限于重复的ggggs氨基酸序列或其变体。scfv通常不含抗体恒定域区域，但本发明的scfv可连接或附接至抗体恒定域区域(例如，抗体fc域)以改变scfv的各种特性，包括但不限于增加的血清或组织半衰期。scfv通常具有约25kda的分子量及约2.5nm的流体力学半径。
104.如本文中所使用，“vhh”、“纳米抗体”或“仅重链抗体”为包含衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼的骆驼科(camelidae family)物种的单一重链可变域的抗原结合蛋白。vhh的分子量通常为约15kda。
105.如本文中所使用，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区的非相邻氨基酸序列，其提供抗原特异性及结合亲和力。通常，各重链可变区中存在三个cdr(cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)且各轻链可变区中存在三个cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3)。“框架区”及“fr”系本领域已知的且是指重链及轻链的可变区的非cdr部分。通常，各重链可变区中存在四个fr(fr-h1、fr-h2、fr-h3及fr-h4)，且各轻链可变区中存在四个fr(fr-l1、fr-l2、fr-l3及fr-l4)。关于vhh抗体，仅存在三个重链cdr且不存在轻链cdr。
106.既定cdr或fr的确切氨基酸序列边界可容易地使用多种熟知方案中的任一者来确定，包括以下文献中所描述的方案：kabat等人,(1991),“sequences of proteins of immunological interest”,第5版,公共卫生服务(public health service),国立卫生研究院(national institutes of health),bethesda,md(“kabat”编号方案)；al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”编号方案)；maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996),“antibody-antigen interactions:contact analysis and binding site topography”,j.mol.biol.262,732-745.(“contact”编号方案)；lefranc mp等人,“imgt unique numbering for immunoglobulin and t cell receptor variabledomains and ig superfamily v-like domains”,dev comp immunol,2003年1月；27(1):55-77(“imgt”编号方案)；及honegger a及pluckthun a,“yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool”,j mol biol,2001年6月8日；309(3):657-70,(aho编号方案)。
107.既定cdr或fr的边界可取决于用于鉴别的方案而变化。例如，kabat方案基于结构比对，而chothia方案基于结构信息。kabat及chothia方案的编号都基于最大共同抗体区域序列长度，其中在一些抗体中出现由插入字母(例如“30a”)表示的插入及缺失。两种方案在不同位置放置某些插入及缺失(“插入缺失”)，产生不同编号。contact方案基于复合物晶体结构的分析且在多个方面与chothia编号方案类似。
108.本文中所提供的抗体的变体可由在构架及/或cdr中引入缺失、取代、添加及/或修饰而产生。接着，可使用本文中所描述的方法测试抗体变体的所需功能。可对抗原结合蛋白或其片段进行缺失、取代、添加、修饰及插入的任何组合，前提是所产生的变体具有可使用适当方法筛选的所需特征。
109.如本文中所使用，“保守性取代”是指保持亲本抗体的功能性质的修饰。例如，保守性氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有类似性质的氨基酸残基置换的取代。例如，由缬氨酸(v)取代丙氨酸(a)；由赖氨酸(k)取代精氨酸(r)；由谷氨酰胺(q)取代天冬酰胺(n)；由谷氨酸(e)取代天冬氨酸(d)；由丝氨酸(s)取代半胱氨酸(c)；由天冬氨酸(d)取代麸氨酸(e)；由丙氨酸(a)取代甘氨酸(g)；由精氨酸(r)或赖氨酸(k)取代组氨酸(h)；由亮氨酸(l)取代异亮氨酸(i)；由亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)；由酪氨酸(y)取代苯丙氨酸(f)；由苏氨酸(t)取代丝氨酸(s)；由酪氨酸(y)取代色氨酸(w)；由色氨酸(w)取代苯丙氨酸(f)；及/或由亮氨酸(l)取代缬氨酸(v)，且反之亦然。
110.因此，除非另外说明，否则特定抗体或其区域(诸如其可变区)的“cdr”或“互补决定区”或个别特定cdr(例如cdr-h1、cdr-h2”)应理解为涵盖任何已知方案所定义的互补决定区(或特定互补决定区)。类似地，除非另外说明，否则特定抗体或其区域(诸如其可变区)的“fr”或“框架区”或个别指定fr(例如“fr-h1”、“fr-h2”)应理解为涵盖任何已知方案所定义的框架区(或特定框架区)。在一些情况下，指定用于鉴别特定cdr或fr的方案，诸如通过kabat、chothia、contact、imgt或aho方法所定义的cdr。在其他情况下，提供cdr或fr的特定氨基酸序列。cdr及fr编号进一步描述于kabat等人,(1991),“sequences of proteins of immunological interest”,第5版,公共卫生局,国立卫生研究院,bethesda,md(“kabat”编号方案)；al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”编号方案)；maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996),“antibody-antigen interactions:contact analysis and binding site topography”,j.mol.biol.262,732-745.(“contact”编号方案)；lefranc mp等人,“imgt unique numbering for immunoglobulin and t cell receptor variabledomains and ig superfamily v-like domains”,dev comp immunol,2003年1月；27(1):55-77(“imgt”编号方案)；及honegger a及pluckthun a,“yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool”,j mol biol,2001年6月8日；309(3):657-70,(aho编号方案)。
111.术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换地用于指抗体分子干扰抗体分子(例如，本文中所描述的抗原结合蛋白)与靶标(例如，人c3及/或c3b)的结合的能力。对结合的干扰可为直接或间接的(例如，经由抗原结合分子或靶标的变构调节)。可使用竞争结合测定法(例如facs测定法、elisa或biacore测定法)测定抗原结合分子能够干扰另一抗原结合分子与靶标的结合的程度且因此其是否可被称为竞争。在一些实施方案中，竞争结合测定法为定量竞争测定法。在一些实施方案中，当在竞争结合测定法(例如，本文中所描述的竞
争测定法)中第一抗体分子与靶标的结合减少10％或更多，例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多时，称为第一抗原结合分子与第二抗原结合分子竞争结合于靶标。
112.如本文中所使用，术语“亲和力”是指抗体的抗原结合位点与其所结合的表位之间的相互作用的强度。如本领域技术人员易于理解的，抗体或抗原结合蛋白亲和力可报导为摩尔浓度(m)形式的解离常数(kd)。本发明的抗体的kd值可在10-5
至10-12
m范围内。高亲和力抗体的kd值为10-9
m(1纳摩尔，nm)及更低。例如，高亲和力抗体的kd值可在约1nm至约0.01nm范围内。高亲和力抗体的kd值可为约1nm、约0.9nm、约0.8nm、约0.7nm、约0.6nm、约0.5nm、约0.4nm、约0.3nm、约0.2nm或约0.1nm。极其高亲和力抗体的kd值为10-12
m(1皮摩尔，pm)及更低。弱或低亲和力抗体的kd可在10-1
至10-4
m范围内。低亲和力抗体的kd值可为10-4
及更高，诸如10-4
m、10-3
m、10-2
m或10-1
m。
113.在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白对c3及c3b的结合亲和力为约10-8
m至约10-14
m。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白对c3及c3b的结合亲和力为约10-10
m至约10-12
m。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白对c3及c3b的结合亲和力为至少约10-8
m、至少约10-9
m、至少约10-10
m、至少约10-11
m或至少约10-12
m。
114.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3及c3b具有大致等效的结合亲和力。例如但非限制性，该抗原结合蛋白或其片段对c3的结合亲和力可为约10-10
m且对c3b的结合亲和力可为约10-10
m。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3的结合亲和力为约10-11
m且对c3b的结合亲和力可为约10-11
m。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3的结合亲和力为约10-12
m且对c3b的结合亲和力可为约10-12
m。
115.在某些实施方案中，对c3的结合亲和力在对c3b的结合亲和力的十分的一以内。例如但非限制性，该抗原结合蛋白或其片段对c3的结合亲和力可为约10-10
m且对c3b的结合亲和力可为约10-11
m。在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段对c3的结合亲和力为约10-11
m且对c3b的结合亲和力为约10-12
m。
116.在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段与食蟹猕猴c3具有交叉反应性。食蟹猕猴(macaca fascicularis)c3与人类、c3具有95.1％同一性且交叉反应性允许在相关动物模型中进行本发明的抗原结合蛋白的临床前及毒理学测试。
117.为了避免疑问且除非另有指示，否则如本文中所使用的c3是指uniprot p01024的人类补体组分3及编码该蛋白质的核酸序列。c3b衍生自天然c3且为由c3的裂解形成的两个成分中的较大者。
118.在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为单价的且以约200nm或更低的kd结合于人c3及c3b，如通过生物层干涉术(bli)所测量。在某些实施方案中，kd为约200pm或更低，诸如约100pm、约10pm、约1pm或约0.1pm。
119.抗原结合域结合于特异性抗原决定簇的能力可经由酶联结免疫吸附分析法(elisa)或本领域技术人员熟知的其他技术(例如，表面电子共振(spr)技术(用biacore仪器分析)(liljeblad等人,glyco j 17,323-329(2000))及传统结合测定法(heeley,endocr res 28,217-229(2002))测量。
120.抗补体c3抗原结合蛋白
121.在一个方面中，本发明提供对补体c3蛋白具有结合特异性的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，抗c3抗原结合蛋白为scfv、fab片段或vhh。
122.示例性抗c3抗原结合蛋白cdr记载于以下表1中。示例性抗c3抗原结合蛋白可变重链及可变轻链域记载于以下表2中。以下叙述的示例性抗c3抗原结合蛋白是经由用自人血浆分离的人c3蛋白免疫接种兔及美洲驼而产生。示例性m0122、m0123及m0124的vh及vl域衍生自用人c3蛋白免疫接种的兔且为野生型兔序列。m0228及m0251的示例性vhh域衍生自用人c3蛋白免疫接种的美洲驼且为野生型美洲驼序列。
123.表1-抗c3抗原结合蛋白cdr序列
[0124][0125][0126]
表2-抗c3抗原结合蛋白vh/vl序列
[0127][0128][0129]
在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白与表1或表2中的任何序列具有至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至
少约98％、至少约99％或100％序列相似性或同一性。
[0130]
在某些实施方案中，针对抑制一或多种补体途径(经典途径、替代途径及凝集素途径)的能力来选择本发明的抗c3抗原结合蛋白。在某些实施方案中，针对抑制所有三种补体途径(经典途径、替代途径及凝集素途径)的能力来选择本发明的抗c3抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白能够抑制眼睛中的所有三种补体途径。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白能够抑制眼睛的脉络膜区域中的所有三种补体途径。脉络膜区域为在眼睛背部排列的含有血管的层且位于视网膜与巩膜之间。脉络膜区域分为四个层，即哈勒氏层(haller’s layer)、萨特勒氏层(sattler’s layer)、脉络膜毛细管层及布鲁赫膜。布鲁赫膜，也称为玻璃体层，为脉络膜的最内层且与视网膜色素上皮细胞(rpe)相邻。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白能够穿透或扩散穿过布鲁赫膜且进入脉络膜的其他层，诸如但不限于脉络膜毛细管层。
[0131]
视网膜具有可阻止大分子(诸如全长免疫球蛋白)穿透至更深层的实质实体障壁，其可引起治疗作用降低(jackson等人,invest ophthalmol vis sci.2003；44(5):2141-6)。相比之下，较小的抗体衍生物可更深地穿透至视网膜中。具有约60kda或更低的分子量的示例性抗体衍生物为抗体片段，包括但不限于fab、fab'片段、scfab、scfv、fv片段、纳米抗体、vhh、dab、v-nar、sdab、sdfv以及双特异性及二价抗体，诸如单链双功能抗体(scdb)，或dart。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白的分子量为约60kda或更低，例如约55kda、约50kda、约45kda、约40kda、约35kda、约30kda、约25kda、约20kda、约15kda或更低。
[0132]
在某些实施方案中，部分归因于足够低以有助于穿透的大小，本发明的抗c3抗原结合蛋白能够穿透或扩散穿过布鲁赫膜。在某些实施方案中，通过分子量来测量本发明的抗原结合蛋白的大小。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的分子量小于约60kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约20kda至约30kda或约10kda至约20kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约25kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约15kda。在某些实施方案中，通过流体动力半径来测量本发明的抗原结合蛋白的大小。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约3.0nm。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约2.5nm。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约2.0nm。
[0133]
在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白能够与一或多种抗原结合蛋白竞争，包括m0122、m0123、m0124、m0228及m0251。可通过本领域已知的任何测定法测量抗体竞争。在某些实施方案中，在c3结合elisa中，可用标记物(诸如生物素)标记一种抗体且与其他抗c3抗体一起培育。通常，当存在过量的竞争抗原结合蛋白时，其将使如本文中所描述的抗原结合蛋白或其片段与c3及/或c3b的特异性结合降低(即，其交叉阻断结合)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多。在某些实施方案中，在存在竞争抗原结合蛋白的情况下，本文中所描述的抗原结合蛋白或其片段的结合降低至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
[0134]
补体c3为由13个不同域构成的大蛋白质且分子大小为185千道尔顿。在补体活化期间，c3经历蛋白水解分裂及不同位点处的结构修饰。c3衍生的片段发挥不同效应功能且形成转化酶，该转化酶有助于三种补体途径的扩增环。经典途径及凝集素途径c3转化酶
c4bc2a使全长c3裂解成c3b及过敏毒素c3a。替代途径也产生c3b及c3a，但利用替代途径c3转化酶c3bbb。此外，可在补体途径中产生其他c3降解产物。补体因子i(cfi)为能够将c3b永久性不活化成ic3b的血浆丝氨酸蛋白酶。随后，ic3b由cfi裂解成其他片段(c3dg及c3c)。另一种c3蛋白水解产物c3d结合补体受体2(cr2)且可在b细胞的细胞周期控制中起重要作用。除c3衍生的蛋白质产物以外，补体途径包括但不限于c1、c2、c4、c4b、c4a c5、c5b、c5a、c6、c7、c8、c9、c1q、c1r、c1s、因子b、因子d、因子p、因子h、因子i、cd46(mcp)、cd55(daf)、cd59(mac-ip)、cr1(cd35)、cr2(cd21)、cr3、cr4、c3ar、c5ar1、c5ar2、crig、c4bpα链、c4bpβ链、纤维胶凝蛋白(ficolin)-1、甘露糖结合凝集素(mbl)、mbl相关丝氨酸蛋白酶-1(masp-1)及mbl相关丝氨酸蛋白酶-2(masp-2)。补体途径及各种补体途径组分进一步详细描述于noris等人,semin nephrol.2013；33(6):479-492中。
[0135]
在某些实施方案中，本发明提供能够结合c3及c3b的抗c3抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力弱于对c3及c3b的结合亲和力。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力为约10-4m或更弱。在某些实施方案中，本发明的抗c3抗原结合蛋白对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b不具有结合亲和力。如本文中所使用，“不具有结合亲和力”是指在本领域已知的一或多种结合亲和力测定法(诸如但不限于elisa测定法)中，相对于背景不具有可检测的结合亲和力。
[0136]
在某些实施方案中，该抗原结合蛋白能够结合补体c3上的表位，其中此类结合阻止c3转化酶的形成。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白抑制c3转化酶的活性。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白抑制c3转化酶扩增环。
[0137]
在某些实施方案中，归因于下文中叙述的以下特性，预期本发明的抗c3抗体与其他疗法相比在治疗ga或其他眼部病症方面具有更好的功效及安全性。
[0138]
本发明的抗c3抗体可包括但不限于具有小于约60kda的分子量的scfv及vhh抗体片段。例如，但非限制性，本发明的scfv的分子量可为约25kda且本发明的vhh的分子量可为约15kda，而其他治疗剂可具有较大分子量。基于流体动力半径估算，预期本发明的抗c3抗体具有更好的脉络膜c3抑制作用，因为其可更有效地穿透布鲁赫膜且更有效地进入眼睛的脉络膜。
[0139]
本发明的抗c3抗体的治疗有效持续时间可超过1个月，其与其他治疗剂相比有更长的持续时间。治疗有效持续时间的延长可归因于本发明的抗c3抗体的可高达7mm的摩尔浓度。
[0140]
与其他治疗剂相比，本发明的抗c3抗体可容易地注射至眼睛中。本发明的抗c3抗体不含peg，由此降低其黏度。因此，预期本发明的抗c3抗体的黏度低于其他治疗剂的黏度。黏度降低的溶液，诸如小于或等于20厘泊(cp)的溶液由于背压降低而更易于注射至眼睛中。
[0141]
抗原结合多肽的表达
[0142]
在一个方面中，提供本文中所公开的编码结合多肽(例如，抗原结合蛋白)的多核苷酸。还提供用于制备结合多肽的方法，其包含表达这些多核苷酸。
[0143]
通常将编码本文中所公开的结合多肽的多核苷酸插入表达载体中，以用于引入宿主细胞中，该等宿主细胞可用于产生所需数量的本发明的抗体或其片段。因此，在某些方面
中，本发明提供包含本文中所公开的多核苷酸的表达载体以及包含这些载体及多核苷酸的宿主细胞。
[0144]
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于意指根据本发明用作媒介物的载体，该媒介物用于将所需基因引入细胞中且在细胞中表达该所需基因。如本领域技术人员已知，可容易地自由以下组成的组选择此类载体：质粒、噬菌体、病毒及反转录病毒。通常，与本发明兼容的载体将包含选择标记物、用于促进所需基因的克隆的适当限制位点以及进入真核或原核细胞及/或在真核或原核细胞中复制的能力。
[0145]
大量表达载体系统可用于实现本发明的目的。例如，一类载体利用衍生自动物病毒的dna元件，此类病毒诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(例如，rsv、mmtv、momlv或其类似物)或sv40病毒。其他载体涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，可通过引入一或多个允许选择经转染的宿主细胞的标记物来选择将dna整合至其染色体中的细胞。所述标记物可向营养缺陷型宿主提供原营养，提供杀生物剂抗性(例如，抗生素)或对重金属(诸如铜)的抗性。可选标记基因可直接连接至待表达的dna序列，或通过共转化而引入相同细胞中。mrna的最佳合成还可能需要其他元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、强化子及终止信号。在一些实施方案中，将克隆的可变区基因与如上文所论述的合成的重链及轻链恒定区基因(例如，人类恒定区基因)一起插入表达载体中。
[0146]
在其他实施方案中，可使用多顺反子构建体表达结合多肽。在此类表达系统中，可由单一多顺反子构建体产生多种感兴趣的基因产物，诸如抗体的重链及轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(ires)以在真核宿主细胞中提供相对较高水平的多肽。兼容的ires序列公开于美国专利公开号6,193,980，其以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本技术中所公开的所有多肽。
[0147]
更一般而言，在制备编码抗体或其片段的载体或dna序列后，可将表达载体引入适当的宿主细胞中。即，可将宿主细胞转化。可通过本领域技术人员熟知的各种技术实现将质粒引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于转染(包括电泳及电穿孔)、原生质粒融合、磷酸钙沉淀、用包膜dna进行的细胞融合、显微注射及用完整病毒进行的感染。参见ridgway,a.a.g.“mammalian expression vectors”第24.2章,第470-472页,vectors,rodriguez及denhardt编(butterworths,boston,mass.1988)。可通过电穿孔将质粒引入宿主中。经转化的细胞在适于产生轻链及/或重链的条件下生长，且测定重链及/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、荧光活化细胞分选分析(facs)、免疫组织化学等。
[0148]
如本文中所使用，术语“转化”应以广泛含义使用且是指将外源dna引入受体宿主细胞中，从而改变基因型且因此引起受体细胞的变化。经基因修饰的受体细胞可通过暂时或稳定转化而含有外源序列。例如，可在靶位点或随机位点处将外源序列稳定地整合至受体细胞的基因组序列中。通过基因编辑方法(例如，使用同源重组、转转座子介导的系统、loxp-cre系统、crispr/cas9或talen的方法)修饰的细胞属于本发明的范围内。在某些实施方案中，产生稳定的细胞株以用于产生抗原结合蛋白或其片段。这有利地引起具有均一质量及产率的抗原结合蛋白或其片段的稳定产生。
[0149]
由此，“宿主细胞”是指经载体转化的细胞，此类载体是通过使用重组dna技术及编码至少一种异源基因而构建。在自重组宿主分离多肽的过程的描述中，除非另外明确指定，否则术语“细胞”及“细胞培养物”可互换地用于表示抗体来源。换言之，从“细胞”回收多肽可意指自快速离心完全细胞或含有培养基及悬浮细胞的细胞培养物回收。
[0150]
在一个实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的。本领域技术人员可确定最适用于表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于dg44及duxb11(中国仓鼠卵巢细胞系，dhfr缺陷型)、hela(人子宫颈癌)、cv-1(猴肾脏细胞系)、cos(具有sv40t抗原的cv-1的衍生物)、r1610(中国仓鼠成纤维细胞)、balbc/3t3(小鼠成纤维细胞)、hak(仓鼠肾脏细胞株)、sp2/o(小鼠骨髓瘤)、bfa-1c1bpt(牛内皮细胞)、raji(人淋巴细胞)、293(人肾脏)等。在一个实施方案中，细胞系产生由其表达抗体的改变的糖基化，例如去岩藻糖基化(例如，(crucell)或fut8基因敲除cho细胞系(细胞)(biowa,princeton,n.j.))。宿主细胞系通常可自商业服务，例如美国组织培养物保藏中心(american tissue culture collection)或公开的文献获得。
[0151]
体外制备允许按比例扩大，得到大量所需多肽。用于在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养的技术为本领域已知的且包括均匀悬浮培养物，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定或包埋细胞培养物，例如在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微粒或陶瓷筒上。视要求及/或需要，可通过通常的层析方法(例如，凝胶过滤、离子交换层析、deae-纤维素上的层析及/或(免疫-)亲和层析)纯化多肽溶液。
[0152]
编码本发明中所提供的抗原结合蛋白的基因也可在非哺乳动物细胞(诸如细菌或酵母或昆虫或植物细胞)中表达。在此方面，应理解，也可将各种单细胞非哺乳动物微生物(诸如细菌)，即，能够在培养物中生长或发酵的微生物转化。对转化敏感的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，诸如以下的菌株：大肠杆菌(escherichia coli)或沙门氏菌(salmonella)；芽孢杆菌科(bacillaceae)，诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)；及流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。应进一步理解，当在细菌中表达时，蛋白质可变成包涵体的一部分。蛋白质必须经分离、纯化、随后组装成功能性分子。
[0153]
除原核生物以外，还可使用真核微生物。在真核微生物中，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或常见面包酵母是最常用的，尽管通常还可使用许多其他菌株。对于酵母菌(saccharomyces)中的表达，通常使用例如质粒yrp7(stinchcomb等人,nature,282:39(1979)；kingsman等人,gene,7:141(1979)；tschemper等人,gene,10:157(1980))。此质粒已含有trp1基因，该基因提供用于不具有在色氨酸中生长的能力的突变型酵母菌株(例如atcc编号44076或pep4-1)的选择标记物(jones,genetics 85:12(1977))。由此，作为酵母宿主细胞基因体的特征的trp1损害的存在可提供用于通过在不存在色氨酸的情况下的生长来检测转化的有效环境。
[0154]
因此，在一个方面中，提供用于制造如上文所描述的抗原结合蛋白或其片段的方法，其包含以下步骤：
[0155]
i)在允许本文中所描述的蛋白质的表达的条件下培养宿主细胞；及
[0156]
ii)回收蛋白质；及任选地
[0157]
iii)进一步纯化及/或修饰及/或配制该蛋白质。
[0158]
用于施用抗原结合蛋白的方法
[0159]
本领域技术人员熟知或可容易地确定用于制备及向个体施用抗原结合蛋白(例如，本文中所公开的抗原结合蛋白)的方法。本发明的抗原结合蛋白的施用途径可为口服、肠胃外、吸入、局部或眼内。如本文中所使用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经直肠或经阴道施用。如本文中所使用的术语眼内包括但不限于结膜下、玻璃体内、眼球后或前房内。如本文中所使用的术语局部包括但不限于通过液体或溶液滴眼剂、乳液(例如，水包油乳液)、悬浮液及软膏进行施用。
[0160]
在某些实施方案中，眼内施用本发明的抗原结合蛋白。向眼睛的不同结构(诸如视网膜)递送治疗性化合物是具有挑战性的。该挑战包括但不限于若干限制性眼部障碍、流泪机制(包括以眨眼及流泪的方式移出所递送的化合物)、有限局部注射体积、有限局部生物可用性以及对杂质及污染物的低耐受性(参见例如patel等人,world j pharmacol.2013；2(2):47-64；morrison等人,ther.deliv.2014；5(12):1297-1315)。本发明的抗原结合蛋白可克服这些挑战。本发明的抗原结合蛋白的分子量为约60kda或更小。约60kda或更小的抗原结合蛋白的实例包括但不限于scfv、vhh及fab片段。本发明的抗原结合蛋白相对于全长抗体的较小大小使得在每次注射中能够递送更多的治疗性抗体。这实现向眼睛施用高浓度的抗体。本发明的抗原结合蛋白的较小尺寸也改善其对疾病相关组织，即，眼睛的脉络膜区域的穿透。抗原结合蛋白能够穿透脉络膜区域的一或多个层，包括哈勒氏层、萨特勒氏层、脉络膜毛细管层及布鲁赫膜，由此靶向脉络膜区域的这些层内的补体c3及c3b。
[0161]
在某些实施方案中，通过药物递送装置(诸如脉络膜上药物递送装置或视网膜下药物递送装置)实现眼内施用。脉络膜上施用方案涉及向眼睛的脉络膜上腔施用药物，且通常使用脉络膜上药物递送装置进行，诸如具有微针的微小注射器(参见例如hariprasad,retinal physician；2016；13:20-23；goldstein,2014,retina today 9(5):82-87；其各自以全文引用的方式并入本文中)。可用于在脉络膜上腔中沉积本发明的抗原结合蛋白的脉络膜上药物传递装置包括但不限于由biomedical,inc.制造的脉络膜上药物递送装置(参见例如hariprasad,2016,见上文)。可用于经由脉络膜上腔在视网膜下腔中沉积本发明的抗原结合蛋白的视网膜下药物递送装置包括但不限于由janssen pharmaceuticals,inc.制造的视网膜下药物递送装置(参见例如国际专利申请号wo 2016/040635)。
[0162]
在某些实施方案中，经由玻璃体内途径实现眼内施用。通常通过注射器及27号规格(gauge)至30号规格针进行玻璃体内施用(参见例如jiang等人,见上文)。
[0163]
一种施用形式为用于注射，尤其用于玻璃体内注射的溶液，但所有这些施用形式都明确属于本发明的范围内。通常，适用于注射的药物组合物可包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选为稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在与本文中的教导兼容的其他方法中，可将经修饰的抗体直接递送至有害细胞群体的位点，由此增加患病的组织对治疗剂的暴露。
[0164]
在某些实施方案中，在具有低黏度的溶液中配制本发明的抗原结合蛋白。以厘泊(cp)为单位来测量溶液的黏度。高黏度抗体溶液可能对向眼睛施用本发明的抗原结合蛋白造成挑战。例如，由于高背压，具有高于50cp的黏度的溶液可能难以用细针施用。因此，需要在低黏度溶液中配制本发明的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白
及其药物组合物的黏度为约1cp至约50cp。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白及其药物组合物的黏度小于或等于约20cp、约15cp、约10cp、约5cp、约4cp、约3cp、约2cp或约1cp。关于抗体黏度的其他细节描述于tomar等人,mabs.2016；8(2):216-228及fennell等人,mabs.2013；5(6):882-895中。
[0165]
用于施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液及乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油，及诸如油酸乙酯的可注射有机酯。水性载剂包括水、醇溶液/水性溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水及缓冲介质。在本发明的组合物及方法中，药学上可接受的载剂包括但不限于0.01-0.1m或0.05m磷酸盐缓冲液，或0.8％生理盐水。其他常用的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖(ringer's dextrose)、右旋糖及氯化钠、乳酸化林格氏媒介物(lactated ringer's)、非挥发性油及其类似物。静脉内媒介物包括但不限于流体及营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的补充剂)及其类似物。还可存在防腐剂及其他添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体及其类似物。在某些实施方案中，适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(其中水可溶)或分散液及用于无菌可注射溶液或分散液的即用型制剂的无菌粉末。在此类情况下，组合物必须为无菌的且流动性应达到存在易注射性的程度。其应在制造及储存条件下稳定，且还应保护其免受微生物(诸如细菌及真菌)的污染作用。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
[0166]
可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，来实现防止微生物作用。组合物中还可包括等张剂，例如糖、多元醇或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
[0167]
在任何情况下，可通过在适合的溶剂中并入所需量的活性化合物(例如抗原结合蛋白或其片段)及(视需要)本文中所列举成分的一种或组合，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液是通过将活性化合物并入无菌媒介物中制备，该无菌媒介物含有碱性分散介质及来自以上所列举的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法通常包括真空干燥及冷冻干燥，其产生活性成分加其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。根据本领域已知的方法，处理用于注射的制剂，填充至诸如安瓿、袋、瓶子、注射器或小瓶的容器中，且在无菌条件下密封。
[0168]
用于治疗上述病况的本发明的组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，包括施用方式、目标部位、患者生理状态、患者为人类或动物、所施用的其他药物，及治疗为预防性或治疗性。通常，患者为人类，但亦可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定治疗剂量以使安全性及功效优化。
[0169]
如先前所论述，可施用药学上有效量的本发明的抗原结合蛋白、其免疫反应性片段或重组体用于体内治疗哺乳动物病症。在此方面，应理解，将配制所公开的抗原结合蛋白以促进施用及促进活性剂的稳定性。
[0170]
本发明的药物组合物通常包括药学上可接受、无毒、无菌载剂，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂及其类似物。出于本技术的目的，经修饰的抗原结合蛋白、其免疫反应性
片段或重组体(与或未与治疗剂结合)的药学上有效量必须始终意指足以实现与抗原的有效结合及实现益处(例如，改善疾病或病症的症状或检测物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下，经修饰的结合多肽将通常能够与瘤或免疫反应性细胞上的所选择的免疫反应性抗原相互作用且引起这些细胞的死亡增加。当然，可以单次或多次剂量施用本发明的药物组合物以提供药学上有效量的经修饰的结合多肽。
[0171]
与本发明的范围一致，可根据前述治疗方法向人类或其他动物施用足以产生治疗或预防作用的量的本发明的抗原结合蛋白。可以常规剂型形式向此类人或其他动物施用本发明的抗原结合蛋白，该剂型根据已知技术通过组合本发明的抗体与常规的药学上可接受的载剂或稀释剂而制备。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载剂或稀释剂的形式及特征是通过与其组合的活性成分的量、施用途径及其他熟知变量指示。本领域技术人员还将了解，可证明包含一或多种本发明中所描述的结合多肽的混合物是尤其有效的。
[0172]
可例如通过补体抑制测定法来测定本文中所定义的药物组合物的生物活性，例如但非限制性，用于测定人类血清中的功能性经典、凝集素及替代补体途径活性的酶免疫测定法。在某些实施方案中，可使用补体系统筛选(euro diagnostica ab,sweden)评估本文中所定义的药物组合物的抑制活性。
[0173]
可使用经纯化的补体组分进行用于研究本发明的抗体抑制补体途径的能力的功能测定法，其中在红细胞或人工基质的表面上自该组分重构酶复合物，如okroj等人,plos one.；2012；7(10):e47245中所描述。
[0174]
标准50％溶血性补体(ch50)测定法也为常用的评估化合物抑制经典补体途径的功能活性的能力的方法，如jaskowski等人,clinical and diagnostic laboratory immunology；1999；6(1):137-9中所描述。
[0175]
在某些实施方案中，可通过与在不存在本发明的抗原结合蛋白的情况下的红细胞溶血水平相比，测量在存在本发明的抗原结合蛋白的情况下的红细胞溶血水平来测定cp、lp及ap补体途径的活性。在某些实施方案中，抗体致敏羊红细胞可用于测量由经典途径介导的补体依赖性溶血。在某些实施方案中，抗体致敏兔红细胞可用于测量由替代途径介导的补体依赖性溶血，如tomlinson等人,j immunol.1997；159(11):5606-5609中所描述。
[0176]
在某些实施方案中，可通过与在不存在本发明的抗原结合蛋白的情况下的攻膜复合物(mac)形成相比，测量在存在本发明的抗原结合蛋白的情况下的mac形成来测定cp、lp及ap补体途径的活性。用于人血清中的igm介导的经典补体途径的活化的mac测定法引起经igm包被的elisa盘上的mac的沉积。可通过针对c5b-9的经碱性磷酸盐标记的抗体来检测mac形成。在存在本发明的抗原结合蛋白的情况下，elisa信号以剂量依赖性方式降低。对于测试替代途径，可使用用于人血清中的lps介导的替代补体途径的活化的mac测定法进行经lps包被的elisa盘上的mac的沉积。适当的mac测定法包括但不限于太平洋生物标记物补体攻膜复合物(pacific biomarkers complement membrane attack complex)(sc5b-9)elisa分测定法。
[0177]
如本文中所使用的“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化反应标准，诸如标准眼科反应标准，对使用本发明的药物组合物的疗法的反应。使用本发明的药物组合物的疗法的成效或体内功效是指组合物对其所期待目的的有效性，即，组合物引起其所需作用(即，抑制眼睛中的补体途径)的能力。可通过用于各种眼部疾病的既定标准方法监测体内
功效。监测方法包括但不限于阿姆斯勒方格表测试(amsler grid test)、检眼镜检查(opthtalmoscopy)、眼底显微镜检查(ocular fundus microscopy)、眼部计算机断层扫描及光学同调断层扫描。此外，可使用各种疾病特异性临床化学参数及其他既定标准方法。
[0178]
抗体工程化及优化
[0179]
本发明的抗原结合蛋白可经工程改造或优化。如本文中所使用，“优化(optimized/optimization)”是指用于改善一或多种功能特性的抗原结合蛋白的变化。变化包括但不限于抗原结合蛋白内的一或多个氨基酸的缺失、取代、添加及/或修饰。
[0180]
如本文中所使用，术语“功能特性”是抗原结合蛋白的一种特性，对其的改善(例如，相对于常规抗原结合蛋白)对于本领域技术人员而言是合乎需要及/或有利的，例如，以改善抗原结合蛋白的制造特性或治疗功效。在一个实施方案中，功能特性为稳定性(例如，热稳定性)。在另一实施方案中，功能特性为溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一实施方案中，功能特性为聚集状态。在另一实施方案中，功能特性为蛋白质表达(例如，在原核细胞中)。在另一实施方案中，功能特性为在制造过程中的包涵体溶解之后的再折叠状态。在某些实施方案中，功能特性并非抗原结合亲和力的改善。在另一实施方案中，一或多种功能特性的改善对抗原结合蛋白的结合亲和力不具有实质性影响。
[0181]
在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为scfv且是通过鉴别抗原结合蛋白中的感兴趣的氨基酸位置(例如，通过比较具有至少一种所需特性的scfv序列的数据库(例如，通过质量对照(qc)分析法而选择)与成熟抗体序列的数据库(例如，kabat数据库)而鉴别的氨基酸位置)处的优选的经取代、缺失及/或添加的氨基酸残基而优化。因此，本发明还提供用于选择特定氨基酸残基的“富集/排除”方法。此外，本发明提供用于工程改造抗原结合蛋白(例如，scfv)的方法，其是通过使利用本文中所描述的“功能共识(functional consensus)”方法鉴别的特定框架氨基酸位置突变来进行。在某些实施方案中，通过用使用本文中所描述的“富集/排除”测定方法鉴别为“经富集的”残基的残基取代现有氨基酸残基来使框架氨基酸位置突变。在一个方面中，本发明提供用于鉴别单链抗体(scfv)、具有vh及vl氨基酸序列的scfv中的用于突变的氨基酸位置的方法，该方法包含：a)将scfv vh、vl或vh及vl氨基酸序列输入包含大量抗体vh、vl或vh及vl氨基酸序列的数据库，使得将scfv vh、vl或vh及vl氨基酸序列与数据库中的抗体vh、vl或vh及vl氨基酸序列进行比对；b)将scfv vh或vl氨基酸序列内的氨基酸位置与数据库中的抗体vh或vl氨基酸序列内的相应位置进行比较；c)测定scfv vh或vl氨基酸序列内的氨基酸位置是否由数据库中的抗体vh或vl氨基酸序列内的相应位置处的具有保守性的氨基酸残基占据；及d)当该氨基酸位置未由数据库中的抗体vh或vl氨基酸序列内的相应位置处的具有保守性的氨基酸残基占据时，将scfv vh或vl氨基酸序列内的该氨基酸位置鉴别为用于突变的氨基酸位置。scfv优化进一步详细描述于wo2008110348、wo2009000099、wo2009000098及wo2009155725中，其均以引用的方式并入本文中。
[0182]
人源化：
[0183]
在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可经人源化。如本文中所使用，术语“人源化”是指经修饰以增加其与人类中天然产生的抗体的相似性的非人类供体抗体。如本文中所使用，术语“人源化”是指将非人类供体抗体人源化的过程。可通过将非人类供体抗体的cdr(例如，兔或美洲驼抗体cdr)移植至人类或人源化抗体受体框架区(诸如可溶及稳
定的轻链及/或重链人类抗体框架区)上来实现人源化。用于将cdr移植至人类受体构架中的通用方法已由winter在美国专利号5,225,539中及由queen等人在wo199007861中公开，其以引用的方式并入本文中。适当的受体框架区可呈现优良的功能特性，诸如改善的溶解性及稳定性。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为兔抗体。可将该兔抗体的cdr移植至通用受体架构区域中，诸如wo2009155726中所描述的框架区，其以引用的方式并入本文中。
[0184]
在某些实施方案中，用于非人类抗体的人源化/稳定或人类抗体的稳定的人类构架涉及用λ接合区段置换κ可变轻链域中的κ接合区段，产生具有改善的蛋白质稳定性及降低的聚集倾向的κ-λ嵌合可变轻链域。其还涉及位置aho101处的κ共同残基的突变及由λ共同残基进行的置换，以支持κ-λ嵌合可变轻链域中的λ接合区段的填充，以进一步改善蛋白质稳定性及进一步降低聚集倾向。关于这些人类框架区的其他细节描述于wo2014206561及wo2019057787中，其以引用的方式并入本文中。
[0185]
用于治疗补体c3介导的疾病及病症的方法
[0186]
提供使用本文中所描述的抗原结合蛋白治疗罹患补体c3介导的疾病或病症的个体中的补体c3介导的疾病及病症的方法。
[0187]
在某些实施方案中，补体c3介导的疾病或病症选自由以下组成的组：年龄相关的黄斑变性(amd)、地图状萎缩(ga)、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、自体免疫葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎、类风湿性关节炎、牛皮癣及动脉粥样硬化。在某些实施方案中，c3介导的疾病为amd的一种形式。amd通常分成两种主要类别，干燥amd及潮湿型amd。干燥amd(也称为非渗出性amd)的特征在于黄斑区域中存在玻璃膜疣(黄色沉积物)。潮湿型amd(也称为渗出性amd或新生血管性amd)的特征在于自黄斑下方的脉络膜的异常血管生长。此过程也称为脉络膜新生血管且新的血管可使体液(诸如血液)渗漏至视网膜中及视网膜周围。地图状萎缩(也称为萎缩性amd或晚期干涩型amd)为amd的晚期形式，其可引起进行性及不可逆的视网膜细胞损失。
[0188]
治疗眼部病症(诸如上文所描述的amd)是尤其具有挑战性的。如先前所述，由于若干屏障(包括但不限于血液-视网膜屏障，诸如rpe)而限制对眼睛的治疗剂递送。穿透rpe且进入眼睛的脉络膜的能力将增强药物的治疗潜力。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白能够穿透眼睛的脉络膜区域的rpe及布鲁赫膜，由此靶向脉络膜区域中的补体c3。本发明的抗原结合蛋白的穿透rpe及布鲁赫膜的能力可改善其在治疗补体c3介导的疾病或病症中的治疗潜力。本发明的抗原结合蛋白能够穿透rpe及布鲁赫膜部分归因于其足够小从而有助于穿透的大小。在某些实施方案中，通过分子量来测量本发明的抗原结合蛋白的大小。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的分子量小于约60kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约20kda至约30kda或约10kda至约20kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约25kda。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为约15kda。在某些实施方案中，通过流体动力半径来测量本发明的抗原结合蛋白的大小。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约3.0nm。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约2.5nm。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的流体动力半径小于或等于约2.0nm。
[0189]
在一个方面中，本发明提供用于抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代
途径(ap)的活性的方法，该方法包含使补体c3与结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段接触。本发明的抗原结合蛋白的抑制所有三种补体途径的能力进一步改善其在治疗补体c3介导的疾病或病症中的治疗潜力。不希望受理论约束，通过阻止一种活性途径的疾病促进作用补偿其他不活化途径，抑制所有三种补体途径可改善本发明的抗原结合蛋白的治疗潜力。
[0190]
在某些实施方案中，该抗原结合蛋白或其片段能够大致等效地抑制cp、lp及ap补体途径的活性。例如，但非限制性，该抗原结合蛋白或其片段能够抑制cp途径的活性至少80％，能够抑制lp的活性至少80％，且能够抑制ap的活性至少80％。在某些实施方案中，抑制cp、lp及ap补体途径的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
[0191]
在另一方面中，本发明提供用于抑制脉络膜局部补体c3的活性的方法，其经由眼内施用结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段来进行。眼睛的脉络膜区域中的经活化的补体途径可促进补体c3介导的疾病或病症。因此，本发明的一个目标为提供能够穿透或扩散至脉络膜区域中且靶向补体c3及c3b的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白抑制眼睛的脉络膜区域中的c3转化酶的活性。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白抑制眼睛的脉络膜区域中的c3转化酶扩增环。
[0192]
医疗用途
[0193]
本发明还涉及如本文中所公开的抗原结合蛋白或其片段，其用于治疗个体中的补体c3介导的疾病或病症的方法中。本发明中关于抗原结合蛋白或其片段所描述的所有技术特征都是可适用的。
[0194]
试剂盒
[0195]
本发明还涵盖包含至少一种如本文中所描述的抗原结合蛋白或其片段的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括呈单位剂型形式的含有有效量的该抗原结合蛋白或其片段的组合物。此类试剂盒可包含无菌容器，该无菌容器包含组合物；此类容器的非限制性实例包括但不限于小瓶、安瓿、瓶子、管、注射器、铝塑封装。在一些实施方案中，组合物为药物组合物且容器由适用于保存药剂的材料制成。在一个实施方案中，试剂盒可包含第一容器中的呈冻干形式的抗原结合蛋白或其片段及第二容器中的用于重构或稀释抗原结合蛋白或其片段的稀释剂(例如无菌水)。在一些实施方案中，该稀释剂为药学上可接受的稀释剂。
[0196]
通常，试剂盒将进一步包含提供于容器中或与容器一起提供的具有使用说明书的单独的纸张、手册或卡片。如果试剂盒旨在用于医药用途，则其可进一步包含以下中的一或多者：关于向患有补体c3介导的疾病或病症的个体施用组合物的信息及给药时程、治疗剂的说明、注意事项、警告、适应症、禁忌、关于用药过量的信息及/或不良反应。
[0197]
诊断性应用及/或检测
[0198]
本发明的抗原结合蛋白或其片段可用于体内及/或体外检测或诊断性目的。例如，本领域技术人员已知许多用于检测特定细胞或组织中的表达的涉及抗原结合蛋白的免疫测定法。对于此类应用，本文中所公开的抗原结合蛋白或其片段可经标记或未经标记。例如，但非限制性，可使用未经标记的抗原结合蛋白且通过识别本文中所描述的抗原结合蛋白上的表位的二级抗体进行检测。在另一实施方案中，抗原结合蛋白或其片段与可由检测剂物质识别的一或多种物质结合，例如，抗原结合蛋白或其片段与可由链霉亲和素检测的生物素结合。在某些实施方案中，抗原结合蛋白或其片段适用于检测样品中是否存在c3及/
或c3b。在某些实施方案中，样品为生物样品。如本文中所使用，术语“检测”涵盖定量及/或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含来自人类患者的细胞或组织，诸如视网膜组织。
[0199]
在某些实施方案中，方法包含使生物样品与至少一种本发明的抗原结合蛋白或其片段接触；允许样品中的c3(如果存在的话)与抗原结合蛋白或其片段之间形成复合物；随后，检测该抗原结合蛋白或其片段。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。
[0200]
在一个实施方案中，通过可检测信号来检测抗原结合蛋白或其片段。在另一实施方案中，通过elisa、免疫细胞化学(icc)、免疫组织化学(ihc)、蛋白质印记及/或流式细胞术来检测抗原结合蛋白或其片段。
[0201]
生物样品可为组织样品，诸如视网膜组织。组织样品可为固定组织样品，诸如福尔马林固定及石蜡包埋的组织样品。
[0202]
在一个实施方案中，使用此类方法选择患者，即，确定个体是否符合使用如本文中所描述的抗原结合蛋白或其片段的疗法的条件。
[0203]
本领域技术人员将容易地显而易见，可在不偏离本文中所公开的实施方案的范围的情况下使用适合的等效物进行本文中所描述的方法的其他适合修改及改变。现已详细描述某些实施方案，参考以下实例将更清楚理解这些实施方案，其仅出于说明的目的而包括在内且不旨在为限制性。
实施例
[0204]
实施例1-抗c3抗体库的产生及表征
[0205]
为了产生能够比补体的部分抑制剂更有效地抑制补体级联的抗体，假设具有不同表位识别的抗c3抗体的广泛收集可增加分离具有所需功能的抗体的可能性。为此，使用基因组信息构建大型抗体噬菌体库，该基因组信息编码衍生自经c3免疫接种的动物的b细胞的抗体可变域。
[0206]
为了产生大量的能够识别c3上的不同表位的抗体，用自血清纯化的天然人c3蛋白质免疫接种3只新西兰白兔(new zealand white rabbit)及2只美洲驼(图2)。各动物接受在不同时间点进行的4次c3蛋白质及完全或不完全弗氏佐剂的注射(图3a)。通过elisa测试各动物的免疫反应，以对经免疫接种的动物的血清样品中存在的抗c3抗体进行定量。血清中的抗体效价指示极佳的免疫反应(图3b)。
[0207]
经由pcr扩增由rna构建scfv抗体cdna库，该rna自来自兔的经分离的pbmc及脾脏淋巴细胞提取。经由一系列重叠聚合酶链式反应(pcr)步骤来单独地扩增可变轻链域及可变重链域的编码序列且进行连接，以得到最终scfv产物。
[0208]
对于美洲驼，抽取大量血液，自血液分离rna且使用反转录酶试剂盒转录成cdna。清洗cdna，使用引物退火在前导序列区及ch2区来扩增重链片段。
[0209]
使用适当的限制酶来消化经扩增的编码来自兔的scfv及来自美洲驼的vhh的dna序列且接着连接至噬菌粒载体中。将噬菌粒载体转化至很好地适用于抗体噬菌体展示库产生的tg1电转化细胞中。这些过程产生四个抗体库，其大小大于108个克隆且具有约100％插入百分比(图4a及图4b)。
[0210]
实施例2-抑制所有三种补体途径的抗c3抗体的筛选
[0211]
c3为由13个不同域构成的大型蛋白质且分子大小为185千道尔顿。在补体活化期间，c3经历蛋白水解分裂及不同位点处的结构修饰。c3衍生的片段发挥不同效应功能且形成转化酶，该转化酶有助于补体途径的扩增环。酶c3转化酶具有在有效扩增环中使多个c3分子裂解成c3b以产生更多的c3转化酶，从而引起补体系统的完全活化的能力。使用本文中所描述的筛选来鉴别结合c3及c3b上的不同表位且有效地阻断所有三种补体活化途径(经典、凝集素及替代)的抗体。
[0212]
为了筛选具有高亲和力的抗c3抗体，制备在噬菌体上展示的scfv及vhh抗体且经历若干轮针对自血清纯化的天然人c3的生物淘选(选择)。通过降低生物淘选中所使用的c3蛋白质的浓度或提高洗涤物的严格度来提高每一轮的选择的严格度。选择约380种单克隆噬菌体且在elisa测定法中针对其结合c3的能力进行筛选(图5)。
[0213]
基于elisa数据及dna指纹，选择41种噬菌体克隆进行测序且以重组方式制备成抗体蛋白质，且评估其结合人c3及c3b的能力且进行进一步表征(图5)。
[0214]
为了鉴别阻断所有3种补体途径的抗体，用补体系统筛选(svar life science ab,sweden)，使用用于人类血清中的功能性经典、凝集素及替代补体途径的定性测定的酶免疫分析法筛选抗体。所产生的c5b-c9新抗原的量与补体途径的功能活性成比例。如图6中所示，五种抗体，即m0251、m0228、m0122、m0123及m0124，能够在2μm的固定浓度下抑制人血清(quidel)中的所有三种补体途径至少90％。
[0215]
实施例3-抗c3抗体的表征：m0251、m0228、m0122、m0123及m0124
[0216]
以配对组合方式测试m0251、m0228、m0122、m0123及m0124，以鉴别靶向c3上的相同区域(表位)的抗体。简言之，经由生物素标记来标记一种抗体且在c3结合elisa中与其他抗体克隆一起培育。认为竞争相同结合区域的抗c3抗体共享类似的表位且因此具有类似功能。此信息使得能够减少潜在抗体候选物的数目，同时保持表位多样性。在抑制所有三种补体途径的五种抗体中，认为m0251、m0228及m0123共享c3上的相同表位(图7d)。假设抑制先导物结合c3上的三种不同表位(图7a-图7d)。
[0217]
在elisa中评估鉴别为能够抑制所有三种补体途径的抗体的结合食蟹猕猴c3的能力。简言之，用认为能够与食蟹猕猴c3交叉反应的多克隆山羊抗血清涂布96孔elisa盘且接着进行与定制的食蟹猕猴血清制剂(bioivt，nb-151558)的二级结合。将抗体分子的连续稀释物添加至elisa盘中且用兔抗人κhrp抗体(abcam，ab202549)或小鼠抗his tag hrp抗体(r&d systems，mab050h)检测结合于食蟹猕猴c3的抗体。先导物m0122、m0124及m0251展示以剂量反应方式与食蟹猕猴c3结合。有趣的是，尽管m0251、m0228及m0123竞争人c3上的相同表位，但仅m0251展示对食蟹猕猴c3的结合活性(图15a及图15b)。
[0218]
使用wieslab补体系统筛选来评估抗c3抗体抑制食蟹猕猴血清中的所有补体活化途径的能力。将抗c3抗体添加至定制的食蟹猕猴血清制剂中。图14a展示m0122、m0124及m0251在2μm的固定浓度下有效抑制所有三种补体途径，表明m0122、m0124及m0251为食蟹猕猴血清中的补体介导的mac形成的强效抑制剂。m0228未展示对食蟹猕猴血清中的补体途径的抑制活性，证实了所观察到的此抗体对食蟹猕猴c3不具有结合活性(图14b)。使用相应的wieslab补体系统试剂盒，进一步评估m0122、m0124及m0251对食蟹猕猴血清中的经典及替代途径的剂量依赖性抑制(图14b及图14c)。
[0219]
在直接结合elisa测定法中评估m0122、m0124及m0228结合人c3及c3b的能力(图8a及图8b)。简言之，用经纯化的天然人c3或c3b(complement technology，a113及a114)涂布96孔elisa盘。将抗体分子的连续稀释物添加至盘中且通过兔抗人κhrp抗体(abcam，ab202549)或兔抗his tag hrp抗体(abcam，ab1187)进行检测。m0122、m0124及m0228表现出与人c3及c3b的高亲和力结合。通过生物层干涉术进一步分析m0122、m0124及m0228与人c3的结合动力学，呈现较低的皮摩尔范围内的亲和力(图10)。
[0220]
使用相应的wieslab补体系统试剂盒评估m0122、m0124及m0228对人类血清中的替代及经典途径的剂量依赖性抑制。抗c3抗体m0122、m0124及m0228展示对人类血清中的替代及经典途径的强效抑制(图9a及图9b)。进一步评估抗c3抗体m0122、m0123及m0124以剂量反应方式抑制凝集素途径的能力。图16展示人血清中的凝集素途径的有效抑制。总而言之，这些结果进一步支持本发明的抗体有效抑制所有三种补体活化途径。
[0221]
实施例4-抗c3抗体与apl-2相比更可能穿透布鲁赫膜
[0222]
现已知补体系统在地图状萎缩的发病机制中起作用。然而，尚未完全理解补体活性在眼睛中如何划分及ga疗法的功效是否取决于将治疗剂递送至眼睛内的正确解剖学位点。我们假设可能需要更好地穿透至疾病相关视网膜组织(即，rpe、布鲁赫膜及脉络膜)中以实现更大程度地减少ga中的病变生长。脉络膜的内部部分称为脉络膜毛细管层，其含有由一片称为布鲁赫膜(brm)的细胞外膜分隔的毛细管(图11)。
[0223]
布鲁赫膜可选择性地被抗体及生物制剂穿透。如clark等人(front.immunol.2017.8:1-10)所报导，除fhl-1、因子d及c5a以外，补体途径蛋白质不能穿过布鲁赫膜。总体而言，具有较大流体动力学半径的抗体及生物制剂不太可能穿过布鲁赫膜。如以下表3中所示，除apl-2及cdr2(本发明的抗c3scfv)以外，除fhl-1以外的所列举的流体动力学半径大于3.00的分子都不能穿过布鲁赫膜；另一方面，除c3a以外，所有所列举的流体动力学半径大于3.00的分子都可穿过布鲁赫膜。
[0224]
表3：生物制剂清单的大小因素
[0225][0226][0227]
此外，等人(invest ophthalmol vis sci.2005；46(2):641-6)研究经羧基荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)标记的聚葡萄糖(分子量为4至80kda)对来自牛眼睛的新鲜rpe-脉络膜样本的穿透性。我们针对分子大小来标绘穿透性(图12，黑色斑点)。我们还
使用由hirvonen等人(pharm res.2016；33(8):2025-32)进行的研究，基于流体动力学半径推导出scfv、诺适得(lucentis)、艾力雅(eylea)及apl2的穿透性值，且在同一张图中针对分子量来标绘穿透性(图12，彩色斑点)。趋势表明，分子量越大，对布鲁赫膜的穿透性越差。
[0228]
我们预测很有可能的是，与流体动力学半径为至少7nm的apl-2(连接至40kda线性peg的两个抗c3环状apl-1肽，总共43kda)相比，本发明的呈抗体片段形式(诸如，但不限于，scfv或vhh形式)且流体动力学半径为约2.5nm及更小的抗c3抗体可更好地穿透布鲁赫膜。
[0229]
为了测试此假设，使用安装于尤斯室(ussing chambers)上的经富集的猪brm评估抗c3分子穿过brm的能力。简言之，自猪眼睛分离经富集的布鲁赫膜且安装于尤斯扩散室(ussing diffusion chamber)(multi channel systems mcs gmbh，目录号660026)中。在安装之后，直径为5mm的布鲁赫膜为两个相同隔室之间的唯一屏障。在室温下用1ml pbs洗涤布鲁赫膜的两侧至少5分钟。对于渗漏测试，向样品室中添加1ml pbs且追踪对第二隔室的渗漏持续5分钟。如果未检测到渗漏(渗漏指示膜完整性受损)，则将抗体蛋白质在1ml pbs中以100μg/ml添加至样品室中且向第二隔室(扩散物室)中添加1ml pbs。将整个尤斯室在室温下培育24小时，同时温和地振荡以避免产生扩散蛋白质的梯度。通过凝胶电泳来分析来自各室的样品(15μl)。将预制4-12％nupage bis tris sds凝胶(thermo fisher scientific)在还原条件下，在200v下操作40分钟。将凝胶在室温下用instant blue染料(expedeon)染色60分钟以用于检测抗体蛋白质，或用碘化钡溶液染色以用于检测peg(用以下物质固定凝胶：0.1m过氯酸，在15分钟之后更换为20ml 5％bacl2与8ml 0.1m碘溶液的预混物，在10分钟之后重复地用去离子水每10分钟更换一次持续1小时)。为了计算样品或扩散物室中的蛋白质百分比，使用imagej软件测量经instant blue染色或经bai2染色的sds凝胶中的条带密度(band density)。将这些条带的平均强度与表示100％负载蛋白质(即，15μl，100μg/ml)的对照性条带的密度进行比较。接着，标绘所计算的蛋白质百分比
±
sd。比较同时在来自四个不同的猪眼睛的brm制剂上培育的m0123的scfv衍生物(26kda)及apl-2替代物(一个连接至40kda线性peg的抗c3环状apl-1肽，总共42kda)的穿过猪brm的能力。与apl-2替代物相比，穿过所有四种膜制剂中的brm的scfv的量明显更高(图13a及图13b)。

技术特征：
1.一种结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段，其中该抗原结合蛋白或其片段能够抑制补体活化途径，包括经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)。2.如权利要求1的抗原结合蛋白或其片段，其能够结合补体c3及c3b。3.如权利要求1的抗原结合蛋白或其片段，其能够结合补体c3上的表位，其中此类结合阻止c3转化酶的形成。4.如权利要求1至3中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够穿透布鲁赫膜(bruch's membrane)。5.如权利要求1至4中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够与一或多种抗原结合蛋白竞争，所述一或多种抗原结合蛋白包括m0122、m0123、m0124、m0228及m0251。6.如权利要求1至5中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含单链可变片段(scfv)、fab片段、fab'片段、fv片段、双功能抗体(diabody)、小型抗体模拟物，或单域抗体，诸如sdab、sdfv、纳米抗体、v-nar或vhh。7.如权利要求1至6中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含与由以下组成的组的序列具有至少80％同一性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。8.如权利要求1至7中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含可变重链(vh)及可变轻链(vl)，其中该vh包含选自由seq id no:1、4、7、13及19组成的组的cdr-h1序列；选自由seq id no:2、5、8、14及20组成的组的cdr-h2序列；选自由seq id no:3、6、9、15及21组成的组的cdr-h3序列；及其中该vl包含选自由seq id no:10、16及22组成的组的cdr-l1序列；选自由seq id no:11、17及23组成的组的cdr-l2序列；及选自由seq id no:12、18及24组成的组的cdr-l3序列。9.如权利要求1至8中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其中该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％同一性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列具有至少80％同一性。10.如权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:7的cdr-h1序列、seq id no:8的cdr-h2序列及seq id no:9的cdr-h3序列；及其中该vl包含seq id no:10的cdr-l1序列、seq id no:11的cdr-l2序列及seq id no:12的cdr-l3序列。11.如权利要求10的抗原结合蛋白或其片段，其中该vh包含seq id no:27的氨基酸序列且该vl包含seq id no:28的氨基酸序列。12.如权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:13的cdr-h1序列、seq id no:14的cdr-h2序列及seq id no:15的cdr-h3序列；及其中该vl包含seq id no:16的cdr-l1序列、seq id no:17的cdr-l2序列及seq id no:18的cdr-l3序列。13.如权利要求12的抗原结合蛋白或其片段，其中该vh包含seq id no:29的氨基酸序
列且该vl包含seq id no:30的氨基酸序列。14.如权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含vh及vl，其中该vh包含seq id no:19的cdr-h1序列、seq id no:20的cdr-h2序列及seq id no:21的cdr-h3序列；及其中该vl包含seq id no:22的cdr-l1序列、seq id no:23的cdr-l2序列及seq id no:24的cdr-l3序列。15.如权利要求14的抗原结合蛋白或其片段，其中该vh包含seq id no:31的氨基酸序列且该vl包含seq id no:32的氨基酸序列。16.如权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含vhh域，其中该vhh域包含seq id no:1的cdr-h1序列、seq id no:2的cdr-h2序列及seq id no:3的cdr-h3序列。17.如权利要求16的抗原结合蛋白或其片段，其中该vhh域包含seq id no:25的氨基酸序列。18.如权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含vhh域，其中该vhh域包含seq id no:4的cdr-h1序列、seq id no:5的cdr-h2序列及seq id no:6的cdr-h3序列。19.如权利要求18的抗原结合蛋白或其片段，其中该vhh域包含seq id no:26的氨基酸序列。20.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3及c3b的结合亲和力为至少约10-8
m。21.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3及c3b的结合亲和力为约10-9
m至约10-14
m。22.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3及c3b的结合亲和力为约10-10
m至约10-12
m。23.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3及c3b具有大致等效的结合亲和力。24.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其中对c3的结合亲和力在对c3b的结合亲和力的十分的一以内。25.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力为约10-4
m或更弱。26.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，相较于对c3及c3b的结合亲和力，其对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b的结合亲和力较弱。27.如权利要求1至19中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其对c3a、ic3b、c4、c4b、c5及/或c5b没有结合亲和力。28.如权利要求1至27中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够抑制由以下组成的组的任一者的活性：cp、lp及ap补体途径。29.如权利要求1至28中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够抑制cp、lp及/或ap补体途径的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。30.如权利要求1至29中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够大致等效地抑制cp、
lp及ap补体途径的活性。31.如权利要求30的抗原结合蛋白或其片段，其中抑制cp、lp及ap补体途径的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。32.如权利要求28至31中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其中cp、lp及ap补体途径的活性是通过测量在存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的红细胞溶血水平与不存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的红细胞溶血水平相比较来确定的。33.如权利要求28至31中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其中cp、lp及ap补体途径的活性是通过测量在存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的攻膜复合物(mac)形成与不存在抗原结合蛋白或其片段的情况下的mac形成相比较来测定。34.如权利要求1至33中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够抑制c3转化酶的活性至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。35.如权利要求1至34中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够抑制c3转化酶扩增环。36.如权利要求1至35中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其能够抑制脉络膜c3活性。37.如权利要求1至36中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含分子量约60kda或更低。38.如权利要求1至37中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含分子量约20kda至约30kda。39.如权利要求1至37中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含分子量约10kda至约20kda。40.如权利要求1至37中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含分子量约25kda。41.如权利要求1至37中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其包含分子量约15kda。42.如权利要求1至41中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其中该抗原结合蛋白或其片段与食蟹猕猴c3具有交叉反应性。43.如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段用于制备用于治疗受试者的补体c3介导的疾病或病症的药物组合物的用途。44.一种药物组合物，其包含如前述权利要求任一项的抗原结合蛋白或其片段和药学上可接受的载剂。45.如权利要求43或44的药物组合物，其包含低黏度。46.如权利要求45的药物组合物，其中该黏度在约1cp至约50cp之间。47.如权利要求45的药物组合物，其中该黏度小于或等于约20cp。48.一种分离的核酸分子，其编码如前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白或其片段。49.一种表达载体，其包含如权利要求48的核酸分子。50.一种宿主细胞，其包含如权利要求49的表达载体。51.一种用于制造如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段的方法，其包含以下步骤：(i)在允许表达如权利要求1至42中任一项的蛋白质的条件下培养如权利要求50的宿主细胞；(ii)回收该蛋白质；及任选地
(iii)进一步纯化及/或修饰及/或配制该蛋白质。52.如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其供在治疗个体中补体c3介导的疾病或病症的方法中使用。53.一种用于治疗受试者的补体c3介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项的抗原结合蛋白或其片段。54.如权利要求53的方法或如权利要求52的供使用的抗原结合蛋白或其片段，其中该抗原结合蛋白或其片段经由局部、结膜下、玻璃体内、眼球后及/或前房内施用来施用。55.如权利要求53或54的方法或如权利要求52或54的供使用的抗原结合蛋白或其片段，其中该补体c3介导的疾病或病症选自由以下组成的组：年龄相关的黄斑变性、地图状萎缩、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、自体免疫葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎、视网膜炎、类风湿性关节炎、牛皮癣及动脉粥样硬化。56.如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段，其供在通过抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)的活性或通过抑制脉络膜局部补体c3的活性来治疗个体中补体c3介导的疾病或病症的方法中使用。57.一种抑制补体经典途径(cp)、凝集素途径(lp)及替代途径(ap)的活性的方法，所述方法包括使补体c3与结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段接触。58.一种抑制脉络膜局部补体c3的活性的方法，该方法包括眼内施用结合补体c3上的表位的抗原结合蛋白或其片段。59.如权利要求57或58的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。60.如权利要求57至59中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3上的表位，其中此结合阻止c3转化酶的形成。61.如权利要求57至60中任一项的用途，其中该抗原结合蛋白或其片段能够与一或多种抗原结合蛋白竞争，包括m0122、m0123、m0124、m0228及m0251。62.如权利要求57至61中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含单链可变片段(scfv)、fab片段、fab'片段、fv片段、双功能抗体、小抗体模拟物，或单域抗体，诸如sdab、sdfv、纳米抗体、v-nar或vhh。63.如权利要求57至62中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含与由以下组成的组的序列具有至少80％同一性的cdr-h3：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:15及seq id no:21。64.如权利要求57至62中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含可变重链(vh)及可变轻链(vl)，其中该vh包含选自由seq id no:1、4、7、13及19组成的组的cdr-h1序列；选自由seq id no:2、5、8、14及20组成的组的cdr-h2序列；选自由seq id no:3、6、9、15及21组成的组的cdr-h3序列；及其中该vl包含选自由seq id no:10、16及22组成的组的cdr-l1序列；选自由seq id no:11、17及23组成的组的cdr-l2序列；及选自由seq id no:12、18及24组成的组的cdr-l3序列。65.如权利要求64的方法，其中该vh与由seq id no:25、26、27、29及31组成的组的序列具有至少80％同一性，及/或该vl与由seq id no:28、30及32组成的组的序列具有至少80％
同一性。66.如权利要求57至65中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段能够穿透布鲁赫膜。67.如权利要求57至66中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段能够抑制脉络膜c3活性。68.如权利要求57至67中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含分子量约60kda或更低。69.如权利要求57至68中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含分子量约20kda至约30kda。70.如权利要求57至69中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含分子量约10kda至约20kda。71.如权利要求57至68中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含分子量约25kda。72.如权利要求57至68中任一项的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段包含分子量约15kda。73.一种用于检测生物样品中c3及c3b中的一或两者的方法，其包含以下步骤：(a)使该样品与至少一种如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段接触；(b)允许该样品中c3及c3b中的一或两者与该抗原结合蛋白或其片段之间形成复合物；及(c)检测该抗原结合蛋白或其片段。74.如权利要求73的方法，其中该抗原结合蛋白或其片段能够结合补体c3及c3b。75.如权利要求73或74的方法，其中通过可检测信号来检测该抗原结合蛋白或其片段。76.如权利要求73至75中任一项的方法，其中该生物样品为组织样品，诸如视网膜组织。77.一种用于检测c3的试剂盒，其包含如权利要求1至42中任一项的抗原结合蛋白或其片段及使用说明书。

技术总结
本发明提供对补体C3及C3b具有特异性的抗原结合蛋白。还提供治疗补体C3介导的疾病及病症的方法；抑制补体经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及/或替代途径(AP)的活性的方法；及抑制脉络膜局部补体C3的活性的方法。脉络膜局部补体C3的活性的方法。


技术研发人员：L
受保护的技术使用者：CDR生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2023/10/7