具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用

1.本发明涉及基因工程
技术领域：
：，具体涉及具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用。
背景技术：
：：2.外泌体是具有源自内膜系统的膜结构的纳米级细胞外囊泡，直径为40~100nm的颗粒，包含来自供体细胞的物质，例如蛋白质、脂质和核酸，并通过将这些物质转移到受体细胞从而实现细胞与细胞间的信息交流（yi,q.,z.xu,a.thakur,k.zhang,q.liang,y.liuandy.yan(2023)."currentunderstandingofplant-derivedexosome-likenanoparticlesinregulatingtheinflammatoryresponseandimmunesystemmicroenvironment."pharmacologicalresearch190:106733.）。外泌体介导细胞通讯，并参与正常和病理生物学途径，其通过递送生长因子、蛋白质、microrna、信使rna、非编码rna和脂质来诱导组织再生（chavda,v.p.,a.pandya,l.kumar,n.raval,l.k.vora,s.pulakkat,v.patravale,y.duoandb.z.tang(2023)."exosomenanovesicles:apotentialcarrierfortherapeuticdelivery."nanotoday49:101771.）。外泌体在医学上具有重要的应用价值，外泌体可以主动或被动地装载或封装治疗药物，同时外泌体主要通过三种方式被靶细胞吸收：胞吞作用、配体-受体结合或直接结合，为临床诊断和治疗干预提供了新的潜在目标（desousa,k.p.,i.rossi,m.abdullahi,m.i.ramirez,d.strattonandj.m.inal(2023)."isolationandcharacterizationofextracellularvesiclesandfuturedirectionsindiagnosisandtherapy."wileyinterdisciplinaryreviews:nanomedicineandnanobiotechnology15(1):e1835.）。3.外泌体按来源可以分为动物外泌体和植物外泌体，两者均可用作高度特异性的药物递送系统。近年来，利用外泌体靶向运输和释放药物进行疾病的治疗已经取得了临床前的成功。例如，发现外泌体封装可以提高姜黄素的溶解度、稳定性和抗炎特性（sun,d.,x.zhuang,x.xiang,y.liu,s.zhang,c.liu,s.barnes,w.grizzle,d.millerandh.-g.zhang(2010)."anovelnanoparticledrugdeliverysystem:theanti-inflammatoryactivityofcurcuminisenhancedwhenencapsulatedinexosomes."moleculartherapy18(9):1606~1614.）。外泌体具有较长的循环半衰期，被人体很好地耐受，不仅能够穿透细胞膜，还可能靶向特定的细胞类型，这使得它们成为免疫学应用的最佳候选者。此外，蛋白质和遗传物质加载到外泌体中的能力是使外泌体成为有吸引力的药物递送系统的另一个优势（doyle,l.m.andm.z.wang(2019)."overviewofextracellularvesicles,theirorigin,composition,purpose,andmethodsforexosomeisolationandanalysis."cells8(7):727.）。因此，外泌体近年来成为药物输送系统开发的理想选择。4.天然虾青素具有抗氧化、抗衰老、抗炎和抗动脉粥样硬化等多种特性，因此它已成为供人类食用的各种医药产品中的活性成分（eren,b.,s.tuncaytanrıverdi,f.aydınköseandꢀö.ꢀözer(2019)."antioxidantpropertiesevaluationoftopicalastaxanthinformulationsasanti‐agingproducts."journalofcosmeticdermatology18(1):242~250.）。人工生产的虾青素目前在天然虾青素市场上占主导地位，但人类食用后已经观察到副作用，因此天然虾青素变得不可或缺（capelli,b.,d.bagchiandg.r.cysewski(2013)."syntheticastaxanthinissignificantlyinferiortoalgal-basedastaxanthinasanantioxidantandmaynotbesuitableasahumannutraceuticalsupplement."nutrafoods12:145~152.）。天然虾青素是非结晶的，主要以酯类形式存在，可溶于脂质。与其他天然抗氧化剂如番茄红素、玉米黄质、叶黄素、α/β-胡萝卜素、α-生育酚、trolox等相比，虾青素的抗氧化性能更强（yeh,p.-t.,h.-w.huang,c.-m.yang,w.-s.yangandc.-h.yang(2016)."astaxanthininhibitsexpressionofretinaloxidativestressandinflammatorymediatorsinstreptozotocin-induceddiabeticrats."plosone11(1):e0146438.）。由此可见虾青素的抗氧化特性在保健品、医药、化妆品等方面具有广阔的应用前景。5.天然虾青素的生物来源一般有三种：水产品加工工业的废弃物，酵母提取，和藻类提取。现在世界公认的天然虾青素的最佳来源是藻类。微藻生长速度快，营养丰富，在水产养殖、保健等诸多领域具有广泛的用途，微藻是快速获得虾青素的生物来源，因此，进行工程化改造微藻，进一步提高微藻的应用潜力和虾青素的含量具有重要的研究和实用价值。技术实现要素：6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用。7.本发明提供了mir394在调控微藻的脂质合成、脂质分泌和虾青素含量中的应用。所述mir394来源于微藻，所述微藻包括但不限于螺旋藻、小球藻、红球藻、微拟球藻或盐藻等。8.进一步的，所述微藻包括微拟球藻，本发明的具体实施例中，所述微藻为微拟球藻（nannochloropsisoceanica，nationalcenterformarinealgaeandmicrobiota，usa，编号ccap849/10）；所述mir394来源于微拟球藻，具有如seqidno:1所示的核苷酸序列。9.本发明提供了基因工程微藻，其mir394的表达升高或降低；所述mir394具有如seqidno:1所示的核苷酸序列。10.进一步的，本发明所述的基因工程微藻，其起始藻株包括微拟球藻。11.更进一步的，所述起始藻株为微拟球藻，具体为来源于nationalcenterformarinealgaeandmicrobiota，usa，编号ccap849/10的微拟球藻nannochloropsisoceanica。12.本发明提供了所述基因工程微藻的制备方法，所述制备方法包括以含有mir394的重组载体，转化或转染微藻；或基因组整合含有mir394的表达单元。13.进一步的，本发明的一些实施例中，所述重组载体的元件还包括：博来霉素抗性基因、phsp20启动子、tmv为增强子和/或ccmp1779/4210-terminator终止子中的一种或多种。14.本发明的一些具体实施例中，所述重组载体的元件具体包括：phsp20热休克蛋白20启动子；tmv增强子；mir394基因（seqidno:1）；eyfp增强型黄色荧光蛋白；flag蛋白标记标签；ccmp1779/4210-terminator终止子；pldspldsp启动子；shble博来霉素抗性基因；hsp20-t-8259热休克蛋白20终止子；ampr氨苄青霉素基因；ori复制起点。15.本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对微藻中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知微藻利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。16.本发明所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。17.本发明实验证明mir394可调控微拟球藻的脂质的合成和分泌和所述分泌脂质中的虾青素含量，经证明，所述脂质分泌为脂滴，所述脂滴组成成分与外泌体相似，因此命名为类外泌体。本发明的一些具体的实施例中，通过将携带mir394的重组载体导入微拟球藻，构建了mir394过表达的微拟球藻工程菌株，所述菌株脂质合成和分泌以及虾青素含量升高。尽管虾青素为脂溶性素色素，提高脂质含量可提高虾青素的溶解量，但实际试验过程中，并不是所有的提高脂质合成和分泌的工程微藻的虾青素含量均会提高，如专利cn115992052a中脂质合成和分泌提高，但其改造微藻中基本不含有虾青素，微藻细胞为白色。本发明第一次揭示了mir394具有提高微藻脂质合成和分泌以及虾青素含量的功能。18.本发明中，所述虾青素存在于所述类外泌体中，为脂化虾青素，与普通合成的游离的虾青素相比较，温度耐受性和盐度耐受性（0~40度，海水），在常温可以稳定保存；且酯化虾青素，免疫原性低，抗氧化能力强，应用范围广，如化妆品、眼科用药、癌症用药等领域。19.本发明提供了所述的基因工程微藻分泌的类外泌体。20.本发明提供了所述的类外泌体的制备方法，其包括培养如本发明所述的基因工程微藻，获得含有所述的类外泌体的混合物。21.进一步的，本发明所述的制备方法，其还包括所述混合物的分离纯化，所述分离纯化的方法为超高速冷冻离心。22.本发明提供了如下i）~iv）所示中的至少一项在制备含有虾青素的产品和/或抗氧化产品中的应用：i）、本发明所述的基因工程微藻；ii）、本发明所述的基因工程微藻的制备方法制得的基因工程微藻；iii）、本发明所述的类外泌体；iv）、本发明所述的制备方法制得的含有所述类外泌体的混合物。k.b.(2015)."microrna(mirna)incancer."cancercellinternational15(1):1~6.）。研究表明mirna在环境胁迫、植物生长发育以及各种生物和代谢活动的调控中起着重要作用，例如mirna164不仅可以调节水稻干旱，还参与拟南芥对热胁迫的适应性（tsai,w.-a.,p.-h.sung,y.-w.kuo,m.-c.chen,s.-t.jengandj.-s.lin(2023)."involvementofmicrorna164inresponsestoheatstressinarabidopsis."plantscience:111598.）。mirna被认为在动物发育和生理学中很重要，研究认为mirna动物体内是一种重要的小型调节rna，因为它可以通过靶向多个靶基因来微调整个生物通路。这一特性使mirna成为有望恢复因疾病而受损的细胞功能的治疗工具，因此mirna在诊断和治疗应用中显示出巨大的潜力（vishnoi,a.ands.rani(2017)."mirnabiogenesisandregulationofdiseases:anoverview."micrornaprofiling:methodsandprotocols:1~10.）。显然，mirna是一种重要的遗传调节因子。且本发明在对模式微藻微拟球藻(nannochloropsisoceanica)进行转录调控的研究中发现，mir394在转录水平上靶向调控细胞壁多糖合成的关键基因（葡萄糖磷酸变位酶pgm3,udp-葡萄糖脱氢酶ugdh）的转录，其过表达引起了脂质合成相关基因（溶血磷脂酸酰基转移酶lpaat，乙酰基甘油酰基转移酶dgat）的上调，同时也引起了抑制中性脂降解酶表达，因此，在生物学功能上抑制了细胞壁多糖的合成。基于这些前期的研究，本发明进一步深入挖掘，构建了基因工程菌株，第一次发现了mir-394可调控藻类脂质合成和分泌，且对虾青素的含量也具有影响，获得了高效的虾青素类外泌体合成和分泌系统。31.本发明中，通过在n.oceanica中过表达mirna394编码基因使得微藻细胞壁变薄向内凹陷，细胞向外分泌脂滴。微藻脂滴是一种由磷脂膜构成、储存脂质的细胞器，其在内质网上合成，其组成成分与外泌体相似。借助超速离心、荧光共聚焦激光显微镜、透射电镜、hplc、分子生物学等实验方法，进一步对微拟球藻分泌的脂滴进行了分离和内容物鉴定，发现微藻分泌脂滴的方式与动植物外泌体分泌一致，同时还发现脂滴中含有蛋白质、脂质和天然活性物质虾青素，因此将系类脂滴定义为类外泌体。32.微藻类外泌体由细胞自然分泌，具有良好的生物相容性可被视为确保全球虾青素供应可持续性的一种有前途的方式。同时在微藻生产中可以严格控制生物安全。其次，微藻被认为是高产微生物，其外泌体中富含虾青素，可以提高虾青素的生产能力（cui,w.,s.tie,m.guo,f.qiao,m.tanandw.su(2022)."engineeringmilk-derivedexosomeforenhancingcellularastaxanthindelivery."journalofagriculturalandfoodchemistry70(35):10794~10806.）。天然虾青素要以酯类形式存在，水溶性差，而外泌体中富含脂质可提高虾青素溶解度（zhang,x.,c.han,b.du,d.nan,w.zhangandg.he(2022)."isolationandidentificationofadiposestemcellexosomesandthestudyofitspotentialasdrugdeliverycarrierinvitro."appliedbiochemistryandbiotechnology194(6):2594~2603.）。因此大规模的以微藻类外泌体为基础的虾青素生产可以被视为提高生物利用度和创造生态效益的过程。33.基于此，本发明的优势在于：（1）本发明虾青素类外泌体富含酯化的虾青素，是藻细胞天然分泌的，其功效更高：虽然虾青素普遍存在于自然界，但是能够提取的量有限，而且虾青素容易氧化分解不易保存，所以并不能满足于人类的需求。尽管随着科技的进步，化学合成的虾青素悄然问世，只是化学合成的虾青素由于分子结构的差异，其效果和安全性远远低于天然提纯的虾青素，因此并没有实际意义。由于天然虾青素与合成虾青素的结构不同，长期食用合成虾青素对人体健康的影响尚不明确（stachowiak,b.andp.szulc(2021)."astaxanthinforthefoodindustry."molecules26(9):2666.）。然而微拟球藻培养简单，类外泌体可大量制备，并且制备成本低廉，虾青素包裹在类外泌体中能有效避免空气氧化从而提高保存稳定性，从微藻外泌体中提取的天然虾青素在化妆品和药物、疫苗上应用上具有广阔前景。34.（2）本发明虾青素类外泌体生物合成系统具有高产、高效、高复制等特点：递送载体大小是限制基因递送系统的一大难题，无吞噬功能的真核细胞只能内化直径小于1微米的颗粒，非纳米基因载体的体积较大，与外源基因结合后形成的复合体粒径进一步增大，因而转染效率较低，纳米递送载体工艺复杂，须经过严格修饰，制备成本高。而本发明的虾青素类外泌体生物合成和分泌系统，具有复制高效，高分泌，制备方法更简单高效。35.（3）本发明虾青素类外泌体无cd蛋白，来源于微藻，免疫原性更低：常规递送载体，如病毒载体或纳米递送载体，依旧具有一定的细胞毒性和免疫原性，影响细胞生长代谢，同时费用高昂，制备成本高，透过细胞膜能力或者细胞摄取效果较差。而类外泌体具有低免疫原性，无cd蛋白，具有天然的靶向能力、无毒、可在细胞间实现远距离传递，类外泌体中rna装载量高且内容物虾青素不易被分解，故作为递送载体具有长期稳定的效果。外泌体作为药物载体受到广泛关注，在疾病的诊断和治疗方面展现出巨大的潜力。表现出良好的生物相容性优势，其药理活性和载药能力已经得到证实，但是动物源性外泌体的低产率限制了其大规模临床应用（gandham,s.,x.su,j.wood,a.l.nocera,s.c.alli,l.milane,a.zimmerman,m.amijianda.r.ivanov(2020)."technologiesandstandardizationinresearchonextracellularvesicles."trendsinbiotechnology38(10):1066~1098.）。而植物来源的类外泌体易获得，临床疗效好，无明显副作用，应用前景广阔。36.premir394的核苷酸序列为：actcttcttctttttcaggaggcggagccatctttgacagatcttacctcttatgtaatctcccgtggcagcggtctgaccacacgtgcacatgaggtgggatctgtcaaagaagaatgagc（seqidno:1）;pre-mir394p1-f的核苷酸序列为：tggtaccacactctaaacccca（seqidno:2）；pre-mir394p1-r的核苷酸序列为：ccagaccgaccactccttacta（seqidno:3）。37.本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。38.下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1微藻微拟球藻工程菌株的构建和性能检测在对模式微藻微拟球藻(nannochloropsisoceanica)进行转录调控的研究中发现，mir394在转录水平上靶向调控细胞壁多糖合成的关键基因（pgm3，ugdh）的转录，其过表达引起了脂质合成相关基因（lpaat，dgat）的上调,同时也引起了抑制中性脂降解酶表达。从而抑制了细胞壁多糖的合成，促进了脂质的积累和分泌。通过在微藻微拟球藻（nannochloropsisoceanica，nationalcenterformarinealgaeandmicrobiota，usa，编号ccap849/10）中过表达基因mir394使得微藻细胞壁变薄向内凹陷，细胞向外分泌脂滴。借助超速离心、荧光共聚焦激光显微镜、hplc等，进一步对微拟球藻分泌的脂滴进行了分离和鉴定，发现微藻分泌脂滴的方式与动植物外泌体分泌一致，并富含虾青素，将微拟球藻分泌的脂滴命名为“虾青素类外泌体”。具体研究过程如下：1.构建mir394元件的类外泌体虾青素生物合成和分泌系统已有报道表明，野生型微拟球藻对博来霉素（ble）具有敏感性，因此可以通过使用博来霉素作为微拟球藻的选择抗性标记来构建载体。此载体含有两个表达盒子：eyfp目的基因表达盒和博来霉素抗性基因表达盒，在本实验中，将这个载体命名为pna03载体（li,d.w.,cen,s.y.,liu,y.h.,balamurugan,s.,zheng,x.y.,alimujiang,a.,yang,w.d.,liu,j.s.,andli,h.y.(2016)j.biotechnol.229,65~71.）。同时以pna03号载体为基础，构建mir394前体基因的遗传表达载体（图1），主要含有两个表达盒：目的基因表达盒和博来霉素抗性基因表达盒（图2）。39.2.进行dna、转录水平进行验证，证明mir394基因过表达2.1dna水平验证：待转化藻株生长稳定后，将所得到的转化藻转移至50ml的离心管中置于离心机中以3500ꢀ×g的离心力离心10min收集50ml海洋微拟球藻细胞藻液，最后把藻收集转移至2ml的离心管中再一次离心收集去除藻液，采用omegadna提取试剂盒提取藻细胞基因组dna，以海洋微拟球藻基因组为模板，以pre-mir394p1-f（seqidno:2）和pre-mir394p1-r（seqidno:3）为引物进行扩增。待pcr反应完成后，使用1%琼脂糖凝胶电泳（如图3所示，mir394-1和mir394-2为两个随机株系，是成功克隆子），140v，30min进行跑胶，根据ds5000marker找到对应大小的目的条带，把胶切下来，作胶回收纯化后，把目的条带送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序完成后进行序列的比对。40.2.2转录水平验证：在超净工作台无菌的操作下，分别收集海洋微拟球藻生长周期第9天的藻液，在低速离心机3500×g离心10min，去除所有的海水培养基之后，把留在底部的藻细胞转移至2ml的离心管后立即放在液氮里急冻，然后放进-80℃冰箱里储存，后面用于提取rna，使用omega公司的植物rna提取试剂盒plantrnakitr6827对微拟球藻的rna进行提取。41.（1）植物rna提取试剂盒提取rna1）准备工作，在开始提取rna之前，准备好蓝色，黄色，白色三种类型的枪头，用报纸包起来，还有0.1mm和0.5mm的氧化锆珠子，药匙，1.5mlep管，提取rna所用到的所有物品均高压高温灭菌1h，烘箱烘干，提取rna前需将实验台用酒精擦拭一遍，周围的环境需要用酒精喷一遍，尽量避免rna的降解；2）从-80℃冰箱中拿出藻细胞样品，分别加入适量的0.1mm和0.5mm的氧化锆珠子，加入500µlrclbuffer/10µlβ-巯基乙醇混合液，马上涡旋混匀（每1mlbufferrcl添加20µlβ-巯基乙醇，需预先混合）。然后从-80℃冰箱中拿出冷冻过的冰砖，把样品放进冰砖，放进研磨仪中，条件是70hz，60s，研磨6~9次，每次中间隔20s，在研磨到第三次的时候需要打开确认冰砖是否还冷，顺便调转一个方向继续研磨；3）研磨结束后取出样品，将gdnafilter过滤柱套入2ml收集管中，转移上清液至gdnafilter过滤柱，室温14,000ꢀ×g离心2分钟。42.4）往滤液加入等体积的rcbbuffer，涡旋混匀20s。43.5）将hibind®ꢀrnamini结合柱套入2ml收集管中，转移一半混合液（＜700ꢀµl）至hibind®ꢀrnamini结合柱上，12,000ꢀ×g室温离心1min，弃掉滤液；6）重复步骤5，直至将所有混合液转移过柱；7）将hibind®ꢀrnamini结合柱套入同一2ml收集管中，往hibind®ꢀrnamini结合柱加入400µlrwfwashbuffer，10,000ꢀ×g室温离心30s，弃掉滤液；8）将hibind®ꢀrnamini结合柱套入同一2ml收集管中，往hibind®ꢀrnamini结合柱加入500µlrnawashbufferii（提前使用无水乙醇稀释），10,000ꢀ×g室温离心30s，弃掉滤液；9）重复步骤8。44.10）将hibind®ꢀrnamini结合柱套入同一2ml收集管中，室温10,000ꢀ×g离心2min，甩干hibind®ꢀrnamini结合柱基质；11）将hibind®ꢀrnamini结合柱套在一个新的1.5ml离心管中，取50~100µl提前在65℃预热的depc水，准确添加在hibind®ꢀrnamini结合柱膜中央，常温放置2min，10,000ꢀ×g室温离心1min，洗脱rna。45.12）将rna进行分装，取出2µl样品进行琼脂糖凝胶电泳（1%），用130v，1min，进行电泳，以检查rna质量是否合格，是否存在降解。另外取1µl样品使用nanodrop仪器进行rna浓度的测定，剩余的样品保存于-80℃冰箱里。46.（2）将rna反转录为cdna对野生型和mir394转化藻中的目的基因及u4内参基因actin进行荧光定量pcr分析，qpcr反应体系为20µl：2×sybrgreenqpcrmastermix10µl；cdna1µl；正反引物各0.5µl；ddh2o8ꢀµl，把加好的样品混匀后分别加入96孔板中，进行荧光定量qpcr分析，结果如图4。47.以上结果表明成功获得pre-mir394过表达转化藻。48.3.基于mir394元件的类外泌体虾青素生物合成和分泌系统分泌的虾青素类外泌体如图5所示，根据激光共聚焦荧光显微镜观察结果显示，mir394转化藻细胞外存在明显的荧光脂滴并且藻细胞中的油体明显比野生型微拟球藻更大，并伴随着大量脂滴分泌到胞外的现象。表明mir394促进了脂质的合成和分泌。49.4.mir394转化藻生中性脂含量测定测量微藻第10天和第13天的中性脂含量，如图6所示，发现第13天mir394-1和mir394-2转化藻细胞中脂质含量显著高于对照组，表明mir394的过表达促进了中性脂的合成。50.5.超高速离心分离转化藻分泌的类外泌体通过超高速冷冻离心的方法分离高纯度微藻类外泌体，结果如图7所示，微藻类外泌体颜色较深。据报道天然虾青素一种红色脂溶性色素且颜色越深证明浓度越高（gandham,s.,x.su,j.wood,a.l.nocera,s.c.alli,l.milane,a.zimmerman,m.amijianda.r.ivanov(2020)."technologiesandstandardizationinresearchonextracellularvesicles."trendsinbiotechnology38(10):1066~1098.），因此提示本发明中分离得到的外泌体中含有较高浓度的虾青素。51.6.类外泌体中虾青素含量测定通过高效液相色谱（hplc）检测类外泌体中虾青素含量，如图8所示。将分离纯化的类外泌体稀释20倍在甲醇溶液中，使用虾青素标准品在甲醇中校准反应并进行定量，测得虾青素浓度为400μg/μl（经测定和换算，每g藻可产生5.65ng虾青素），说明微藻类外泌体中确含有浓度较高的虾青素，虾青素结构图如图9;野生型基本没有虾青素分泌。52.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.mir394在调控微藻的脂质合成、脂质分泌和虾青素含量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微藻包括微拟球藻；所述mir394具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。3.基因工程微藻，其mir394的表达升高或降低；所述mir394具有如seq id no:1所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的基因工程微藻，其特征在于，其起始藻株包括微拟球藻。5.权利要求3或4所述基因工程微藻的制备方法，其特征在于，包括以含有mir394的重组载体，转化或转染微藻。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体的元件还包括：博来霉素抗性基因、phsp20启动子、tmv为增强子和/或ccmp1779/4210-terminator终止子中的一种或多种。7.权利要求3或4所述的基因工程微藻分泌的类外泌体。8.权利要求7所述的类外泌体的制备方法，其特征在于，包括培养如权利要求3或4所述的基因工程微藻，获得含有所述的类外泌体的混合物。9.如下i）~iv）所示中的至少一项在制备含有虾青素的产品和/或抗氧化产品中的应用：i）、权利要求3或4所述的基因工程微藻；ii）、权利要求5或6所述的制备方法制得的基因工程微藻；iii）、权利要求7所述的类外泌体；iv）、权利要求8所述的制备方法制得的含有所述类外泌体的混合物。10.权利要求7所述的类外泌体或权利要求8所述的制备方法制得的含有所述类外泌体的混合物作为运载载体在制备药物中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用。本发明通过将携带miR394的重组载体导入微拟球藻，构建了微拟球藻工程菌株，试验结果表明，所述微拟球藻工程菌株具有较高的脂质合成和分泌，且虾青素含量也显著提高，所述菌株作为运载载体或虾青素的生产菌株，和其分泌的脂滴（类外泌体）作为运载载体，可广泛应用于食品、化妆品、药品等领域。药品等领域。药品等领域。


技术研发人员：李达伟 李宏业 黄丹 成彩琴 杨嘉欣 杨维东 吴思伟
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：2023.09.01
技术公布日：2023/10/7