用于模拟牙胚发育中细胞甲基化修饰的力学作用的加力装置、阴模及模具

1.本发明涉及甲基化修饰领域，具体涉及用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置、阴模及模具。


背景技术：

2.目前公开了一些关于细胞力学环境调控m6a甲基化修饰的研究，例如通过单细胞测量法等方法研究m6a修饰与力学信号的相互作用。然而，这些技术往往需要大量手动操作，操作难度大、工作效率低，且精度和稳定性存在局限性。同时，现有技术也难以完全模拟组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响，其结果也难以在实际生物学研究中得到广泛应用。
3.此外，也有一些研究利用微流控技术制备细胞球，并通过荧光染色或其他方法对m6a修饰进行检测。例如，中国专利申请cn112387317a公开了一种快速检测血清septin 9甲基化的微流控液滴芯片，从上至下由第一盖片、第一pdms盖片、第二pdms盖片、第三pdms盖片、基片堆叠而成，第二pdms盖片上设有检测结构，检测结构包括油相储液池、水相储液池、液滴池，油相储液池利用油液连接通道与流体控制阀相连，水相储液池利用水相连接通道也与流体控制阀相连，流体控制阀的另一端与液滴池相连，液滴池利用气孔连接通道与气孔相连。不过微流控技术的操作仍然较为繁琐，需要涉及多个步骤和仪器设备，且存在样本损失的问题。同时，微流控技术难以模拟组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响，其结果也可能存在偏差。
4.因此，目前仍需设计一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种简便的装置来模拟组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响，实现了对细胞的高通量处理和精确控制，具有更高的准确性和可靠性。具体地，本发明包括如下内容。
6.本发明的第一方面，提供一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其包括底座和设置底座的至少一个加压柱，所述底座沿水平方向进行配置，所述加压柱设置为在垂直或大致垂直于所述底座的方向上与所述底座连接的弹性件。
7.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其中，进一步包括夹具，所述夹具包括夹具本体和紧固件。
8.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其中，所述夹具本体包括第一夹板、第二夹板和位于所述第一夹板和第二夹板之间用于连接两者的连接板。
9.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其中，所述第一夹板设置有通孔，其用于使紧固件的至少一部分能够通过所述通孔。
10.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其中，所述紧固件和通孔之间分别设置有螺纹，并通过螺纹使紧固件相对于本体移动。
11.本发明的第二方面，提供一种用于制备本发明所述的细胞球加力装置的多通量阴模，其包括：壳体、第一容纳腔、第二容纳腔和间隔部，其中：所述第一容纳腔沿水平方向进行配置，从而形成所述阴模的顶部容纳空间；所述第二容纳腔设置为从顶部向底部凹陷，从而以垂直或大致垂直于所述顶部的方向的方式形成至少一个孔结构；所述间隔部的至少一部分形成所述孔结构的侧壁。
12.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量阴模，其中，所述阴模为包含四氟乙烯单元的聚合物材料。
13.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量阴模，其中，所述间隔部一体成型。
14.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量阴模，其中，所述孔结构为上下贯通式的通孔。
15.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量阴模，其中，所述孔结构形成矩阵结构。
16.本发明的第三方面，提供一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量模具，其中，其包括本发明所述的细胞球加力装置和与所述细胞球加力装置中的弹性件相配合的孔板。
17.在某些实施方案中，根据本发明所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量模具，其中，所述孔板中含有细胞球和载体，其中，通过所述弹性件将施加的压力传递至所述细胞球。
18.本发明的第四方面，提供一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的方法，其包括使用本发明所述的细胞球加力装置的步骤，其中，当所述紧固件靠近并以垂直或大致垂直于所述多通量模具底座的方向向所述底座施加压力时，其每移动1mm，则通过所述加压柱向所述细胞球传递的压力为10-20kpa。
19.本发明的技术效果包括但不限于：本发明利用pdms柱的弹性柔韧性，改变pdms柱的形变量，为体外三维培养在水凝胶中的各细胞球提供可控制的可重复的静态的应力变化，模拟组织力学异质性微环境，为检测力学调控牙胚发育提供了重要装置。同时，通过模拟计算得到pdms柱子形变下压的不同高度对水凝胶中细胞球所受的压力数值，从而实现精确调节细胞球所受到的力。此外，本发明的加力装置撤销后，细胞可继续培养，亦可进行后续的分子生物实验，通过显微摄像以及计算机图像处理技术对细胞生长及形态变化进行观测与分析。本发明可广泛应用于生物力学、细胞力学及生物学研究领域。
20.此外，本发明还具有以下优点：(1)提高了牙齿形态的调控能力，通过本发明提供
的细胞球加力装置，可以模拟组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响，从而调控牙齿形态的发育过程；(2)提高了牙齿发育的研究效率，使用本发明的装置可以在较短的时间内对牙胚发育过程中rna甲基化修饰的变化进行分析，大大提高研究的效率；(3)提高了牙齿形态调控的准确性，本发明使用pdms柱施加一定的压力来模拟组织力学异质性微环境，可以精确地控制细胞球所受的压力，从而提高了牙齿形态调控的准确性；(4)提高了牙齿疾病的研究水平，本发明的技术方案可以用于研究牙齿形态发育的过程，从而对牙齿疾病的发病机制进行深入研究，为预防和治疗牙齿疾病提供理论基础和技术支持。
附图说明
21.图1以六孔板为例示出了阴模的结构示意图。
22.图2以六孔板为例示出了模具的结构示意图。
23.图3-4示出了本发明的模拟发育中力学作用的加力夹具的结构示意图。
24.图5示出了本发明制备的细胞球-水凝胶悬液。
25.图6-7示出了不同下压高度的凝胶内部受力模拟图。
26.图8示出了不同机械强度(即培养在不同压缩模量的甲基丙烯酰化明胶中)受力中细胞球伸展程度与m6a甲基化修饰水平。
27.附图标记说明：1-壳体、2-第一容纳腔、3-第二容纳腔、4-间隔部、5-底座、6-加压柱、7-夹具、8-第一夹板、9-第二夹板、10-连接板、11-紧固件、12-孔板。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。
30.另外，在说明书和权利要求书中的术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、
ꢀ“
顶部”、
ꢀ“
底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。应当理解，如此使用的术语在适当条件下可替换，并且本文所描述的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或例示的其他取向进行操作。
31.本发明中，“相对于某一部件移动”是指部件沿另一部件进行相对运动的过程，例如部件相对于另一部件靠近或远离的过程。
32.多通量阴模本发明的多通量阴模用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用，其包括：壳体、第一容纳腔、第二容纳腔和间隔部。
33.本发明中，用于壳体和间隔部的材料为包含四氟乙烯单元的聚合物材料，优选为聚四氟乙烯高分子聚合物材料。第一容纳腔沿水平方向进行配置，从而形成所述阴模的顶
部容纳空间。所述第二容纳腔设置为从顶部向底部凹陷，从而以垂直或大致垂直于所述顶部的方向的方式形成至少一个孔结构，孔结构的数量不特别限定，可以是1、6、12、24、48、96、384等，孔结构优选为圆柱形。
34.本发明中，所述间隔部的至少一部分形成所述孔结构的侧壁，当本发明的孔结构以阵列或矩阵形式设置时，间隔部用于间隔所述第二容纳腔的多个孔结构。
35.在一个优选的实施方案中，孔结构为上下贯通式的通孔，孔结构的直径为1-2mm，优选为1.4-1.6mm，还优选为1.5mm。孔结构的高度为1.5-2.5mm，优选为1.5-2.0mm，如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm。
36.细胞球加力装置本发明中，用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置通过将有机高分子聚合物和固化剂在根据本发明所述的阴模内经固化、脱模得到。有机高分子聚合物优选为硅氧烷类高分子聚合物。在一个优选的实施方案中，硅氧烷类高分子聚合物为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，本文有时简称为“pdms”)。固化剂可以采用本领域已知的任何类型的固化剂，对此不特别限定。固化温度和时间不特别限定，可以根据需要进行调整。
37.有机高分子聚合物和固化剂的比例为5-20：1，优选为5-15：1，还优选为8-12：1。固化温度为80-200℃，优选为80-150℃，还优选为80-120℃。固化时间为0.5-2h，优选为0.8-1.5h，还优选为1-1.5h。
38.本发明中，细胞球加力装置通过弹性材料介导将外部压力传递至承载细胞或细胞球的载体，由此使载体内部不同位置的细胞或细胞球受力更加均匀，并且可以精确地控制细胞或细胞球的压力大小。载体的实例不限定，只要能够承受90kpa以下优选70kpa以下，更优选5-50kpa，如10kpa、15kpa、20kpa、25kpa、30kpa、35kpa、40kpa或50kpa的压强而不破损的材料即可。在一个优选的实施方案中，所述载体为水凝胶。
39.本发明中，优选通过专用加压装置施加外部压力。其中加压装置中至少与水凝胶接触的部分为弹性材料。示例性的加压装置包括底座和设置底座的至少一个加压柱。优选地，底座具有与培养孔板相配套的结构，例如可以设计为能够盖住培养孔板上方。加压柱设置为能够自由地进出所述培养孔，优优选地，加压柱为圆柱状，且其直径略小于培养孔的直径。需要说明的是，加压柱的形状可以是任意形状，而不仅仅限定于圆柱状。加压柱的数量不限定，优选地，其数量与培养孔板中孔的数量一致，且加压柱在底座的位置设置为当底座加盖于培养孔板上方时，各加压柱能够分别对应于培养孔板中的一个孔，加压柱的数量可以是1、6、12、24、48、96、384等。
40.在示例性实施方案中，加压装置进一步包括夹具，其包括夹具本体和紧固件。夹具本体包括第一夹板、第二夹板和设计于两夹板之间用于连接两者的连接板。本发明中，夹具本体大致具有“口”字型或“匚”字型结构，其材质不特别限定，可以是塑料、合金、树脂、橡胶或金属等材质。第一夹板设置有通孔，用于使紧固件的至少一部分能够通过该通孔。紧固件和通孔之间分别设置有螺纹，并通过螺纹使紧固件相对于本体移动。优选地，紧固件的一端设置为平面状，从而有利于向底座均匀加压。夹具中通孔及其对应的紧固件数量不限，可以是一组，也可以是多组。另外，加压装置中夹具的数量不限定，可以根据需要而选择。示例性地，夹具的数量与培养孔板的数量一致。培养孔板可以是现有技术中已知的标准孔板，例如
标准规格和尺寸的24、96孔板等。
41.多通量模具本发明进一步提供一种多通量模具，其包括本文所述的细胞球加力装置和与所述细胞球加力装置中的弹性件相配合的孔板。
42.本发明中，所述孔板中含有细胞球和承载所述细胞球的载体，所述紧固件将施加的压力通过加压柱传递至位于载体中的细胞球。载体的类型不特别限定，可以是明胶、琼脂等材料，并可以添加细胞外基质等成分以模拟组织环境。在一个优选的实施方案中，载体材料为凝胶，还优选为甲基丙烯酰水凝胶。凝胶的浓度为1-20%，优选为1-10%，还优选为5-10%。
43.本发明中，细胞球包括单个细胞、聚集的细胞等，且可以来源于不同种类的细胞，对此不特别限定。
44.在一个优选的实施方案中，所使用的凝胶具有0.1-10 kpa的压缩模量，优选具有1-10 kpa的压缩模量，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10kpa。
45.用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的方法本发明还提供一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的方法，其包括使用本文所述的细胞球加力装置的步骤，其中，当所述紧固件靠近并以垂直或大致垂直于所述多通量模具底座的方向向所述多通量模具施加压力时，即，当所述紧固件向下每移动1mm，则通过所述加压柱向所述细胞球传递的压力为10-20kpa。
46.对细胞培养方法不特别限定，培养模式可为静态压力培养，也可以为动态压力培养，培养时间可控，加力装置撤销后，细胞可继续培养，亦可进行后续的分子生物实验，通过显微摄像以及计算机图像处理技术对细胞生长及形态变化进行观测与分析。
实施例1
47.图1以六孔板为例示例性的示出了多通量的pdms柱的阴模制备。
48.由聚四氟乙烯(ptfe)可以按照各型标准孔板尺寸进行制备。ptfe具有抗酸抗碱抗各种有机溶剂的特点，几乎不溶于所有的溶剂，常温常压下稳定。利用ptfe具有极佳的耐热性(使用工作温度可达到250℃)与良好的化学稳定性(与pdms在高温下不发生化学反应)，将ptfe作为制备pdms柱的模具材料。此外，ptfe是摩擦系数最低的固体材料，高度润滑，是表面张力最小的固体材料，不黏附任何物质，脱模性佳，易脱模，可重复使用。
49.阴模由cad/cam制作而成，其包括：壳体1、第一容纳腔2、第二容纳腔3和间隔部4。做成上下贯通式的阴模。一部分按照测量出的各型标准孔板的孔径、高度、孔距、边距尺寸制作，灌注出柱子外形；一部分是围栏式矩形，灌注出连接柱子的底座。
实施例2
50.本实施例示出了多通量的细胞球加力装置的制备，其由聚二甲基硅氧烷有机高分子聚合物制作而成，pdms材料具有弹性、疏水、透明、透气、化学惰性的性质，可用于细胞培养、细胞捕获等相关的实验。此外，其还具有精细的高分辨率制造性能，表面张力低，脱模性佳，可用于模具准确外形尺寸制作。
51.将pdms主剂和固化剂两组分按照10：1的比例混合均匀，真空除气后，缓慢倒入由
聚四氟乙烯制作的阴模内。在干燥烘箱内100℃下放置1h固化，室温冷却后脱模。
52.如图2所示，所述细胞球加力装置包括底座5和至少一个加压柱6，其中，所述底座5沿水平方向进行配置，所述加压柱6以垂直或大致垂直于所述底座5的方向设置于所述底座5上。其中，至少一部分来自加压柱6或全部的加压柱6设置为弹性件，其与培养孔板中的凝胶进行接触。
实施例3
53.本实施例示出了模拟发育中力学作用的加力夹具7，其具有稳定的夹具本体和可调节pdms下压距离的紧固件11，所述紧固件11为具有螺丝结构的固位件，其可用于夹持住底座和加压柱和孔板12，并对孔板12内细胞球施加稳定的力(如图3-4所示)。
54.夹具本体包括第一夹板8、第二夹板9和位于所述第一夹板8和第二夹板9之间用于连接两者的连接板10。
实施例4
55.本实施例示出了用于模拟组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响，包括以下步骤。
56.1.制备浓度为5%的甲基丙烯酰水凝胶(gelatin methacryloyl, gelma), glema30压缩模量约1kpa，glema60压缩模量约3.5kpa，glema90压缩模量约5kpa，将细胞球均质培养于其中。
57.(1)用stemcell品牌的aggrewell 24孔板(每个孔内有1200个微孔，每个微孔的尺寸约400μm)制备细胞球；每个孔内接种1.2*106个根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, scap)，即一个微孔内约含1000个细胞，形成一个细胞球。
58.(2)将37
°
c预热的浓度为 10 % (w/v)的水凝胶溶液，与等体积细胞球悬液混匀，制备成5 % (w/v)细胞球-水凝胶悬液(图5)。
59.(3)向装置孔板内加入1ml细胞球-水凝胶悬液(以24孔板为例)。
60.(4)405nm紫外光源照射悬液30s，交联固化形成具有一定强度的三维结构。
61.(5)细胞球-凝胶块孔内加入新鲜的培养基，于37℃孵箱内，5% co2环境下进行细胞培养。
62.2.制备pdms模具，利用pdms柱下压，施加所需的压力于凝胶中的细胞球。
63.(1)将pdms主剂和固化剂两组分按照10：1的比例混合均匀，真空除气后，缓慢倒入由聚四氟乙烯制作的阴模内(以配套24孔板的阴模为例，阴模每孔底面直径为1.5mm，每孔高度为1.8mm)；(2)在干燥烘箱内100℃下放置1h固化，室温冷却后脱模；(3)pdms柱放置在细胞球-凝胶块之上，利用pdms柱下压，施加压力于凝胶中的细胞球；(4)通过调节使pdms柱子下压高度的固位加压装置，来调节对细胞球-凝胶块的压力大小，力通过pdms柱子传递给凝胶块中的细胞球，图6和7示出了不同下压高度的凝胶内部受力模拟图。
64.3.在所述施加压力的条件下，收集细胞球进行m6a甲基化修饰的检测。
65.(1)按照免疫荧光的方法，对对照组和实验组的细胞球进行免疫荧光染色，检测不同机械强度(即培养在不同压缩模量的甲基丙烯酰化明胶中)受力中细胞球伸展程度与m6a甲基化修饰水平(图8)。
66.4.通过数据分析，研究组织力学异质性微环境对细胞m6a甲基化修饰的影响。
67.结果表明同样压缩模量的水凝胶中，加压组细胞球比不加压组伸展范围减小，去甲基化酶上调，甲基化酶下调。与此同时，比较低压缩模量、中压缩模量、高压缩模量水凝胶中细胞球，发现越高压缩模量水凝胶中的细胞球伸展范围减小，m6a甲基化修饰的去甲基化酶上调，甲基化酶下调。
68.尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

技术特征：
1.一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其特征在于，包括底座和设置底座的至少一个加压柱，所述底座沿水平方向进行配置，所述加压柱设置为在垂直于所述底座的方向上与所述底座连接的弹性件。2.根据权利要求1所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其特征在于，进一步包括夹具，所述夹具包括夹具本体和紧固件。3.根据权利要求2所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其特征在于，所述夹具本体包括第一夹板、第二夹板和位于所述第一夹板和第二夹板之间用于连接两者的连接板。4.根据权利要求3所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其特征在于，所述第一夹板设置有通孔，其用于使紧固件的至少一部分能够通过所述通孔。5.根据权利要求4所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的细胞球加力装置，其特征在于，所述紧固件和通孔之间分别设置有螺纹，并通过螺纹使紧固件相对于本体移动。6.一种用于制备权利要求1-5任一项所述的细胞球加力装置的多通量阴模，其特征在于，包括：壳体、第一容纳腔、第二容纳腔和间隔部，其中：所述第一容纳腔沿水平方向进行配置，从而形成所述阴模的顶部容纳空间；所述第二容纳腔设置为从顶部向底部凹陷，从而以垂直于所述顶部的方向的方式形成至少一个孔结构；所述间隔部的至少一部分形成所述孔结构的侧壁。7.根据权利要求6所述的多通量阴模，其特征在于，所述间隔部一体成型。8.根据权利要求7所述的多通量阴模，其特征在于，所述孔结构为上下贯通式的通孔。9.一种用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量模具，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的细胞球加力装置和与所述细胞球加力装置中的弹性件相配合的孔板。10.根据权利要求9所述的用于模拟牙胚发育中细胞m6a甲基化修饰的力学作用的多通量模具，其特征在于，所述孔板中含有细胞球和载体，其中，通过所述弹性件将施加的压力传递至所述细胞球。

技术总结
本发明提供用于模拟牙胚发育中细胞甲基化修饰的力学作用的加力装置、阴模及模具。本发明为体外三维培养在水凝胶中的各细胞球提供可控制的可重复的静态的应力变化，通过模拟组织力学异质性微环境，为检测力学调控牙胚发育提供了重要装置。同时，本发明能够实现精确调节细胞球所受到的力。此外，本发明的加力装置撤销后，细胞可继续培养，亦可进行后续的分子生物实验，通过显微摄像以及计算机图像处理技术对细胞生长及形态变化进行观测与分析。本发明的装置可广泛应用于生物力学、细胞力学及生物学研究领域。生物学研究领域。生物学研究领域。


技术研发人员：陈晨 杨玥 邓旭亮 卫彦 李玲君 罗春雄 王淑静 高峥嵘 姚玮彤 周团锋
受保护的技术使用者：北京大学口腔医学院
技术研发日：2023.08.28
技术公布日：2023/10/7