一种改性磁性纳米分子筛材料及其制备方法和在囊泡吸附中的应用与流程

1.本发明涉及磁性纳米分子筛材料技术领域，具体涉及一种改性磁性纳米分子筛材料及其制备方法和在囊泡吸附中的应用。


背景技术：

2.细胞外囊泡(evs)是由细胞主动分泌释放的异质性膜结合磷脂囊泡。evs可根据其生物发生过程、大小和生物物理性质进一步分类为：外泌体、微囊泡和凋亡小体。近年来，evs越来越多地被认为是细胞间通信及疾病诊断与预后的循环生物标志物的重要载体。然而，evs异质性大、在临床相关样本中含量较低，并且难以量化使得evs的分离和分析存在较大挑战。传统的密度梯度超速离心、超速离心法以及分子排阻法等存在所需样本量、步骤繁琐且操作时常长、所分离得到的囊泡纯度低且有高丰度蛋白污染等问题，不利于利用应用。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明针对囊泡分离中的问题，提出了一种改性磁性纳米分子筛材料及其制备方法和在囊泡吸附中的应用。本发明所提出的磁性纳米分子筛的改性方法，首先利用强碱在分子筛表面造就缺陷，降低硅铝比，从而增强了铝和囊泡上磷酸基团的配位作用；然后利用通过带正电的季铵阳离子在有缺陷的磁性纳米分子筛表面自组装，赋予磁性纳米分子筛正电性，进一步增强了磁性纳米分子筛的亲脂性、以及与负电性的囊泡结构之间的静电作用。此外，冰水浴的碱处理方法保证了磁性纳米分子筛的磁性以及晶体结构未受到明显影响。因此，本发明所提出的磁性纳米分子筛的改性方法显著增强了囊泡结构的吸附，且适用于着各种各样的样本类型，所需样本量是传统超速离心的1/10，为囊泡分离提供了一种简单、快速、高效的技术方法。
4.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
5.第一方面，本发明提供了一种改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，包括以下步骤：
6.一种改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，包括以下步骤：
7.1)将磁性纳米分子筛材料分散在强碱性溶液中，在冰浴条件下进行超声处理后，磁分离弃上清得到沉淀a；
8.2)向沉淀a中加入季铵盐水溶液，在20～40℃搅拌反应，经洗涤后，干燥，获得表面改性的磁性纳米分子筛材料。
9.优选的，步骤1)中，所述强碱性溶液的碱源为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙中的一种或多种；所述强碱性溶液的溶度为0.1m～1m；固体用量以g计时，液体用量以ml计，所述磁性纳米分子筛材料与强碱溶液的比例为1：50～500；所述冰浴超声的时间为10min～6h，功率为40-80khz。
10.优选的，步骤2)中，所述季铵盐水溶液中的季铵盐为十六烷基三甲基溴化铵、十六
烷基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三乙基溴化铵中的一种或多种；季铵盐水溶液的浓度为0.12m～1m；季铵盐水溶液中季铵盐与步骤1)中强碱性溶液中强碱的摩尔比为1～1.2；所述搅拌反应的时间为2h～6h；所述洗涤是依次水洗、醇洗、水洗，循环若干次；其中，醇洗的醇源为乙醇或甲醇，所述水洗，醇洗，水洗作为一次循环，循环洗涤3～6次。
11.优选的，步骤1)中，所述磁性纳米分子筛材料主要由以下方法制备：
12.取柠檬酸钠改性的fe3o4加入去离子水中，分散均匀，之后加入碱源，完全溶解；继续加入模板剂、稳定剂与表面活性剂，搅拌溶解；继续加入硅源和碱金属源，溶解后于室温晶化，之后水热晶化，水热结束后，通过过滤，洗涤，干燥，煅烧，即可得到磁性纳米分子筛。
13.进一步优选的，所述的柠檬酸钠改性的fe3o4的颗粒尺寸为10～500nm；所述的碱源为氨水、碱金属化合物、碱土金属化合物、尿素、季胺碱化合物、脂肪胺中的一种或多种；所述的模板剂为三乙胺，二正丙胺，二异丙胺，四丙基氢氧化铵中的一种或多种；所述稳定剂为乙醇，异丙醇，丙三醇、乙二醇中的一种或多种；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基二甲基苄基氯化铵中的一种或多种；所述硅源为正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四正丙酯、正硅酸四正丁酯、硅溶胶、水玻璃、硅藻土中的一种或多种；所述碱金属源为偏铝酸钠，氯化铝，硫酸铜，氯化铜，硫酸锌，氯化锌中的一种或多种。
14.进一步优选的，所述fe3o4，碱源，模板剂，稳定剂，表面活性剂，硅源，碱金属源的质量比为1:(2～20):(0.1～10):(0.05～5):(0.01～3):(20～100):(1～20)；所述室温晶化时长为1～6h，所述水热晶化的温度为100～200℃，时长为24～120h。
15.第二方面，本发明提供了一种改性磁性纳米分子筛材料，由上述制备方法制得。
16.第三方面，本发明提供了所述的改性磁性纳米分子筛在囊泡吸附中的应用。
17.第四方面，本发明提供了利用所述改性磁性纳米分子筛吸附囊泡的方法，包括以下步骤：
18.1)向待处理样本中加入缓冲液和表面改性的磁性纳米分子筛，得到混悬液；
19.2)将所述混悬液震荡孵育后，进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
20.3)加入清洗缓冲液洗涤沉淀，所得沉淀即为表面改性的磁性纳米分子筛及其所吸附的囊泡结构的混合物；
21.4)对目标蛋白质组或目标蛋白进行检测。
22.优选的，步骤1)中，所述的样本类型选自血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清或细胞上清液；固体用量以mg计时，液体用量以ml计，所述表面改性的磁性纳米分子筛材料和待测样本的比例为1：(0.005～10)；
23.优选的，步骤1)中，所述结合缓冲液的成分包括tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙酸、edta、sds、np-40、chaps、吐温、triton、peg、乙腈、甲醇的中的一种或任意组合，优选为tris、edta的组合缓冲液。
24.优选的，步骤2)中，所述震荡孵育的条件为：18～37℃，500～2000rpm，孵育1～120min；所述置于磁力架上，放置时间为1～5min；
25.优选的，步骤3)中，所述清洗缓冲液选自步骤1)所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述洗涤沉淀3次，过程为：加入清洗缓冲液，室温震荡3min，将样本置于磁力架上磁分离2min后，弃上清，保留沉淀；重复以上过程3次。
26.优选的，步骤4)中，对目标蛋白检测的手段包括：质谱、ihc、elisa、western blot、化学发光中的一种或几种，优选质谱。
27.有益效果：
28.1.本发明所提出的磁性纳米分子筛的改性方法，首先利用强碱在分子筛表面造就缺陷，降低硅铝比，从而增强了铝和囊泡上磷酸基团的配位作用；然后利用通过带正电的季铵阳离子在有缺陷的磁性纳米分子筛表面自组装，赋予磁性纳米分子筛正电性，进一步增强了磁性纳米分子筛的亲脂性、以及与负电性的囊泡结构之间的静电作用。
29.2.本发明所提出的磁性纳米分子筛的改性方法，冰浴条件下碱超声，降低了分子筛的硅铝比，且未对磁性纳米分子筛的晶体结构和磁性造成任何影响
30.3.本发明所改性的的磁性纳米分子筛材料显著增强了囊泡结构的吸附，有效解决了囊泡结构的分离和分析问题。
31.4.本发明方法应用范围广泛，适用于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清、细胞上清液等多种含有高丰度蛋白的样本。
32.5.本发明方法与传统的密度梯度超速离心、超速离心法以及分子排阻法对比，所需的样本量仅是传统方法的1/10，显著减少了样本的处理步骤和操作时长，并且有效解决了传统方法中囊泡纯度低、高丰度蛋白的干扰问题。
33.附图表说明
34.图1为磁性纳米分子筛和改性磁性纳米分子筛(均为实施例3所得)的扫描电子显微镜图片，其中，a.磁性纳米分子筛；b.表面改性后的磁性纳米分子筛。
35.图2为磁性纳米分子筛和改性磁性纳米分子筛(均为实施例3所得)的x射线衍射光谱的结果。
36.图3为与血浆样本孵育后，部分典型的囊泡结构特异性标志物在磁性纳米分子筛与改性磁性纳米分子筛的鉴定情况。
具体实施方式
37.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
38.实施例1
39.一种表面改性磁性纳米分子筛，由以下的步骤制得：
40.1)将10nm的fe3o4加入柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠溶液浓度为0.01mol/l，fe3o4与柠檬酸钠溶液的的质量比为1：1，超声分散均匀后，40℃油浴搅拌6h，之后磁分离，并用水洗涤3次，真空烘箱干燥得到柠檬酸钠改性的fe3o4。
41.2)取柠檬酸钠改性的fe3o4加入去离子水中，超声分散均匀，之后加入适量的氨水，fe3o4与氨水的质量比为fe3o4：氨水＝1:2。
42.3)向2)中加入适量模板剂二正丙胺，稳定剂乙醇，与表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，搅拌或超声溶解；以fe3o4的用量作为对比，所述模板剂，稳定剂，表面活性剂的质量比为fe3o4：模板剂：稳定剂：表面活性剂＝1:0.1:0.05:0.01。
43.4)向3)加入适量的硅源正硅酸四甲酯和碱金属源氯化铝，以fe3o4的用量作为对比，所述硅源，碱金属源的质量比为fe3o4：硅源：碱金属源＝1:20:1，搅拌溶解后，于室温晶
化1h，置于聚四氟乙烯内衬中，放入水热釜中，100℃水热晶化120h，水热结束后，通过过滤，洗涤，干燥，煅烧即可得到磁性纳米分子筛。
44.5)取4)中得到的磁性纳米分子筛材料3g，将其分散在500ml的0.1m的氢氧化钾溶液中，在冰浴条件下、40khz超声6h，磁分离弃上清得到沉淀a；
45.6)向沉淀a中加入500ml浓度为0.12m的十六烷基三甲基溴化铵水溶液；在20℃搅拌反应6h，经水洗、甲醇洗、水洗后，循环3次后，干燥，获得表面改性后的磁性纳米分子筛材料。
46.实施例2
47.一种表面改性的磁性纳米分子筛，由以下步骤制得：
48.1)将500nm的fe3o4加入柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠溶液浓度为1mol/l，fe3o4与柠檬酸钠溶液的的质量比为1：100，超声分散均匀后，100℃油浴搅拌0.5h，之后磁分离，并用水洗涤3次，真空烘箱干燥得到柠檬酸钠改性的fe3o4。
49.2)取柠檬酸钠改性的fe3o4加入去离子水中，超声分散均匀，之后加入适量的尿素，并超声至碱源完全溶解，fe3o4与碱源的质量比为fe3o4：碱源＝1:20。
50.3)向2)中加入适量模板剂二异丙胺，稳定剂丙三醇，与表面活性剂十八烷基二甲基苄基氯化铵，搅拌或超声溶解；以fe3o4的用量作为对比，所述模板剂，稳定剂，表面活性剂的质量比为fe3o4：模板剂：稳定剂：表面活性剂＝1:10:5:3。
51.4)向3)加入适量的硅源正硅酸四乙酯和碱金属源硫酸铜，以fe3o4的用量作为对比，所述硅源，碱金属源的质量比为fe3o4：硅源：碱金属源＝1:100:20，搅拌溶解后，于室温晶化6h，置于聚四氟乙烯内衬中，放入水热釜中，200℃水热晶化24h，水热结束后，通过过滤，洗涤，干燥，煅烧即可得到磁性纳米分子筛。
52.5)取4)中得到的磁性纳米分子筛材料3g，将其分散在150ml的1m的氢氧化钠溶液中，在冰浴条件下、80khz超声10min，磁分离弃上清得到沉淀a；
53.6)向沉淀a中加入150ml浓度为1m的苄基三乙基氯化铵水溶液；在40℃搅拌反应30min，经水洗、乙醇洗、水洗后，循环3次后，干燥，获得表面改性后的磁性纳米分子筛材料。
54.实施例3
55.材料制备
56.1)称取0.5g 20nm的fe3o4加入200ml 0.1mol/l的柠檬酸钠溶液中，超声分散均匀后，80℃油浴搅拌1.5h，之后磁分离，并用去离子水洗涤3次，60℃真空烘箱干燥6h得到柠檬酸钠改性的fe3o4。
57.2)取0.5g柠檬酸钠改性的fe3o4加入30ml去离子水中，超声分散均匀，之后加入2g naoh并超声至naoh完全溶解。
58.3)向2)中加入三乙胺0.25g，异丙醇0.1g，十二烷基硫酸钠0.15g，超声至固体完全溶解。
59.4)向3)中加入偏铝酸钠3g，搅拌溶解，加入硅溶胶30g，搅拌溶解，室温晶化1h，水热150℃，72h，经过滤洗涤干燥煅烧即可获得磁性纳米分子筛材料。
60.5)取4)中得到的磁性纳米分子筛材料3g，将其分散在300ml的0.1m的氢氧化钠溶液中，在冰浴条件下、80khz超声60min，磁分离弃上清得到沉淀a；
61.6)向沉淀a中加入300ml浓度为0.12m的十六烷基三甲基氯化铵水溶液；在25℃搅
拌反应4h，经水洗、乙醇洗、水洗后，循环3次后干燥，获得表面改性的磁性纳米分子筛材料。
62.7)作为对比1：制备仅强碱处理的磁性纳米分子筛材料：取4)中得到的磁性纳米分子筛材料3g，将其分散在300ml的0.1m的氢氧化钠溶液中，在冰浴条件下、80khz超声60min，磁分离弃上清得到沉淀a；并用水洗、乙醇洗、水洗后，循环3次后干燥，得到仅强碱处理的磁性纳米分子筛材料，记为磁性纳米分子筛材料-强碱。
63.8)作为对比2：制备仅季铵盐处理的磁性纳米分子筛材料：取4)中得到的磁性纳米分子筛材料3g，将其分散在300ml浓度为0.12m的十六烷基三甲基氯化铵水溶液；在25℃搅拌反应4h，经水洗、乙醇洗、水洗后，循环3次后干燥，获得仅季铵盐处理的磁性纳米分子筛材料，记为磁性纳米分子筛材料-季铵盐。
64.血浆样本的囊泡吸附及液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测
65.1)取4份100μl的血浆样本，分别加入0.5mg磁性纳米分子筛(实施例3所得)、0.5mg改性磁性纳米分子筛(实施例3所得)、0.5mg磁性纳米分子筛-强碱(实施例3所得)、0.5mg磁性纳米分子筛-季铵碱(实施例3所得)；之后分别向其中加入300μl缓冲液，得到混悬液；
66.2)将所述混悬液在室温下1000rpm震荡孵育15min，之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
67.3)向上述沉淀中加入500μl清洗缓冲液，1000rpm震荡3min,之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
68.4)向上述沉淀中加入一定体积含有dtt的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1h；之后加入一定体积iam，避光室温反应45min。
69.5)加入10μl含有碳酸氢铵的消化缓冲液及1μg胰蛋白酶，混匀，37℃酶解4h。
70.6)加入过量甲酸溶液，12,000g离心5分钟，收集上清液加入sdb除盐柱，离心，使酶解后肽段结合于sdb柱上。
71.7)清洗sdb柱数次并解吸附，得到纯化后的肽段溶液。
72.8)冻干纯化后的肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段。
73.9)肽段使用纳升级高效液相色谱(thermo scientific ultimate 3000uhplc)串联质谱(thermo scientific orbitrap q exactive hf mass spectrometer)，进行30分钟有效梯度的dia数据采集。
74.10)使用dia-nn软件(1.8.1版本)进行抽提，获得蛋白定性定量结果；对3个不同来源血浆样品进行相同处理，每个样品3个平行实验。鉴定到的蛋白数如表1所示，图3展示了部分囊泡结构的典型marker在各组的质谱定量值情况。
75.超速离心法提取血浆样本囊泡(包括外泌体)及lc-ms/ms检测
76.为了更好的与改性磁性纳米分子筛对比，本发明进行了传统的超速离心法提取囊泡结构(包括外泌体)，并进行了lc-ms/ms检测，具体的操作如下：
77.1)取5ml血浆样本2000g离心30min，去除大的细胞碎片和细胞器，收集上清液；然后将上清液在10000g离心30min，离心的沉淀作为大囊泡组分，上清液在100000g离心90min，弃上清，用pbs重悬沉淀并再次用100000g离心90min，弃上清，用100μl pbs重悬沉淀作为外泌体组分。
78.2)分别取20μl 1)中的大囊泡组分和外泌体组分，向其中一定体积含有dtt的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1h；之后加入一定体积iam，避光室温反应45min。之后进行“血浆样本
的囊泡吸附及液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测”中的步骤5)到步骤10)，即可得到超速离心法提取的大囊泡组分和外泌体组分的蛋白鉴定结果。
79.3)对3个不同来源血浆样品进行相同处理。鉴定到的蛋白数如表1中的“超速离心-大囊泡”和“超速离心-外泌体”所示，图3展示了部分囊泡结构的典型marker在2组的质谱定量值情况。
80.表1：血浆样本蛋白质鉴定数
[0081][0082]
尿液样本的囊泡吸附及液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)检测
[0083]
1)取1ml尿液样本，向其中加入0.5mg改性磁性纳米分子筛(实施例3所得)；之后加入200μl缓冲液，得到混悬液；
[0084]
2)将所述混悬液在室温下1000rpm震荡孵育15min，之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
[0085]
3)向上述沉淀中加入500μl清洗缓冲液，1000rpm震荡3min,之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；重复该过程3次；
[0086]
4)向上述沉淀中加入一定体积含有dtt的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1h；之后加入一定体积iam，避光室温反应45min。
[0087]
5)加入10μl含有碳酸氢铵的消化缓冲液及1μg胰蛋白酶，混匀，37℃酶解4h。
[0088]
6)加入过量甲酸溶液，12,000g离心5分钟，收集上清液加入sdb除盐柱，离心，使酶解后肽段结合于sdb柱上。
[0089]
7)清洗sdb柱数次并解吸附，得到纯化后的肽段溶液。
[0090]
8)冻干纯化后的肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段。
[0091]
9)肽段使用纳升级高效液相色谱(thermo scientific ultimate 3000uhplc)串联质谱(thermo scientific orbitrap q exactive hf mass spectrometer)，进行30分钟
有效梯度的dia数据采集。
[0092]
10)使用dia-nn软件(1.8.1版本)进行数据抽提，获得蛋白定性定量结果。
[0093]
11)在3个人员同时操作，对3个不同来源尿液样品进行处理，每个样品三个平行重复实验，鉴定到的蛋白数如表2所示：
[0094]
表2尿液蛋白质鉴定数
[0095] 人员1人员2人员3sample1-1451746044496sample1-2451945274533sample1-3443745144603sample2-1430844664412sample2-2446543004468sample2-3440244234398sample3-1479347014668sample3-2474946114592sample3-3470146294605
[0096]
细胞上清液的蛋白吸附及lc-ms/ms检测
[0097]
1)取1ml脑脊液样本，向其中加入0.5mg改性磁性纳米分子筛(实施例3所得)；之后加入200μl缓冲液，得到混悬液；
[0098]
2)将所述混悬液在室温下1000rpm震荡孵育15min，之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
[0099]
3)向上述沉淀中加入500μl清洗缓冲液，1000rpm震荡3min,之后置于磁力架上1min进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；重复该过程3次；
[0100]
4)向上述沉淀中加入一定体积含有dtt的缓冲液重悬沉淀，95℃反应1h；之后加入一定体积iam，避光室温反应45min。
[0101]
5)加入10μl含有碳酸氢铵的消化缓冲液及1μg胰蛋白酶，混匀，37℃酶解4h。
[0102]
6)加入过量甲酸溶液，12,000g离心5分钟，收集上清液加入sdb除盐柱，离心，使酶解后肽段结合于sdb柱上。
[0103]
7)清洗sdb柱数次并解吸附，得到纯化后的肽段溶液。
[0104]
8)冻干纯化后的肽段溶液，并使用上机缓冲液复溶肽段。
[0105]
9)肽段使用纳升级高效液相色谱(thermo scientific ultimate 3000uhplc)串联质谱(thermo scientific orbitrap q exactive hf mass spectrometer)，进行30分钟有效梯度的dia数据采集。
[0106]
10)使用dia-nn软件(1.8.1版本)进行数据抽提，获得蛋白定性定量结果。
[0107]
11)在3个人员同时操作，对3个不同来源尿液样品进行处理，每个样品三个平行重复实验，鉴定到的蛋白数如表3所示：
[0108]
表3细胞上清液蛋白质鉴定数
[0109] 人员1人员2人员3sample1-1515550905087sample1-2491749855076
sample1-3495250274983sample2-1508750025078sample2-2501551084901sample2-3498449725026sample3-1496949484892sample3-2489250765003sample3-3503149974903
[0110]
结论：
[0111]
1.通过图1可以看出，改性后的磁性纳米分子筛的表面更加粗糙；
[0112]
2.通过图2可以看出，改性后的磁性纳米分子筛的晶体结构未被破坏，且依旧有很好的结晶度；
[0113]
3.通过表1-3可以看出，改性后的磁性纳米分子筛对不同类型的生物样本均有优异的囊泡吸附效果；与磁性纳米分子筛相比(未改性)，蛋白鉴定数均有显著提高；
[0114]
4.通过表1和图3可以看出，与磁性纳米分子筛相比(未改性)、仅强碱处理的(磁性纳米分子筛-强碱)、和仅季铵盐(磁性纳米分子筛-季铵盐)处理的相比，经过我们工艺改性的磁性纳米分子筛的血浆蛋白鉴定数有一定程度的提高，且部分典型的囊泡结构特异性标志物的定量强度值显著升高。磁性纳米分子筛-强碱、磁性纳米分子筛-季铵盐的蛋白鉴定数和囊泡标志物强度均显著低于未经任何处理的磁性纳米分子筛。
[0115]
5.通过表1和图3可以看出，与传统的超速离心法提取囊泡结构的方法对比，经过我们工艺改性后的磁性纳米分子筛的血浆蛋白鉴定数大幅提高，部分典型的囊泡结构特异性标志物的定量强度值也显著升高。且改性磁性纳米分子筛的样本用量仅是超速离心法的1/10。
[0116]
6.通过表4可以看出，改性磁性纳米分子筛的硅铝比显著降低；
[0117]
表4磁性纳米分子筛和改性磁性纳米分子筛(均为实施例3所得)的icp-oes的结果
[0118] sio2al2o3na2o硅铝比磁性纳米分子筛74.416％24.328％1.256％5.2改性磁性纳米分子筛63.190％35.808％1.003％3

技术特征：
1.一种改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将磁性纳米分子筛材料分散在强碱性溶液中，在冰浴条件下进行超声处理后，磁分离弃上清得到沉淀a；2)向沉淀a中加入季铵盐水溶液，在20～40℃搅拌反应，经洗涤后，干燥，获得表面改性的磁性纳米分子筛材料。2.根据权利要求1所述的改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述强碱性溶液的碱源为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙中的一种或多种；所述强碱性溶液的溶度为0.1m～1m；固体用量以g计时，液体用量以ml计，所述磁性纳米分子筛材料与强碱溶液的比例为1：50～500；所述冰浴超声的时间为10min～6h，功率为40-80khz。3.根据权利要求1所述的改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述季铵盐水溶液中的季铵盐为十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三乙基溴化铵中的一种或多种；季铵盐水溶液的浓度为0.12m～1m；季铵盐水溶液中季铵盐与步骤1)中强碱性溶液中强碱的摩尔比为1～1.2；所述搅拌反应的时间为2h～6h；所述洗涤是依次水洗、醇洗、水洗，循环若干次；其中，醇洗的醇源为乙醇或甲醇，所述水洗，醇洗，水洗作为一次循环，循环洗涤3～6次。4.根据权利要求1所述的改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述磁性纳米分子筛材料主要由以下方法制备：取柠檬酸钠改性的fe3o4加入去离子水中，分散均匀，之后加入碱源，完全溶解；继续加入模板剂、稳定剂与表面活性剂，搅拌溶解；继续加入硅源和碱金属源，溶解后于室温晶化，之后水热晶化，水热结束后，通过过滤，洗涤，干燥，煅烧，即可得到磁性纳米分子筛。5.根据权利要求4所述的改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，所述的柠檬酸钠改性的fe3o4的颗粒尺寸为10～500nm；所述的碱源为氨水、碱金属化合物、碱土金属化合物、尿素、季胺碱化合物、脂肪胺中的一种或多种；所述的模板剂为三乙胺，二正丙胺，二异丙胺，四丙基氢氧化铵中的一种或多种；所述稳定剂为乙醇，异丙醇，丙三醇、乙二醇中的一种或多种；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基二甲基苄基氯化铵中的一种或多种；所述硅源为正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四正丙酯、正硅酸四正丁酯、硅溶胶、水玻璃、硅藻土中的一种或多种；所述碱金属源为偏铝酸钠，氯化铝，硫酸铜，氯化铜，硫酸锌，氯化锌中的一种或多种。6.根据权利要求4所述的改性磁性纳米分子筛材料的制备方法，其特征在于，所述fe3o4，碱源，模板剂，稳定剂，表面活性剂，硅源，碱金属源的质量比为1:(2～20):(0.1～10):(0.05～5):(0.01～3):(20～100):(1～20)；所述室温晶化时长为1～6h，所述水热晶化的温度为100～200℃，时长为24～120h。7.一种改性磁性纳米分子筛材料，由权利要求1-6任一项所述制备方法制得。8.权利要求7所述的改性磁性纳米分子筛在囊泡吸附中的应用。9.利用权利要求8所述的改性磁性纳米分子筛吸附囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)向待处理样本中加入缓冲液和表面改性的磁性纳米分子筛，得到混悬液；2)将所述混悬液震荡孵育后，进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；
3)加入清洗缓冲液洗涤沉淀，所得沉淀即为表面改性的磁性纳米分子筛及其所吸附的囊泡结构的混合物；4)对目标蛋白质组或目标蛋白进行检测。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的样本类型选自血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清或细胞上清液；固体用量以mg计时，液体用量以ml计，所述表面改性的磁性纳米分子筛材料和待测样本的比例为1：(0.005～10)；步骤4)中，采用质谱、ihc、elisa、western blot或化学发光法对目标蛋白质组或目标蛋白进行检测。

技术总结
本发明公开了一种改性磁性纳米分子筛材料及其制备方法和在囊泡吸附中的应用，所述制备方法包括以下步骤：1)将磁性纳米分子筛材料分散在强碱性溶液中，在冰浴条件下进行超声处理后，磁分离弃上清得到沉淀A；2)向沉淀A中加入季铵盐水溶液，在20～40℃搅拌反应，经洗涤后，干燥，获得表面改性的磁性纳米分子筛材料。本发明所制得的表面改性的磁性纳米分子筛材料可用于囊泡的吸附，吸附效果显著优于未改性的材料和传统的超速离心法，且样本需求仅是传统超速离心法的1/10；可应用于几乎所有的样本类型，有效解决了传统囊泡吸附方法的耗时且存在高丰度蛋白污染的问题。在高丰度蛋白污染的问题。在高丰度蛋白污染的问题。


技术研发人员：赵娜 马聪聪 李捷
受保护的技术使用者：谱天（天津）生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.09
技术公布日：2023/10/7