一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法。


背景技术：

2.螺旋藻含有必需脂肪酸（γ-亚麻酸）、多酚、色素、维生素（b1、b3等）、矿物质，以及碳水化合物以及高蛋白质含量。值得注意的是，从螺旋藻分离的生物活性化合物具有治疗特性，包括抗炎、抗氧化和抗菌活性。因此，螺旋藻生物质在食品、饮料、烘焙产品、乳制品、糖果、糖果等中得到大量的应用。藻蓝蛋白是螺旋藻产物中非常重要的一类，藻蓝蛋白是一种蓝色色素-蛋白质复合物，已被美国食品和药物管理局（fda）批准为天然蓝色食品着色剂。藻蓝蛋白因具有抗氧化、神经保护、抗炎和保肝特性而用于制药行业和功能性食品。相比于人工合成的氨基酸和蓝色色素，基于螺旋藻的蛋白质和藻蓝蛋白的质量和生物利用度更高。虽然市场对螺旋藻pc的需求不断增加，但螺旋藻生物质的培养和加工过程中仍存在一些挑战。最值得注意的是，在大规模种植过程中，成本密集性和目标产物产量低是经济可行性的主要制约因素。
3.微藻代谢物的生物合成可由一些非生物胁迫触发，同时改变微藻代谢物谱，从而实现具有成本效益和可持续的微藻衍生产品生产。盐度是微生物生长和生产力非常重要的影响因素。虽然非生物胁迫因素可以增加微藻代谢物的积累，但可能会抑制藻细胞的生长，甚至降低生物量浓度。目前，利用植物生长调节剂、化学诱导剂等工艺是降低生产成本，提高微藻生物量，增强微藻合成高附加值代谢产物的有效手段。甘氨酸甜菜碱是一种季铵盐化合物存在于微生物、植物和动物中。大量研究表明甘氨酸甜菜碱可以抵御各种形式的压力，包括盐度、营养缺乏、温度变化和干旱。在相容性溶质中，甘氨酸甜菜碱通过多种方式提高了细胞对各种非生物胁迫的耐受性，有效保护细胞生长和代谢物的积累。因此，外源添加甜菜碱对盐胁迫下螺旋藻生长和藻蓝蛋白产生可能具有正向作用。更重要的是，甘氨酸甜菜碱廉价易得，使用甘氨酸甜菜碱作为诱导剂具有经济效益。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供了一种盐胁迫联合甜菜碱提高螺旋藻生物量和藻蓝蛋白产量的方法，以解决现有技术因不利环境因素导致螺旋藻生物量低，进而无法提高藻蓝蛋白产率的问题。本发明方法为两阶段培养，首先利用光自养培养螺旋藻至对数生长期后期时收集藻细胞；再将氯化钠和甘氨酸甜菜碱添加至zarrouk培养基中，并持续通入空气在光照下培养螺旋藻，最后将培养到稳定期的藻细胞通过过滤分离法富集，提取藻蓝蛋白，整个操作过程简单易行。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
6.一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1、选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，待螺旋藻生长至对数生长
期后期，收集藻细胞作为放大培养所需的种子；步骤2、制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间；步骤3、将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，接入步骤1中所得螺旋藻种子液，然后加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间，对培养基提供光照进行培养，将培养到稳定期的藻细胞通过过滤分离法富集，提取藻蓝蛋白。
7.具体的，步骤1中所述选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，所述合适的培养基为采用不诱导盐胁迫的基础培养基。
8.进一步地，步骤1中培养螺旋藻的温度为20-35 ℃，光照为3000-9000 lux。
9.具体的，步骤s2中制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，或直接称取一定量的氯化钠添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间。
10.具体的，步骤3中将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，或不灭菌直接使用，接入步骤1中所得螺旋藻种子液。
11.进一步地，步骤3所述加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，或直接称取一定量的甘氨酸甜菜碱添加至螺旋藻基础培养基中，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间。
12.更进一步地，步骤3中所述对培养基提供光照进行培养，光照培养温度为10-40 ℃。
13.优选的，所述螺旋藻品种为钝顶螺旋藻或极大螺旋藻，包括但不仅限于节旋藻属和螺旋藻属物种。
14.需要说明的是，本发明还给出了藻细胞内藻蓝蛋白含量的检测方法，具体为：制备藻蓝蛋白：将按照上述技术方案得到的稳定期藻细胞培养液通过筛网进行过滤，并用蒸馏水反复洗涤2-3次后置于-80 ℃冷冻2 h以上后冻干；称取冻干后得到的干藻粉再加入0.1mol/l磷酸缓冲液（ph=7），反复冻融3次后，离心得到藻蓝蛋白；用分光光度计测定615nm、652nm和720nm处的吸光度值，从而确定藻细胞内的藻蓝蛋白含量。
15.进一步的，所述筛网为300目孔径；反复冻融-20℃和4℃循环。
16.本发明的有益效果是：本发明操作简单易行，原材料为自己筛选的螺旋藻藻株可按常规方法培养。本发明利用光自养，再添加诱导因子诱导盐胁迫下的藻细胞积累藻蓝蛋白，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养；与只盐胁迫条件下培养相比发现，在盐胁迫条件下又外源添加甘氨酸甜菜碱可有效促进微藻细胞中藻蓝蛋白的积累，藻蓝蛋白含量有较大幅度的提升，藻细胞中最大蓝蛋白含量达到22.31 %，比对照组提高了106.38%，从而证明盐胁迫联合甘氨酸甜菜碱能够显著的促进螺旋藻的藻蓝蛋白积累。因此，在盐胁迫条件下，联合外源化学调控剂作用更有利于螺旋藻生长和藻蓝蛋白含量的积累。
附图说明
17.图1为本发明一种盐胁迫联合外源添加甘氨酸甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白方
法的流程图；图2为对照例1和实施例1至3的结果分析图。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例及图1对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
19.如图1所示，本发明提供了一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1、选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，待螺旋藻生长至对数生长期后期，收集藻细胞作为放大培养所需的种子；步骤2、制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间；步骤3、将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，接入步骤1中所得螺旋藻种子液，然后加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间，对培养基提供光照进行培养，将培养到稳定期的藻细胞通过过滤分离法富集，提取藻蓝蛋白。
20.具体的，步骤1中所述选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，所述合适的培养基为采用不诱导盐胁迫的基础培养基。
21.进一步地，步骤1中培养螺旋藻的温度为20-35 ℃，光照为3000-9000 lux。
22.具体的，步骤s2中制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，或直接称取一定量的氯化钠添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间。
23.具体的，步骤3中将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，或不灭菌直接使用，接入步骤1中所得螺旋藻种子液。
24.进一步地，步骤3所述加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，或直接称取一定量的甘氨酸甜菜碱添加至螺旋藻基础培养基中，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间。
25.更进一步地，步骤3中所述对培养基提供光照进行培养，光照培养温度为10-40 ℃。
对照例1
26.配制zarrouk培养基，作为螺旋藻的基本培养基；高压高温灭菌30min，接入螺旋藻，藻细胞浓度控制在0.45 g/l，向培养基中加入甘氨酸甜菜碱使其最终的浓度为0 μm，光照培养温度为28 ℃，光照强度为5500 lux，进行光照摇瓶培养。本对照例培养的螺旋藻最大藻蓝蛋白含量达到了10.81 %；最大生物量达到了2.04 g/l。
实施例1
27.配制zarrouk培养基，作为螺旋藻的基本培养基；高压高温灭菌30min，接入螺旋藻，藻细胞浓度控制在0.45 g/l，向培养基中加入甘氨酸甜菜碱使其最终的浓度为150 μm，
光照培养温度28 ℃，光照强度为5500 lux，进行光照摇瓶培养。本实施例培养的螺旋藻最大藻蓝蛋白含量达到了11.45 %；最大生物量达到了2.18 g/l。
实施例2
28.配制含有100 mm氯化钠的zarrouk培养基，作为螺旋藻的基本培养基；高压高温灭菌30min，接入螺旋藻，藻细胞浓度控制在0.45 g/l，向培养基中加入甘氨酸甜菜碱使其最终的浓度为0 μm，光照培养温度为28 ℃，光照强度为5500 lux，进行光照摇瓶培养。本对照例培养的螺旋藻最大藻蓝蛋白含量达到了16.24 %；最大生物量达到了1.88 g/l。
实施例3
29.配制含有100 mm氯化钠的zarrouk培养基，作为螺旋藻的基本培养基；高压高温灭菌30min，接入螺旋藻，藻细胞浓度控制在0.45 g/l，向培养基中加入甘氨酸甜菜碱使其最终的浓度为150 μm，光照培养温度为28 ℃，光照强度为5500 lux，进行光照摇瓶培养。本实施例培养的螺旋藻最大藻蓝蛋白含量达到了22.31 %；最大生物量达到了2.58 g/l。
30.将对照例1以及实施例1至3得到的培养液过滤富集，并以蒸馏水反复洗涤3次后冻干称重；添加0.1mol/l磷酸缓冲液（ph=7）至冻干藻粉中，反复冻融3次后，离心得到藻蓝蛋白。用分光光度计测定615nm、652nm和720nm处的吸光度值。藻蓝蛋白含量（mg/ml）=（a615-a720）-0.474 x（a652-a720））/5.34。
31.对比结果分析：如图2所示，结合盐胁迫和甘氨酸甜菜碱的诱导促进螺旋藻中藻蓝蛋白的积累，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养。且在盐胁迫条件下，藻细胞内藻蓝蛋白含量与对照组相比提高了50.23%，达到了16.24 %。外源甘氨酸甜菜碱联合盐胁迫条件下藻细胞藻蓝蛋白含量与对照组相比提高了106.38 %，达到了22.31 %，较正常的螺旋藻藻蓝蛋白含量有了大幅提高。
32.以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，待螺旋藻生长至对数生长期后期，收集藻细胞作为放大培养所需的种子；步骤2、制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间；步骤3、将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，接入步骤1中所得螺旋藻种子液，然后加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间，对培养基提供光照进行培养，将培养到稳定期的藻细胞通过过滤分离法富集，提取藻蓝蛋白。2.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤1中所述选择合适的培养基作为基础培养基培养螺旋藻，所述合适的培养基为采用不诱导盐胁迫的基础培养基。3.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤1中培养螺旋藻的温度为20-35 ℃，光照为3000-9000 lux。4.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤s2中制备高浓度氯化钠母液并将其添加至螺旋藻基础培养基中，或直接称取一定量的氯化钠添加至螺旋藻基础培养基中，使氯化钠终浓度保持在5-600 mmol/l之间。5.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤3中将步骤2所得培养基在115℃条件下进行30min高温高压灭菌，或不灭菌直接使用，接入步骤1中所得螺旋藻种子液。6.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤3所述加入用蒸馏水配制的甘氨酸甜菜碱母液，或直接称取一定量的甘氨酸甜菜碱添加至螺旋藻基础培养基中，使培养基中甘氨酸甜菜碱终浓度保持在5μmol/l
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150mmol/l之间。7.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：步骤3中所述对培养基提供光照进行培养，光照培养温度为10-40 ℃。8.根据权利要求1所述的一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，其特征在于：所述螺旋藻品种为钝顶螺旋藻或极大螺旋藻。

技术总结
本发明公开了一种盐胁迫联合甜菜碱促进螺旋藻积累藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：首先培养螺旋藻至对数生长期后期，收集藻细胞作为种子；再将一定量的氯化钠添加至螺旋藻培养基（例如Zarrouk培养基）中，使氯化钠浓度达到5-600 mmol/L之间；配制甘氨酸甜菜碱母液，将母液添加到螺旋藻培养基中使其终浓度达到5-5000μmol/L之间，并在光照下培养螺旋藻。将培养得到的螺旋藻细胞分离富集，提取藻蓝蛋白。本发明简单易行、能大幅缩短螺旋藻的培养时间，并显著增加藻蓝蛋白产量，从而大大提高了微藻生产藻蓝蛋白的效率。微藻生产藻蓝蛋白的效率。微藻生产藻蓝蛋白的效率。


技术研发人员：邵盛熙 余春丽 周文广
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/10/7