一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法

一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法
技术领域
1.本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法。


背景技术：

2.在21世纪，癌症已经严重危害到人们的生命健康，癌症被发现时大多处于癌症晚期，治疗难度大且治疗成功率小。癌症早期诊断技术对于癌症的预防、治疗和愈后都至关重要。microrna(mirna)在癌细胞中过表达，能够调控肿瘤相关蛋白表达并与癌细胞的增殖迁移有关。mirna-21在乳腺癌细胞中过表达，mirna-375在前列腺癌细胞中表达上调。因此，mirna作为癌症生物标志物用于癌症早期筛查，但是由于mirna体积小，需要开发灵敏度高的检测方法。现有检测mirna的核酸生物传感器所采用的信号放大方法种类较多。cha、熵驱动等信号放大技术能够实现靶标循环，但对序列设计有特定要求且容易产生较高的假阳性背景信号。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提供一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法。本发明中我们提出利用肿瘤细胞内源性ape1酶辅助mirna靶标循环结合滚环扩增反应构建具有双重信号放大的荧光生物传感器。该方案的双重信号放大策略能够实现对低浓度靶标的灵敏检测，提高生物传感器的灵敏度。滚环扩增得到含有g四联体的dna链原位增强硫磺素t荧光信号用于快速实现荧光检测。
4.本发明具体提供了如下的技术方案：
5.1、一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，步骤为：
6.1)设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的hp发夹，在thermopol缓冲溶液中退火形成发夹，靶标mirna-21杂交hp发夹并反应2h得到mirna-21/hp双链；
7.2)随后加入ape1酶反应，通过ape1酶切割mirna-21/hp双链中ap位点释放靶标mirna-21参与下一个循环及hp1参与rca反应；
8.3)设计哑铃型dp环状模板链，在t4缓冲溶液中退火形成哑铃型结构后加入t4 dna连接酶环化；hp1与哑铃型dp环状模板杂交，在bst聚合酶驱动下发生滚环扩增反应得到含有g四联体的dna长链，加入kcl形成g四联体结构，然后硫磺素t嵌插进g四联体中实现荧光信号增强；
9.4)特异性检测：加入靶标mirna-21和mirna-155，真实样本检测：实验组加入10％血清，加入不同浓度的mirna-21，利用荧光分光光度计检测荧光信号强度(ex＝440nm)。
10.进一步，步骤1)中制备含有ap位点的发夹hp，pcr程序：75℃处理5min；-5℃/min降至40℃；-1℃/min降至37℃，然后在-20℃保存。
11.进一步，步骤2)中优化ape1酶浓度和反应时间：hp为1μm，mirna-21为1μm，1
×
thermopol缓冲溶液，反应总体积10μl，ape1酶浓度为0.05u/μl，37℃反应时间为1h，随后65℃处理20min使ape1酶失活。
12.进一步，步骤3)中优化bst聚合酶浓度为0.2u/μl。
13.进一步，步骤3)中优化dntps浓度为0.5mm。
14.进一步，步骤3)中优化滚环扩增反应时间为3h。
15.进一步，步骤4)中荧光分光光度计检测荧光信号强度(hitachi f7000，ex＝440nm)。
16.本发明的有益效果在于：在本发明中基于滚环扩增反应和内源性酶构建双重信号放大荧光生物传感器实现了对mirna-21的高灵敏度检测分析。当靶标mirna-21存在时，触发ape1酶切割hp释放hp1，同时释放mirna-21实现靶标循环；hp1结合哑铃型模板dp链引发rca反应，在bst聚合酶的作用下得到具有多重g四联体重复单元的dna长链，嵌入硫磺素硫磺素t产生荧光信号。该检测方法所具有的双重信号放大能够提高生物传感器的灵敏度，实现靶标低浓度检测，检测限低至3.33pm。同时，该生物传感器具有良好的特异性能够有效区分多种mirna的干扰，避免产生假阳性信号。最后，该生物传感器在10％血清中仍具有良好的检测能力能够精准检测不同浓度靶标。因此，我们提出的针对mirna-21的生物检测方法能够实现靶标在真实环境中的精准检测，有望将其用于疾病临床诊断。
附图说明
17.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
18.图1为本发明的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法的示意图；
19.图2为含有g四联体的g4-dna链的最佳激发波长和最佳发射波长图；
20.图3为验证实验序列可行性的page图；
21.图4为验证荧光可行性验证rca产物的荧光信号图；
22.图5为优化ape1酶浓度及反应时间的page图；
23.图6为优化bst聚合酶浓度的荧光强度拟合图；
24.图7为优化dntps浓度的荧光强度拟合图；
25.图8为优化滚环扩增反应时间的荧光强度拟合图；
26.图9为加入不同浓度的mirna-21检测生物传感器性能的荧光光谱图；
27.图10为加入不同靶标检测生物传感器特异性分析的荧光光谱图；
28.图11为在10％血清样本中加入靶标检测生物传感器性能的荧光光谱图；
具体实施方式
29.下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
30.实验原理如图1所示，(1)ape1酶辅助靶标mirna-21循环并酶切hp发夹环释放hp1，为第一重信号放大设计。为充分实现该步信号放大，我们设计hp发夹的茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端，能够实现ape1酶切以后hp1、hp2、mirna-21更好分离，并且hp单独存在无靶标时不会被ape1酶切。(2)制备环状模板dp并杂交hp1引发rca反应，为第二重信号放大设
计。其中的dp哑铃形环状模板经退火和t4 dna连接酶连接后得到，然后前一步释放的hp1由于其3’端为-oh，当与哑铃型dp链杂交时可在聚合酶驱动下以哑铃型dp为转录模板发生rca反应，得到rca产物含有大量g四联体重复单元。(3)g四联体原位增强硫磺素t荧光信号，为最终的信号输出步骤。以上两种酶都具有较高的生物活性能够实现靶标高效循环和g四联体的快速生成，从而实现检测信号双重放大，同时荧光检测操作简单能够实现可视化检测。
31.实施例1对探针dna进行预处理
32.首先，从上海生工订购的粉末状引物dna使用前离心4000rpm/min，1min，用超纯水按要求溶解，形成100μm dna溶液。
33.hp序列为5
’‑
tcggaactagtcaacatcxgtctgataagctatgactagaccttccga atagctt-3’(seq id no.1)；
34.dp序列为5
’‑
p-cgcgttcccaacccgccctacccaacgcggtggatgttgactagttc cgaatccac-3’(seq id no.2)；
35.g4-dna序列为5
’‑
atccaccgcgttgggtagggcgggttgggaacgcggtggat-3’(seq id no.3)；
36.mirna-21序列为5
’‑
uagcuuaucagacugauguuga-3’(seq id no.4)；
37.实施例2制备哑铃型模板dp：
38.本发明用超纯水将dp哑铃型环状模板链溶解至100μm。然后将1
×
t4 dna连接酶缓冲液(50mmtris-hcl、10mm mgcl2、1mm atp、10mm dtt，ph＝7.5)、模板链(2μm)置于灭菌pcr管中，用枪头混合均匀。pcr程序：95℃加热5min，-0.5℃/min的速率降至16℃。然后再加入2.5μl的t4 dna连接酶(400000u/ml，neb)并用枪头混合均匀，在pcr中16℃下反应6h，然后在65℃加热10min使酶失活，然后在-20℃保存。
39.实施例3实验条件优化：
40.本发明首先对涉及到的ape1酶浓度及反应时间进行优化。当发夹hp单独存在时，随着ape1酶浓度增加hp也不会被切割；当hp与mirna-21杂交形成双链结构时加入ape1酶会被切割并释放hp1。当体系中的hp与mirna-21浓度均为1μm时先杂交形成双链，体系中加入ape1酶浓度为0.05u/μl(lane 4)、0.1u/μl(lane 6)、0.15u/μl(lane 8)时，均可以使mirna-21/hp双链切开，相对应浓度的hp发夹不被切开。因此，基于同样的切割效果，我们选定ape1酶浓度为0.05u/μl。随后优化ape1酶的反应时间。hp与mirna-21浓度均为1μm、ape1酶浓度为0.05u/μl，三者同时加入反应体系中，分别反应0.5h(lane3)、1h(lane 4)、1.5h(lane 5)、2h(lane 6)，除了0.5h条带有极少量未被切割的mirna-21/hp双链，1h以上的反应时间可观察到mirna-21/hp双链均被ape1酶切割。因此确定ape1酶反应时间为1h。
41.优化滚环扩增反应条件。优化滚环扩增反应时bst聚合酶的浓度，反应体系中thermopol缓冲溶液的浓度分别为0.1u/μl、0.2u/μl、0.3u/μl、0.4u/μl，随着bst聚合酶浓度增加荧光强度逐渐增强，当浓度达到0.2u/μl时反应体系中荧光强度达到平衡。随后，我们优化反应体系中dntps的浓度，其浓度分别为0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm，随着dntps浓度增加荧光信号逐渐增强，dntps最佳浓度为0.5mm。最后，我们优化滚环扩增的反应时间，其反应时间分别为0.5h、1h、2h、3h、4h，随着滚环扩增反应时间延长能够明显观察到荧光信号增强，0.5h至2h时荧光强度增加明显，当反应时间为3h时反应体系中的荧光强度达到平衡。因此，我们确定rca反应时间为3h。
42.优化硫磺素t浓度及kcl浓度。本发明中先优化反应体系中的kcl浓度，随后优化反应体系中硫磺素t浓度。加入不同浓度的kcl，其浓度分别为5mm、10mm、20mm、40mm，发现上述kcl浓度对荧光强度无明显影响，当浓度达到10mm时荧光强度最高。最后，加入不同浓度的硫磺素t，其浓度分别为5μm、10μm、20μm、40μm、50μm，随着浓度增加荧光强度有明显升高，当浓度达到40μm时荧光强度达到平衡
43.实施例4生物传感器性能分析：
44.本发明以mirna-21作为靶标，在反应体系中加入不同浓度的mirna-21用来检测该生物传感器的性能。随着靶标浓度增加，硫磺素t产生的荧光信号显著增强。随后，我们将靶标mirna-21的浓度取对数并将其作为横坐标，发现其与荧光强度存在良好的线性关系。mirna-21浓度在0.1nm-100nm之间，通过计算得到该生物传感器的检测限为3.33pm。
45.实施例5特异性分析：
46.在反应体系中分别加入靶标mirna-21、mirna-155、mirna-141、let-7a、mixture观察荧光信号变化。当加入靶标mirna-21以后产生强烈的荧光信号；当加入其他的肿瘤标志物，如mirna-155、mirna-141、let-7a等，荧光信号同空白对照组类似，荧光信号较弱；mixture是四种mirna的混合物，其中含有mirna-21，该样品也同样产生荧光信号。上述结果表明只有当靶标mirna-21存在时，才能在ape1酶的辅助下切割发夹hp，释放引物链hp1引发rca反应，从而原位增强硫磺素t荧光信号。因此，我们构建的针对mirna-21检测的荧光生物传感器具有良好的特异性，有望用于临床诊断中。
47.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤为：1)设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的hp发夹，在thermopol缓冲溶液中退火形成发夹，靶标mirna-21杂交hp发夹并反应2h得到mirna-21/hp双链；2)随后加入ape1酶反应，通过ape1酶切割mirna-21/hp双链中ap位点释放靶标mirna-21参与下一个循环及hp1参与rca反应；3)设计哑铃型dp环状模板链，在t4缓冲溶液中退火形成哑铃型结构后加入t4 dna连接酶环化；hp1与哑铃型dp环状模板杂交，在bst聚合酶驱动下发生滚环扩增反应得到含有g四联体的dna长链，加入kcl形成g四联体结构，然后硫磺素t嵌插进g四联体中实现荧光信号增强；4)特异性检测：加入靶标mirna-21和mirna-155，真实样本检测：实验组加入10％血清，加入不同浓度的mirna-21，利用荧光分光光度计检测荧光信号强度(ex＝440nm)。2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤1)所述的hp序列为5
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tcggaacta gtcaacatcxgtctgataagctatgactagaccttccgaatagctt-3’；dp序列为5
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p-cg cgttcccaacccgccctacccaacgcggtggatgttgactagttccgaatccac-3’。3.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤2)所述的hp浓度为1μm，反应缓冲液为thermopol缓冲溶液，反应总体积10μl，加入ape1酶在37℃反应，之后在65℃处理20min使ape1酶失活。4.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤2)所述的ape1酶浓度范围为0.05～0.15u/μl。5.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤2)所述的ape1酶在37℃反应分别反应0.5～2h。6.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中bst聚合酶浓度为0.1～0.4u/μl。7.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中dntps浓度为分别为0.25～1mm。8.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中滚环扩增反应时间为0.5～4h。9.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中加入kcl浓度为5～40mm。10.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microrna的
荧光生物传感器分析检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应体系中加入硫磺素t浓度为5～50μm。

技术总结
本发明公开了一种基于滚环扩增反应结合内源性酶辅助检测microRNA的荧光生物传感器分析检测方法。设计茎含有3碱基错配和7碱基粘性末端的HP发夹，加入靶标miRNA-21结合HP发夹后在APE1酶辅助下切割HP发夹上的AP位点释放出靶标，被释放的靶标结合剩余HP发夹发生切割；制备哑铃型DP环状模板并杂交HP1引发RCA反应，实现了双重信号放大；其中DP经退火后形成哑铃形结构并在T4DNA连接酶作用下环化得到哑铃型环状模板，HP1与环化模板杂交后在Bst聚合酶驱动下发生RCA反应，得到含有G四联体重复单元的长链；在K


技术研发人员：张瑛洧 杨宏群 王洪 李昕昊 刘子瑞
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/10/7