基于引物交换反应级联滚环扩增/G四二聚体无标记检测APE1的自反馈荧光生物传感器

基于引物交换反应级联滚环扩增/g四二聚体无标记检测ape1的自反馈荧光生物传感器
技术领域
1.本发明属于生物化学分析方法，具体涉及一种基于引物交换反应(per)级联滚环扩增/g四二聚体(rca/g4dimer)无标记检测ape1的自反馈荧光生物传感器。


背景技术：

2.人源无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1(ape1)，作为机体重要的dna碱基切除修复酶之一，参与着核苷酸损伤修复及转录因子调控等方面的生物功能。此外，ape1除了在哺乳动物细胞中发挥着重要的修复功能，还参与许多细胞功能。目前已发现ape1的水平异常表达与一些肿瘤进程、神经系统疾病、年龄相关疾病和治疗效率密切相关。例如，在乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌等肿瘤细胞中高表达，这意味着ape1活性检测可作为疾病预测或预后的一种辅助工具。目前，生物传感器已经是一种活跃的研究领域，因便捷、灵敏、特异等优点被广泛应用。因此，本方法构建了一个简便、灵敏、无标记的ape1活性检测平台，率先巧妙的提出了基于引物交换反应结合g4二聚体滚换扩增(per-rca/g4dimer)的级联放大荧光生物传感方法来检测ape1活性。在以开发的per及rca荧光分析方法中,大多涉及复杂的核酸序列设计、核酸链之间的互相干扰、方法费时操作繁琐、成本高以及检测设备昂贵等问题。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明将靶标识别裂解、双级联扩增及信号放大均在恒温条件下进行，提供了一种即操作简便又可灵敏无标记检测ape1的荧光生物传感器。主要由4部分组成：(1)ape1特异性识别并剪切门控发夹ghp上的脱嘌呤/嘧啶位点(ap位点)，暴露出3’羟基末端，裂解产生催化发夹chp和引物p1；(2)被裂解产生后的引物p1在bstdna聚合酶作用下延催化发夹chp的3’端进行聚合延伸进行引物交换反应，延伸至终止位点并释放；(3)其释放的产物作为触发链，与挂锁探针特异性结合，在t4dna连接酶和phi29 dna聚合酶的辅助下进行rca反应，产生大量富含g碱基序列的长单链，使信号进一步放大；(4)硫磺素t染料嵌入g4二聚体结构中，产生强荧光信号；
4.所述门控发夹探针ghp经过退火形成稳定的平末端发夹结构，ghp含有ap位点以及终止位点，所述per产物与挂锁探针部分碱基序列互补。所述门控发夹ghp上的ap位点被ape1识别并裂解后的引物p1优选为9个碱基，催化发夹chp优选为44个碱基。
5.进一步的，所述挂锁探针优选为46个碱基，其5’末端修饰有磷酸基团，使其在per产物和t4 dna连接酶作用下可连接成环。
6.本发明的检测原理如图1所示，靶标ape1特异性识别门控发夹ghp上的ap位点，将其剪切去除后暴露出3’羟基末端。同时裂解产生充当引物交换反应的催化发夹模板chp和引物p1，引物p1在bst dna聚合酶作用下沿着chp向前延伸，到达终止位点停止并释放，自由的chp继续进行per循环，产生大量重复的dna片段作为触发链激活rca反应。加入挂锁探针，
在t4 dna连接酶和phi29 dna聚合酶的辅助下，扩增产生大量富含g碱基的长串联序列。通过引入钾离子和硫磺素t染料，扩增产物与其结合，以425nm的激发波长，在485nm处检测到显著增强的荧光信号，可实现定量检测。
7.优选的，所述的靶标触发的引物交换反应级联滚环扩增/g四二聚体检测ape1的方法包括如下步骤：(1)用1*te缓冲液将门控发夹ghp退火形成完整的发夹结构，退火反应条件优选为95℃5min变性，缓慢降温至25℃后反应60min。(2)把4μl待测样品加入到反应溶液i中，进行ape1识别裂解以及引物交换反应，产生大量重复的dna单链，然后进行高温灭活处理；向反应后的溶液中加入挂锁探针、t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶，进行二级滚环扩增反应，形成富含g碱基序列的长串联单链dna，然后进行高温灭活处理。ape1识别裂解以及引物交换反应的具体反应条件为：在30-65℃(优选为37℃)，反应30-120min(优选为50min)，高温灭活的温度优选为85℃，反应5-10min(优选为10min)；滚环扩增反应具体条件为：在25-45℃(优选为37℃)，反应30-150min(优选为120min)，高温灭活的温度优选为65℃，反应5-10min(优选为10min)。(3)向其中加入钾离子和tht染料，并用超纯水将步骤(2)反应后的溶液稀释至100μl，避光孵育后测荧光，荧光激发波长425nm，在发射波长485nm处测得荧光强度值，代入公式f＝518.863+275.139logc
ape1
计算可得样品中所含ape1的量；避光孵育的条件优选为25-45℃(优选为37℃)避光孵育10-30min(优选为30min)。
8.所述步骤(1)中门控发夹ghp为1μm。
9.所述步骤(2)中，反应溶液i中包括步骤(1)中ghp 4μl、bst dna聚合酶(4u/μl)、mgso4(1mm)、dntps(1mm)、挂锁探针4μl、t4 dna连接酶(1u/μl)、phi29 dna聚合酶(0.25u/μl)和超纯水，构成40μl的反应体系。
10.所述步骤(3)中，加入55μl钾离子溶液和5μl tht染料。
11.本发明的优点在于：(1)本发明将靶标识别、级联扩增及信号放大均在恒温条件下进行，操作简便，可实现对ape1的定量检测，且不需要多种复杂的仪器设备。(2)本发明中门控发夹ghp的设计降低了非特异性干扰，挂锁探针的设计有效提高了检测灵敏度。(3)本发明用到的dna均为无荧光标记的dna，在扩增产物中加入tht染料进行定量检测。不仅避免了背景荧光信号的干扰，而且大大降低了检测成本。(4)本发明仅用微量样本(4μl)即可完成ape1定量检测。(5)本发明适用于复杂样品中ape1的检测，包括血液、体液以及细胞蛋白提取液，还可用于ape1相关抑制剂评估及药物筛选。
附图说明
12.图1是本发明利用引物交换反应级联滚环扩增/g四二聚体无标记且灵敏检测ape1的工作原理图。
13.图2为验证实验原理可行性的12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
14.图3为验证实验原理可行性的荧光光谱图。
15.图4为验证本方法优异性比较的柱状图。
16.图5为对g四二聚体和g四单聚体结构的圆二色谱表征图。
17.图6为两种方法的抗干扰能力的比较。
18.图7为ghp的浓度(a)、bst dna聚合酶的浓度(b)、phi29聚合酶的浓度(c)、rca反应的时间(d)的优化。
19.图8是不同浓度ape1检测的荧光光谱图。
20.图9是荧光强度与ape1浓度的线性关系图。
21.图10是本发明的特异性分析。
22.图11是用本发明对ape1抑制剂筛选及抑制效果检测图。
23.图12是用本发明对实际样品分析及与传统方法比较柱状图。
具体实施方式
24.一种基于per-rca/g4二聚体的荧光生物传感器检测ape1活性方法的工作原理如图1所示。本实验方法主要分为三个部分：(1)ape1对门控发夹(ghp)进行识别和裂解；(2)采用引物交换反应结合滚环扩增进行级联信号放大；(3)采用g4二聚体/tht作为荧光指示剂。在ape1存在的情况下，ghp被识别并裂解，暴露出3
’‑
oh，分别释放充当per的引物p1和催化发夹(chp)。值得注意的是，释放的p1可以自动作为per的触发链，而不需要添加过量的引物dna。另外，在催化发夹中设计c-g碱基对作为终止位点，终止聚合反应过程，催化发夹设计为平末端，以避免3’端非特异性延伸。释放的p1首先特异性地与chp的互补结构域结合，并在bst dna聚合酶的帮助下，从3’端向前延伸到停止位点(c-g)，形成一个新的长ssdna。扩展后的ssdna被链间的分子迁移机制所取代，恢复后的游离chp继续与新的p1结合，引发新一轮的扩增反应。最终，整个ape1诱导的自反馈系统产生了大量的长ssdna。随后，长链ssdna激活rca反应。接下来，将预先设计的挂锁探针与per产物杂交，在t4 dna聚合酶和phi29 dna聚合酶的帮助下，实现了挂锁探针的连接和随后的聚合延长过程，产生了大量的串联和富g的寡核苷酸序列。最后，随着tht和k
+
的加入，形成了大量的g4二聚体dna二级结构，并产生了一个非常显著的荧光信号。相反，在没有ape1的情况下，ghp的完整性仍然保持不变，并且per的循环模板没有被释放，从而阻止了后续的反应过程，导致微弱的荧光信号。
25.下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
26.实施例1对门控发夹dna进行预处理。
27.首先，从上海生工订购的粉末状引物dna使用前离心4000rpm/min，1min，用1*te缓冲液按要求溶解，形成100μm dna溶液。使用时用1*te缓冲液稀释配制。所述的1*te缓冲液组成为10mm tris,1mm edta，ph＝8。
28.门控发夹ghp的序列为5'-aatgaaggatgaggtagtatcccggttttccgggatactacctcatcctt catt-3'
29.其中门控发夹ghp序列包含修饰的ap位点和终止位点；标下划线的碱基序列为终止位点。
30.挂锁探针的序列为5'-ctcatcccaacccgccctaccccccaacccgccctacccatactac-3'
31.其中，挂锁探针序列的5’端进行磷酸化修饰；两端标下划线的序列分别和per产物
的序列互补配对；中间段序列为32个碱基长度。
32.per产物的序列为5'-aatgaaggatgaggtagtat-3'，与挂锁探针两端部分序列互补，从而引发滚环扩增。
33.实施例2用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证方案可行性。
34.图2中泳道1的条带表示门控发夹ghp；泳道2为靶标和ghp混合物，观察到条带有所下移，表明ghp被靶标识别并裂解产生催化发夹chp；条带3为挂锁探针；泳道4、泳道5和泳道6分别表示阴性per结果、缺少bst dna聚合酶的per结果和阳性per结果，在泳道5中没有出现新的条带，说明bst dna聚合酶在反应过程中是不可或缺的，在泳道6下方出现新的条带，表明per反应成功进行；泳道7和泳道8分别为级联扩增反应的阴性和阳性结果，在泳道8上方出现了一个明亮的条带，说明per结合rca反应是成功的；此外，我们用预存的引物p2验证了per产物的位置，观察到两者位置相同。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果验证了我们方案的可行性。
35.实施例3荧光分析验证方案可行性。
36.图3中，用本方法检测超纯水稀释的ape1(10u/ml)，可见荧光信号显著升高；而当缺乏ape1时荧光信号维持在较低水平。说明本方法可以实现对ape1的定量检测。
37.实施例4验证两种方法优异性的比较。
38.图4中，当溶液中缺乏靶标的情况下，per-rca/g四单聚体和per-rca/g四二聚体都产生了可忽略的荧光值；加入靶标后，观察到含有g4二聚体的样品产生了更高的荧光信号，信噪比(s/b)从9.7增加到27.2倍。说明本方法检测ape1更为优异。
39.实施例5用圆二色谱分别对g四二聚体和g四单聚体结构进行表征。
40.图5中，反应体系中加入100mm k
+
,100μm tht,10μm g四二聚体和10μm g四单聚体，避光孵育的条件优选为25-45℃(优选为37℃)避光孵育10-30min(优选为30min)。在圆二色谱图像中观察到多聚g4比普通单体g4在260nm处有更强的正峰，并且在430nm处一个较为明显的负峰，表明g4二聚体可折叠成反平行拓扑结构并与tht结合力更强。
41.实施例6比较两种方法的抗干扰能力。
42.图6中，分别在na
+
、k
+
、na
+-k
+
条件下，分析两种方法的抗干扰能力比较。两种方法加入100mm na
+
后，发现单聚g4的荧光值比正常k
+
存在时降低了13倍左右，然而多聚g4仅降低了2倍；在na
+-k
+
同时存在时，多聚g4也有较高的荧光信号。这不仅验证了多聚g4能够显著提高荧光强度，并且在复杂生物环境中有着较强的抗干扰能力。
43.实施例7优化本方法实验条件。
44.首先，对反应的ghp模板浓度进行优化，如图7(a)，当加入ghp浓度为100nm时，荧光强度差值(f-f0)不再升高趋于稳定，所以取100nm为最优模板浓度；其次，对bst dna聚合酶浓度进行优化，图7(b)所示，取16ubst dna聚合酶反应为最优；还优化了phi29dna聚合酶浓度，如图7(c)选择0.25u/μl作为最佳条件；最后，对本方法rca反应时间进行优化，如图7(d)，选120min为最佳反应时间。
45.其中，所有优化过程均用终浓度为10u/ml的ape1。
46.实施例8荧光检测不同浓度ape1。
47.图8为用本方法检测不同浓度ape1的荧光光谱图，随着ape1浓度从0.001u/ml-30u/ml的逐渐增加，在485nm处的荧光强度也逐渐增强。
48.实施例9计算荧光检测结果与ape1浓度间关系。
49.图9显示，在0.02u/ml-30u/mlape1的浓度区间内，本方法测得的485nm处的荧光强度值与ape1浓度之间存在良好的线性关系。所述线性关系用公式表示为f＝518.863+275.139logc
ape1
，(r2＝0.997)。最低检出限为0.001u/ml。
50.实施例10分析本方法选择性能。
51.分别选择10u/mludg、t4pnk、exoi、nb.bbvci的阴性对照组、空白组和ape1阳性对照组进行荧光检测，取得其在485nm处的荧光强度。如图10，阳性对照组的荧光强度显著高于其他酶和空白组的荧光强度。因此，本方法具有优异的选择性能。
52.实施例11用本方法分析ape1抑制剂的抑制效果。
53.本方法选择了两种不同的ape1抑制剂进行阳性对照，分别是金精三羧酸(ata)和7-硝基吲哚-2-甲酸(nca)，用1*pbs缓冲液及超纯水作为阴性对照组。如图11(a)，样品中未加抑制剂时，观察到荧光信号仍旧很高，ape1活性未被抑制。相比之下，加入ata和nca之后，荧光信号有所降低，并且nca所在样品信号降低显著，结果表明nca能高效的抑制ape1的内切酶活性，具有更加强烈的抑制能力。因此，选择nca作为本方法检测靶标的抑制剂模型。在图11(b)中，展示了nca的化学结构式，观察到随着nca浓度不断增高，荧光强度逐渐下降，最终趋于稳定。计算可得半抑制浓度(ic
50
)为3.32μm，与报道一致。因此可用本方法实现对ape1抑制剂的筛选和研究，对目前临床癌症治疗中药物新靶点的研究具有重要意义。
54.其中，所用ape1终浓度均为10u/ml。
55.实施例12用本方法分析实际样品。
56.用从上海生工订购的细胞核蛋白质提取试剂盒，分别提取细胞mcf-7、mcf-10a和hela中的核蛋白，得到相应的核蛋白提取液。随后作为待测样品用本方法检测。结果如图12(a)，与正常细胞mcf-10a相比，肿瘤细胞mcf-7，hela核蛋白提取液的荧光强度均较高，且癌细胞mcf-7的核蛋白提取液的荧光强度最高。证明本方法可以在体外区分不同细胞。在图12(b)显示，在hela和mcf-7细胞裂解液中ape1的表达水平持续上调，这与elisa商品试剂盒测定结果一致。
57.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.基于引物交换反应级联滚环扩增/g四二聚体无标记检测ape1的自反馈荧光生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括门控发夹探针(ghp)、挂锁探针、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(ape1)、bst dna聚合酶、t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶和硫磺素t(tht)染料；其中，所述门控发夹探针(ghp)中含有脱嘌呤/嘧啶位点和终止位点。2.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述门控发夹探针ghp为平末端dna二级结构，阻止了per过程在聚合酶作用下的非特异性扩增。3.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述挂锁探针的5’末端修饰有磷酸基团，使其在per产物和t4 dna连接酶作用下可连接成环。4.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述生物传感器在per过程中包括dntps，所述dntps由三种去氧核苷酸三磷酸即datp、dgtp和dttp按等比例混合而组成。5.一种检测ape1的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-4任一项所述荧光生物传感器进行检测。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：s1、用1*te缓冲液将门控发夹探针溶解并退火形成完整的发夹结构；s2、把待测样品加入到反应溶液i中，进行ape1识别裂解以及引物交换反应，产生大量重复的dna单链，然后进行高温灭活处理；s3、向步骤s2反应后的溶液中加入挂锁探针、t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶，进行二级滚环扩增反应，形成富含g碱基序列的长串联单链dna，然后进行高温灭活处理；s4、向步骤s3反应后的溶液中加入硫磺素t染料，得到嵌入tht的大量g四二聚体结构的dna片段；优选的，所述步骤s1中，所述的1*te缓冲液组成为10mm tris,1mm edta，ph＝8；优选的，所述步骤s2中，反应溶液i中至少包括门控发夹探针ghp、和bst dna聚合酶；进一步优选的，所述反应溶液i中还可以包括包括dntps、硫酸镁和超纯水等，从而有助于反应的顺利进行；优选的，所述步骤s2中，ape1识别裂解以及引物交换反应的具体反应条件为：在30-65℃(优选为37℃)，反应30-120min(优选为50min)；高温灭活的温度优选为85℃，反应5-10min(优选为10min)，在优选时间内达到高荧光强度；优选的，所述步骤s3中，滚环扩增反应具体条件为：在25-45℃(优选为37℃)，反应30-150min(优选为120min)，在优选时间内达到高检测灵敏度。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤s4获得的反应产物进行检测分析；优选的，所述检测分析为荧光检测分析。8.如权利要求6所述的荧光生物传感器，其特征在于，如步骤s2所述的ape1酶范围为0.02-30u/ml。9.权利要求1-4任一项所述荧光生物传感器和/或权利要求6-8任一项所述检测方法在ape1相关药物筛选和/或生物样品ape1检测分析中的应用。10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述ape1相关药物包括ape1抑制剂。

技术总结
本文公开了一种基于引物交换反应(PER)级联滚环扩增(RCA)/G四二聚体无标记检测APE1的方法。所述生物传感器包括门控发夹(GHP)、挂锁探针、无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)、Bst DNA聚合酶和硫磺素T(ThT)染料等。APE1可识别门控发夹GHP上的脱嘌呤/嘧啶位点(AP位点)，裂解产生充当PER的催化发夹和引物，触发PER产生大量单链DNA。该单链DNA可激活RCA反应，形成富含G碱基序列的长串联序列。通过引入钾离子和ThT染料，折叠成G四二聚体结构并产生强荧光信号。采用该荧光生物传感器检测APE1，不需要复杂的仪器设备和操作步骤，均在恒温37℃反应即可实现对APE1的定量检测。所以该发明在癌症早期监测和抗癌药物筛选等方面具有巨大潜力，因此有良好的实际应用价值。此有良好的实际应用价值。


技术研发人员：向华 祁银肖 杜昱旻
受保护的技术使用者：重庆医科大学国际体外诊断研究院
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/10/7