一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法

1.本发明属于植物细胞悬浮培养技术领域，具体涉及一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法。


背景技术：

2.梅片树是樟科(lauraceae)樟属(cinnamomum)植物，是阴香的一个化学型，多生长于温暖湿润疏松肥沃的环境下，主要分布于东南亚地区，国内广东、福建、广西、云南等省均有种植。梅片树叶互生或近对生，离基三出脉，果实呈卵形，11～12月成熟，可作为绿化树，同时也是一种药用植物。梅片树枝叶中含有冰片，其学名为“天然右旋龙脑”，是一种高级香料，也是一种名贵珍稀药材，广泛应用于医药、化妆品、香料等行业，获得市场的一致好评。梅州市平远县有一个梅片树种植基地，如今研发的梅片加工产品涵盖医药、护肤、美妆、日化等多个领域，梅片树种植及加工产业已成为推动当地经济发展的重要抓手。梅片树的活性成分能有效预防免疫系统衰退、心血管疾病等多种退变性疾病的发生，因此被广泛地应用于临床。梅片树枝的根、树皮和枝叶可入药，新鲜枝叶可提取精油用于日化美容护肤之中。梅片树的枝叶挥发油成份中主要有右旋龙脑、乙酸龙脑脂、斯巴醇、桉叶油素等，开发利用前景巨大。梅片树药用部分有两种，一种是树干缝隙中干燥后的树脂，另一种是蒸馏被切碎枝叶所提取的龙脑香树脂。这些药用成分可用于配制安宫牛黄解毒丸、双料喉风散、六神丸等60多种中成药。现代药理研究证实梅片树叶挥发油具有广泛的药理特性，包括抗菌、通窍、散郁火、消肿止痛等功效。从梅片树干可采集干燥树脂，由叶片可提取得到天然右旋龙脑。
3.龙脑(borned)，俗称“冰片”，是一种单菇醇，分子式为c
10h18
o(154.25g/mol)。龙脑按来源分为天然龙脑和合成龙脑，天然龙脑按旋光不同又分为左旋龙脑(艾片)和右旋龙脑(天然冰片、梅片)。药理学研究发现，右旋龙脑具有良好开窍醒神、消肿止痛、抑菌、抗炎的作用，广泛应用于医药化工领域。此外右旋龙脑还能保护心脑血管、镇痛抗炎、dna保护及修复、调节中枢神经、开放生理性屏障、促进药物透过血脑屏障等药理作用。因此，梅片树药用价值非常高，市场需求也日益增加。
4.目前，生产中梅片树造林苗木主要以扦插苗为主，嫁接繁殖受到缺乏熟练工人及成活率较低的制约，种子繁育因遗传变异使得子代右旋龙脑的含量不稳定，因而不能在生产中使用。鉴于梅片树产业化发展的需要，梅州市林业科学研究所从2011年起开展梅片树遗传育种和培育技术等方面的研究，历经多年努力，成功从广东地区早期种植梅片树中筛选出右旋龙脑含量高的梅片树单株，并以此作为母树营建采穗圃开展梅片树的扦插繁育试验。此外，马笑宇等人已通过外植体上诱导腋芽途径建立了梅片树的快繁体系。
5.植物细胞悬浮培养是一种将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的新技术，能够快速获得成熟植物细胞及其代谢产物。通过培养悬浮细胞，可以大量生产目标药效成分。目前已运用悬浮细胞技术成功获得包括人参、甘草、厚朴等大宗药材的次生代谢产物。植物悬浮细胞不仅可用于生产药用活性物质，还能为研究植物细胞
的生理、生化、遗传、分化等提供实验材料用于遗传多样性分析等，以及为探究代谢产物生物合成路径提供技术基础。目前中国、日本、德国已成功进行人参、紫草等植物的大规模生产，能够满足人参、皂苷等植物次生代谢产物的市场需求。
6.植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化。因其分散性好，细胞团大小及细胞形状大致相同，且重复性好、生长迅速、易于控制等有利因素被广泛用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究中。通过诱导出疏松湿润的愈伤进行细胞悬浮培养，还可诱导出胚状体，制成人工种子。
7.总而言之，悬浮细胞培养技术在药用植物生产研究中的应用，不仅可缓解目前药材资源紧张的情况，也为药用植物的代谢途径研究提供了技术基础，利用悬浮细胞技术进行组织培养还有利于作物优选和资源保护。


技术实现要素：

8.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法，以及悬浮细胞的冻存及复苏方法。
9.本发明的第一个目的是提供一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法，其包括以下步骤：
10.s1、摘取梅片树嫩叶，经消毒后将叶片切割成小块；
11.s2、将切割好的叶片接入愈伤诱导培养基培养，诱导形成愈伤；
12.所述的愈伤诱导培养基为如下(1)-(2)中的任意一种：
13.(1)1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+6～12μmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0；
14.(2)1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+5mg/l gln+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0；
15.s3、取疏松愈伤，压碎后，将愈伤接种至悬浮培养基内进行悬浮细胞培养；培养2-3周后，获得悬浮细胞。
16.优选，所述的步骤s1的消毒，包括以下步骤：将嫩叶先用流水冲洗，再放入纯水浸泡15分钟，然后用灭菌过的纯水洗涤3次，每次15秒；再用体积分数75％乙醇水溶液洗涤3次，每次15秒；最后用质量分数5％ naclo水溶液洗涤5分钟；然后于超净台用无菌纯水漂洗3次，每次15秒；叶片用滤纸上吸干表面水分。
17.优选，所述的步骤s1中的将叶片切割成小块为将叶片切割成5mm
×
5mm大小的小块。
18.优选，所述的愈伤诱导培养基为1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+12μmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0。
19.优选，所述的悬浮培养基为1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+30g/l蔗糖，ph5.8～6.0。
20.优选，所述的步骤s3，在获得悬浮细胞后进行继代培养，所述的继代培养是将悬浮细胞接种至新的悬浮培养基进行悬浮细胞培养。
21.优选，所述的步骤s2中的培养，其培养条件为：光照12h，黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22℃；所述的步骤s3中的培养，其培养条件为：于25℃、
110r
·
min-1
恒温振荡器进行暗培养。
22.本发明的第二个目的是提供一种梅片树悬浮细胞的冻存及复苏方法，其包括以下步骤：
23.s1、预处理：取利用所述的梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法获得的培养2-3周的悬浮细胞，离心，去除上层液后加入灭菌的0.2mol/l蔗糖溶液混匀，置于25℃、110r
·
min-1
恒温振荡器暗培养24小时；
24.s2、冻存：取经步骤s1处理的细胞，离心，去除上层液，用冷冻保护剂浸泡细胞，混匀后分装于冻存管内，冻存管装入梯度降温盒内，于-80℃超低温保存柜保存，隔天去盒存放；所述的冷冻保护剂为1/2ms培养基+10％蔗糖+10％ dmso；
25.s3、复苏：从-80℃超低温保存柜取出冻存管，放于39℃水浴锅解冻2-3分钟，使管内无冰块；解冻后立刻转移至离心管离心，用移液枪吸出上清，加灭菌的0.2mol/l蔗糖溶液洗涤2-3次，然后将细胞接入悬浮培养基内进行悬浮细胞培养。
26.优选，所述的悬浮培养基为1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0。
27.本发明在筛选出适合梅片树愈伤诱导条件的基础上，选取优良胚性梅片树愈伤组织，以细胞生长量为指标建立稳定的梅片树悬浮细胞培养体系，可以通过细胞系培养获取提取天然冰片的原材料，为广泛开发利用梅片树植物资源提供理论依据及技术支持。
28.本发明弥补了梅片树悬浮体系建立的空白，为梅片树天然冰片的提取提供更快更多更简便的途径。本发明的冻存及复苏方法的建立为未来梅片树内有效物质的储藏与应用提供了新的思路和方法。
附图说明
29.图1是不同浓度mt对愈伤诱导率的影响。
30.图2是不同浓度mt对愈伤体积影响；注：****表示p《0.0001。
31.图3是a3、a4培养基诱导产生的愈伤；其中：图a为1/2ms+3.0mg/l ba+1mg/l naa+6mmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖培养基(a3)产生愈伤，图b为1/2ms+3.0mg/l ba+1mg/l naa+12mmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖培养基(a4)产生愈伤。
32.图4是不同浓度gln对愈伤诱导率的影响。
33.图5是不同浓度gln对愈伤体积影响；注：****表示p《0.0001。
34.图6为1/2ms+3.0mg/l ba+1mg/l naa+5mg/l gln+8g/l琼脂+30g/l蔗糖培养基(a6)产生愈伤。
35.图7为不同浓度ch对愈伤诱导率的影响。
36.图8为不同浓度ch对愈伤体积影响；注：*表示p《0.5。
37.图9为1/2ms+3.0mg/l ba+1mg/l naa+200mg/l ch+8g/l琼脂+30g/l蔗糖培养基(a13)产生愈伤。
38.图10是梅片树悬浮细胞生长曲线。
39.图11是梅片树悬浮细胞显微图像(0-5周)(400倍镜)。
40.图12是冻存复苏后梅片树悬浮细胞的生长曲线。
41.图13是叶片与细胞冰片含量百分比。
具体实施方式
42.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
43.以下实施例中所指的1/2ms培养基是将ms培养基中所有组分的含量都减为原含量的1/2的培养基。
44.实施例1
45.1实验材料
46.1.1实验原料
47.由广东梅州华清园提供梅片树幼苗。
48.1.2培养条件
49.1/2ms培养基中添加8g/l琼脂和30g/l蔗糖，用氢氧化钠溶液调整ph值为5.80～6.00，灭菌锅设置121℃、101mpa灭菌20min，倒板到组培瓶中，待培养基冷却凝固后使用。为了避免梅片树嫩叶褐化，在培养前要将培养基放入超净台中吹干表面水分。所放入恒温培养箱的条件为，光照12h，黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22℃。
50.液体培养基与普通培养基区别在于不需加琼脂，同样方法配置后调整ph为5.80～6.00，直接分装于50ml三角瓶，每瓶25ml，灭菌后用移液枪添加激素混匀放凉即可使用。
51.1.3实验仪器与实验试剂
52.表1实验仪器
[0053][0054]
表2实验试剂
[0055][0056][0057]
2实验方法
[0058]
2.1实验前处理
[0059]
2.1.1培养基水分的去除
[0060]
将培养瓶置于已紫外照射20分钟的超净台上，打开瓶盖整齐排列，风吹40分钟使瓶盖、瓶壁、培养基表面的水分消失。
[0061]
2.1.2梅片树叶片的消毒
[0062]
摘取梅片树新鲜长出的翠绿色嫩叶，大约长7厘米宽3厘米。先用流水冲洗每一片嫩叶，再放入纯水浸泡15分钟。浸泡完毕后将嫩叶放入50ml离心管中；用灭菌过的纯水洗涤3次，每次15秒；再用体积分数75％乙醇水溶液洗涤，同样洗涤3次，每次15秒；最后用质量分数5％ naclo水溶液洗涤5分钟。随后便转移至超净台，无菌纯水漂洗3次，每次15秒，用镊子将叶片夹至培养皿中的滤纸上吸干表面水分，配合手术刀将叶片切割成5mm
×
5mm的大小后，将叶片夹至已吹干水分的培养基中，最后在培养瓶盖子上标记激素浓度、日期等，放于培养箱内培养。
[0063]
2.2基础培养基加不同激素对愈伤诱导影响
[0064]
前期预实验发现将基础培养基改为1/2ms效果最佳，1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+8g/l琼脂+30g/l蔗糖(ph 5.8)的愈伤诱导率达91.67％。在1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+8g/l琼脂+30g/l蔗糖(ph 5.8)基础上，外源添加不同浓度的褪黑素mt、谷氨酰胺gln或水解酪蛋白ch(表3)，观察所长愈伤的数量、体积。采集嫩叶按照2.1.2所述方法进行处理，然后将叶片切割成5mm
×
5mm的大小后用镊子夹入培养基，使叶片平坦贴合培养基表面。不同激素各设不同浓度组合，每个浓度接种10瓶，每瓶4片切割好的叶片。培养条件为：光照12h，黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22℃。培养一个月后观察并记录愈伤组织的诱导率和体积，实验重复3次。
[0065]
使用前ba用少量4m naoh溶解；naa用95％乙醇溶解；mt、gln、ch均用纯水溶解。溶解后用灭菌的纯水定容，再用13mm针头过滤器滤菌，得到浓度为0.2mg/ml的ba、naa母液，浓度为10mg/ml的gln、ch母液；浓度为10mmol/l的mt母液。待1/2ms培养基灭菌结束后，温度降
到60℃左右时加入。母液均放于-20℃避光保存。
[0066]
表3基础培养基上添加不同配比激素
[0067][0068]
2.3梅片树悬浮细胞生长曲线
[0069]
液体培养基(悬浮培养基)为1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+30g/l蔗糖，ph值5.8。
[0070]
选取疏松愈伤置于培养皿内滤纸上，用手术刀和镊子压碎后，将1g左右的量夹至液体培养基内分散进行培养。所有液体培养基均置于25℃、110r
·
min-1
恒温振荡器进行暗培养，接种当天及每周都要对细胞进行观察和计数。实验重复3次。据此绘制梅片树悬浮细胞生长曲线，辨别生长周期。
[0071]
2.4梅片树悬浮细胞冻存及复苏
[0072]
2.4.1预处理
[0073]
配置0.2mol/l蔗糖经灭菌作为预处理剂，取对数生长期梅片树细胞离心，去除上层液后加入预处理剂混匀，置于25℃、110r
·
min-1
恒温振荡器暗培养24小时，诱导梅片树细胞保护性脱水，以减少其中自由水防止细胞结构破坏、死亡。
[0074]
2.4.2细胞冻存
[0075]
在1/2ms培养基中添加10％的蔗糖和10％的dmso作为冷冻保护剂。取预处理的细胞离心，除去上层液并用所制冷冻保护剂浸泡细胞，用移液枪吹打均匀后分装于冻存管内。冻存管装入梯度降温盒内，直接放入-80℃超低温保存柜，隔天去盒存放。
[0076]
2.4.3细胞复苏
[0077]
从-80℃超低温保存柜取出冻存管，放于39℃水浴锅解冻2-3分钟，使管内无冰块。解冻后立刻转移至离心管离心，用移液枪吸出上清，加预处理剂0.2mol/l蔗糖洗涤2-3次，以降低其中冷冻保护剂中dmso对细胞的毒害。洗涤完毕后将细胞转移至1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa基础配比液体培养基内培养，接种当天及每周观察细胞并计数，对比复苏细胞与愈伤诱导细胞生长周期的区别。
[0078]
2.5梅片树细胞与嫩叶所含冰片含量对比
[0079]
梅片树叶片冰片提取采用水蒸气蒸馏法，将梅片树树叶剪成碎片，称取3g碎叶放入三口圆底烧瓶内，加入36ml沸腾蒸馏水(1g:12ml)，超声10分钟，安装并打开装置水蒸气蒸馏1小时，用无水乙醇清洗管壁，将液体密封保存。将液体旋蒸后真空干燥至无水分，称取所得样品质量。
[0080]
梅片树悬浮细胞内冰片提取，则选取等质量愈伤(3g)所诱导出培养三周以上的平台期细胞进行水蒸气蒸馏。称量离心后细胞放入三口圆底烧瓶内，按1g:12ml的比例加入36ml沸腾蒸馏水，超声10分钟，安装并打开装置水蒸气蒸馏1小时，用无水乙醇清洗管壁，将液体密封保存。将液体旋蒸后真空干燥至无水分，称取所得样品质量。
[0081]
2.6统计指标及数据处理
[0082]
得到的数据均采用graphpad prism8软件处理和分析。各项指标的计算公式如下：
[0083]
愈伤诱导率＝(产生愈伤叶片数/接种叶片数)
×
100％；愈伤体积＝(所有愈伤体积总和/愈伤总数)
×
100％。
[0084]
3结果与分析
[0085]
3.1基础培养基加不同激素对愈伤诱导影响
[0086]
培养期间观察发现，接种5d后大部分叶片边缘开始卷曲，15d左右开始膨大产生愈伤组织，叶脉处愈伤组织生长较快。不同激素对梅片树嫩叶的作用各不相同，所长成愈伤也有所区别。其中外源添加6μmol/l mt(培养基a3)、12μmol/l mt(培养基a4)、5mg/l gln(培养基a6)、20mg/l gln(培养基a9)、200mg/l ch(培养基a13)对愈伤的作用相似，效果良好，所形成愈伤质地疏松，颜色为黄白色。而外源添加25mg/l ch、50mg/l ch、100mg/l ch所形成的愈伤颜色为黄褐色，且质地紧实，生长状态不佳(表4)。
[0087]
表4不同激素对愈伤组织状态影响
[0088][0089]
注:“+”表示愈伤组织的生长速度和愈伤组织状态，“+”越多表示生长越旺盛或愈伤组织状态越好；****表示p《0.0001，*表示p《0.5。
[0090]
3.1.1不同浓度mt对愈伤诱导影响
[0091]
据图1可知，不同浓度的mt对愈伤诱导率影响不大，皆能保持在95％，有轻微的上升趋势；而由图2可知6μmol/l与12μmol/l mt所得愈伤体积大且所诱导愈伤的状态大部分呈现黄白色，比较疏松，生长较旺盛。如图3所示，肉眼观察发现12μmol/l mt所得愈伤更大更饱满。
[0092]
3.1.2不同浓度gln对愈伤诱导的影响
[0093]
外源添加gln对梅片树愈伤的诱导率影响不大，相对基础培养基中愈伤的诱导率上下浮动(图4)；但5mg/l gln所诱导愈伤体积显著增大，效果显著(图5)，且质地疏松，生长状态良好(图6)；同时也为后续用愈伤诱导悬浮细胞的实验提供了适宜诱导愈伤的培养基。
[0094]
3.1.3不同浓度ch对愈伤组织诱导的影响
[0095]
激素ch对梅片树愈伤组织诱导影响与基础培养基相差不大，均维持在90％左右(图7)，而ch对愈伤体积的影响呈现先下降后上升的趋势(图8)，说明其在浓度较低时对愈伤体积的增长呈抑制作用。且低浓度所培养愈伤组织质地紧实，颜色为黄褐色，生长状态不佳(图9)。唯有外源添加200mg/l ch时愈伤组织呈现出较佳的状态，愈伤组织更为疏松，颗粒更细，褐化状态减少，但所诱导愈伤组织不如mt、gln最佳浓度培养基的效果(表4)。
[0096]
3.2梅片树悬浮细胞生长曲线
[0097]
在梅片树接种当天及每周进行计数可得图10(对应生长状态见图11)，该悬浮细胞
的生长基本符合“s”型曲线特征。其生长周期可明显分为4个时期：迟滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。0-1周细胞数目少、生长量少为迟滞期；第2-3周的细胞增殖、生长发育最明显，为对数生长期；第3周细胞总数达最高限度，进入稳定期；第3-4周生长速度逐渐降低，进入衰亡期。
[0098]
本实施例对梅片树嫩叶进行愈伤诱导，并将诱导出的疏松愈伤接种到液体培养基，从而观察到梅片树悬浮细胞的生长周期，实验发现梅片树悬浮细胞在液体培养基中的生长周期为5周左右，细胞生长缓慢，第2、3周之间为对数生长期，细胞活力佳，此时若进行继代或冻存可使所得细胞维持较高水平的活力，得到稳定的液体悬浮培养体系。
[0099]
3.3梅片树悬浮细胞冻存及复苏
[0100]
取对数生长期梅片树悬浮细胞进行冻存处理，经一段时间后复苏，复苏当天及每周计数可得图12复苏后细胞的生长曲线图(图12)，同样的其生长曲线呈“s”型，与愈伤诱导悬浮细胞的轻微不同之处在于复苏后的细胞迟滞期来得更迟，为0-2周。第3-4周细胞生长速度最快，细胞代谢活性最强为对数生长期；第4周进入稳定期数目达最高限度；其后为衰亡期。因此所采用冻存方法可应用于梅片树悬浮细胞。
[0101]
低温冷冻处理可使细胞停止代谢活动，更好地保持细胞特性。本实施例建立了梅片树悬浮细胞的冻存及复苏方法，对冻存复苏的梅片树细胞进行了生长周期的观察测定，将其与愈伤组织诱导细胞对比观察，除了复苏不可避免的细胞数损耗外，两者的细胞生长周期区别仅在于复苏后的稳定期来得更迟，大约是延滞期加长了一周的变化。
[0102]
3.4梅片树细胞与嫩叶所含冰片含量对比
[0103]
采用水蒸气蒸馏法分别对叶片和悬浮细胞进行冰片提取，实验重复三次，真空干燥后称量所得冰片样品质量，计算所得冰片含量百分比(表5)。结果显示，由梅片树嫩叶内提取冰片占比仅达0.18％左右，而由梅片树悬浮细胞内提取冰片占比达2％左右，是用嫩叶提取的11倍(图13)，提取冰片的效率大大提升。
[0104]
表5叶片与悬浮细胞提取冰片的质量和百分比
[0105][0106]
唐莉等人研究表明料液比1g:12ml、超声时间10min的条件下，龙脑樟叶内冰片提取率有所提高，本实验参照该方法分别对梅片树的嫩叶和悬浮细胞进行水蒸气蒸馏提取冰片，嫩叶所得冰片质量约为0.005g，占比0.18％；而梅片树悬浮细胞所得冰片质量约为0.06g，占比2％，则梅片树悬浮细胞所得冰片约为嫩叶所得的11倍。并且该实验为与叶片等质量的愈伤所诱导悬浮细胞内冰片含量，愈伤诱导实验发现一定质量的叶片往往可以诱导出远大于该质量的愈伤，因此同等质量叶片用于诱导愈伤和细胞后提取冰片，会比叶片直接用于提取冰片效益要高得多。

技术特征：
1.一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、摘取梅片树嫩叶，经消毒后将叶片切割成小块；s2、将切割好的叶片接入愈伤诱导培养基培养，诱导形成愈伤；所述的愈伤诱导培养基为如下(1)-(2)中的任意一种：(1)1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+6～12μmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0；(2)1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+5mg/l gln+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0；s3、取疏松愈伤，压碎后，将愈伤接种至悬浮培养基内进行悬浮细胞培养；培养2-3周后，获得悬浮细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s1的消毒，包括以下步骤：将嫩叶先用流水冲洗，再放入纯水浸泡15分钟，然后用灭菌过的纯水洗涤3次，每次15秒；再用体积分数75％乙醇水溶液洗涤3次，每次15秒；最后用质量分数5％naclo水溶液洗涤5分钟；然后于超净台用无菌纯水漂洗3次，每次15秒；叶片用滤纸上吸干表面水分。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s1中的将叶片切割成小块为将叶片切割成5mm
×
5mm大小的小块。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的愈伤诱导培养基为1/2ms培养基+3.0mg/l ba+1mg/l naa+12μmol/l mt+8g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养基为1/2ms培养基+3.0mg/lba+1mg/l naa+30g/l蔗糖，ph5.8～6.0。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s3，在获得悬浮细胞后进行继代培养，所述的继代培养是将悬浮细胞接种至新的悬浮培养基进行悬浮细胞培养。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2中的培养，其培养条件为：光照12h，黑暗12h，光照强度为2000～2500lx，相对湿度80％，温度为22℃。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s3中的培养，其培养条件为：于25℃、110r
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恒温振荡器进行暗培养。9.一种梅片树悬浮细胞的冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、预处理：取利用权利要求1所述的梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法获得的培养2-3周的悬浮细胞，离心，去除上层液后加入灭菌的0.2mol/l蔗糖溶液混匀，置于25℃、110r
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恒温振荡器暗培养24小时；s2、冻存：取经步骤s1处理的细胞，离心，去除上层液，用冷冻保护剂浸泡细胞，混匀后分装于冻存管内，冻存管装入梯度降温盒内，于-80℃超低温保存柜保存，隔天去盒存放；所述的冷冻保护剂为1/2ms培养基+10％蔗糖+10％dmso；s3、复苏：从-80℃超低温保存柜取出冻存管，放于39℃水浴锅解冻2-3分钟，使管内无冰块；解冻后立刻转移至离心管离心，用移液枪吸出上清，加灭菌的0.2mol/l蔗糖溶液洗涤2-3次，然后将细胞接入悬浮培养基内进行悬浮细胞培养。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的悬浮培养基为1/2ms培养基+3.0mg/lba+1mg/l naa+30g/l蔗糖，ph 5.8～6.0。

技术总结
本发明公开了一种梅片树叶片愈伤组织诱导及悬浮细胞培养方法。本发明在筛选出适合梅片树愈伤诱导条件的基础上，选取优良胚性梅片树愈伤组织，建立稳定的梅片树悬浮细胞培养方法，可以通过细胞系培养获取提取天然冰片的原材料，与叶片等质量的愈伤所诱导悬浮细胞内冰片含量为叶片冰片含量的11倍，该方法使得制取冰片的效率大大提升。本发明还提供梅片树悬浮细胞的冻存及复苏方法，该方法为未来梅片树内有效物质的储藏与应用提供了新的思路和方法。有效物质的储藏与应用提供了新的思路和方法。有效物质的储藏与应用提供了新的思路和方法。


技术研发人员：杨亚利 仝盼盼 张声源 张鲁斌 翟明 罗海华 龙思羽
受保护的技术使用者：嘉应学院
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/10/7