CAY10650在制备治疗肝癌和脂肪肝的药物中的应用

cay10650在制备治疗肝癌和脂肪肝的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及cay10650在制备治疗肝癌和脂肪肝的药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌是常见消化道恶性肿瘤之一，其中病理类型为肝细胞癌的占85％以上。肝细胞癌具有很高的发病率和死亡率，且患者就诊时多处于晚期，治疗效果尚不能令人满意，故怎样提升肝细胞癌患者治疗效果一直是全球性难题。肝细胞癌在早期有手术/消融等可能治愈的方法，但对于大部分中期或晚期患者的治疗方式及效果仍有待解决和提高。对于中晚期肝癌病人，有效的药物治疗可以减轻肿瘤负荷，改善肿瘤相关症状，提高生活质量，延长生存时间。目前，基于信号分子的靶向治疗药物是近年来肝细胞癌治疗的一种新方法，靶向治疗就是通过靶向识别肿瘤表达的抗原起到特异性抑制肿瘤的作用。索拉菲尼是肝细胞癌经典的一线靶向治疗药物，但其对中晚期肝细胞癌的缓解作用有限，特别是合并门脉癌栓的肝细胞癌患者中位生存时间仅仅延长约3.2个月。而且，目前现有的肝细胞癌靶向药治疗的效果都有限，故研发新的靶向药物的任务迫在眉睫。
3.脂肪代谢在肝细胞中发挥着重要的代谢功能，肝细胞脂肪代谢的改变对肝癌细胞及肝癌免疫微环境都有着显著影响。肿瘤细胞的脂肪代谢重编程是驱动肿瘤生存、进展、免疫逃逸、耐药以及疾病复发的关键。以肝癌细胞代谢为靶标可以增强对肝癌的治疗反应，并可以减少对正常细胞的药物毒性。因此，靶向肝癌细胞代谢过程是一种热门的癌症治疗形式。
4.非酒精性脂肪肝(nafld)是指因肥胖、2型糖尿病或代谢功能障碍导致肝脏脂肪变性的一系列疾病状态。nafld患病率高达25％，高脂饮食和膳食结构不合理等不健康饮食习惯与nafld发病率不断增高密切相关。在全球范围内，非酒精性脂肪肝(nafld)占所有肝癌病例的10％，在中国nafld相关肝癌的发病率预计在2016年和2030年之间增加82％。与肝癌相关病毒性肝炎(hbv或hcv)或酒精相关肝病相比，nafld-肝癌患者更有可能患有2型糖尿病(t2dm)和慢性血管疾病。尽管nafld相关肝癌的发病率低于活性病毒性肝炎相关肝癌，但随着nafld的流行率的上升，以及病毒性肝炎治疗的改善，nafld导致的肝癌的比例和发病率将越来越高。
5.针对nafld的治疗可以减轻脂肪肝并预防nafld癌变，针对nafld相关肝癌的脂代谢异常靶点治疗也是肝癌新的研究热点。
6.肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)是指围绕肿瘤细胞的细胞结构网络，不仅与肿瘤的发生、生长和转移密切相关，而且对肿瘤的治疗至关重要。越来越多的研究证实肝癌tme对肝癌发生发展至关重要。癌相关成纤维细胞(cafs)是tme的核心组成部分，占tme中基质细胞的比例超过50％。cafs主要由固有成纤维细胞或星状细胞在tgf-β等生长因子刺激下转化而来，通过分泌多种细胞因子、趋化因子与其他tme细胞相互作用，促进肿瘤生长、血管生成、侵袭和转移，以及免疫逃逸。cafs和肿瘤细胞之间的相互作用在肿瘤发生
和发展中起着关键的作用，靶向cafs治疗可减轻耐药增加放化疗敏感性。
7.综上，提供一种既可以减轻nafld、又可以通过抑制cafs促进肝癌细胞增殖作用从而抑制肝癌细胞增殖的药物具有重要的现实意义。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供的肝癌和脂肪肝的靶向药物cay10650，能特异性识别脂肪异常代谢的肝癌细胞，靶向杀伤肝细胞癌细胞、减轻脂肪肝。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供了cay10650在抑制肝癌细胞增殖中的应用。
11.本发明还提供了cay10650在抑制cafs细胞对肝癌细胞增殖的促进作用中的应用。
12.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述肝癌细胞包括smmc-7721、bel-7402、mhcc97、hepg2、hep3b、plc/prf/5或huh-7中的一种或多种。
13.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述cay10650在所述肝癌细胞的培养液中的浓度为3nm。
14.本发明还提供了cay10650在抑制肝癌生长或治疗肝癌中的应用。
15.本发明还提供了cay10650在降低血液中alt、ast或肝脏中tg中的应用。
16.本发明还提供了cay10650在改善脂肪肝、减轻肝功能损伤和/或减轻肝硬化中的应用；
17.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述脂肪肝包括非酒精性脂肪肝。
18.本发明还提供了cay10650在制备降低血液中alt、ast或肝脏中tg的药物中的应用。
19.本发明还提供了cay10650在制备抑制肝癌细胞增殖的药物或试剂中的应用。
20.本发明还提供了cay10650在制备抑制cafs细胞对肝癌细胞增殖的促进作用的药物或试剂中的应用。
21.本发明还提供了cay10650在制备治疗肝癌的药物中的应用。
22.本发明还提供了cay10650在制备治疗脂肪肝的药物中的应用；
23.所述脂肪肝包括非酒精性脂肪肝。
24.本发明还提供了cay10650在制备促进肝脂肪代谢、减轻肝纤维化、减轻肝硬化或减轻肝功能损伤的药物中的应用。
25.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述cay10650的剂量为1.5mg/kg。
26.本发明的肝癌和脂肪肝的新型靶向药物cay10650有如下效果：
27.(1)cay10650能够通过抑制肿瘤微环境中cafs细胞的促癌作用，抑制肝癌细胞增殖，抑制体内肝癌病灶生长。因此，本发明证实了cay10650在治疗肝细胞癌中发挥的重要作用。
28.(2)靶向药物常见的副反应为腹泻，手足综合征，厌食等，通过动物实验，未观察到cay10650治疗中的严重的副作用。
29.(3)cay10650可以促进肝细胞脂肪代谢，减轻高脂饮食导致的nafld。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
31.图1示mtt实验检测cafs细胞和癌细胞huh7共培养或共培养同时加入cay10650处理后细胞增殖曲线；横轴为时间；纵轴为吸光度；ctrl为对照组；huh7+cafs为huh7和cafs共培养组；huh7+cafs+cay10650为huh7和cafs共培养同时通过cay10650治疗组；**为p《0.01；ns为p》0.05；
32.图2示cay10650对肝癌模型小鼠肿瘤重量的影响；***为p《0.001；
33.图3示cay10650对nafld模型小鼠脂肪肝的影响；**为p《0.01；***为p《0.001。
具体实施方式
34.本发明公开了cay10650在制备治疗肝癌和脂肪肝的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
35.本发明的第一个目的是发现一类新的药物，能特异性识别脂肪异常代谢的肝癌细胞，靶向杀伤肝细胞癌细胞，并尽可能减轻脂肪肝(nafld)。
36.cay10650是一种高效的胞浆磷脂酶a2α(cpla2α)抑制剂(cay10650结构如式i所示)，ic50值为12nm。在本发明中，通过实验发现cay10650可以减轻nafld的脂肪肝并抑制肝癌增殖。cay10650通过抑制高脂饮食导致的肝细胞内脂滴形成减轻nafld，同时也能抑制cafs促进肝癌细胞增殖的作用。因此，cay10650是针对高脂饮食诱导的nafld相关肝癌理想的靶向药物，既可以减轻nafld，又可以抑制肝癌细胞增殖。通过本发明的研究发现cay10650疗效及安全性均在细胞和动物模型中得到了验证。
[0037][0038]
本发明涉及的试剂、仪器及生物材料包括：
[0039]
1、细胞系
[0040]
人huh7肝癌细胞来自中国科学院细胞库(中国上海)。所有无支原体细胞在dmem-高葡萄糖培养基(美国马萨诸塞州海克隆)培养，补充10％胎儿牛血清。
[0041]
2、实验动物
[0042]
(1)用于构建肝癌异种移植瘤模型的雄性balb/c裸鼠(5周龄)购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
[0043]
(2)构建高脂饮食导致的nafld模型，雄性c57bl/6j鼠(5周龄)购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
[0044]
(3)hfd饲料(d12492；60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白质)。
[0045]
3、药物
[0046]
(1)cay10650购买自mce(medchemexpress)，是一种高效的胞浆磷脂酶a2α(cpla2α)抑制剂，ic50值为12nm。
[0047]
(2)小鼠血清谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，alt)、血清天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，ast)，肝脏三酰甘油(triglycerides，tg)、试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，由新疆医科大学附属肿瘤医院检验科进行测试。
[0048]
本发明中的所涉及统计学处理包括：
[0049]
数据分析采用spss 22.0软件进行，计量资料使用均数
±
标准差表示。显著性水平(α)被设定为0.05，两组之间采用student t检验；三组及以上采用单因素方差分析(one-way anova)或多因素方差分析(two-way anova)。
[0050]
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
[0051]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0052]
实施例1：细胞培养
[0053]
(1)人类肝癌细胞系huh7和hcclm3购买自中国科学院(中国上海)。在37℃和5％co2的细胞培养箱中培养，将细胞培养在补充有10％胎牛血清(fbs，gibco，usa)、青霉素(100u/ml)和链霉素(100mg/ml)(gibco，usa)的高糖dmem中，在37℃，5％co2及饱和湿度的条件下培养。
[0054]
(2)液氮中取出细胞后，迅速放入37℃温水中，快速复温后转入含有完全培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，离心机800r
×
5min离心，弃上清液，向细胞沉淀中加入完全培养基混匀后转入培养箱中。
[0055]
(3)取出细胞，pbs清洗两遍后弃净，加入600μl胰酶，细胞由完全贴壁状态变为椭圆形或圆形后弃去胰酶，加入完全培养基终止消化，吹落培养瓶上的细胞，混匀后吸入离心管中，800rpm
×
5min离心弃上清液，加入完全培养基，混匀后转入细胞培养瓶中。
[0056]
(4)预先按照dmso：dmem：血清＝1:4:5的比例配置冻存液，消化细胞后获得细胞悬液，离心并弃去上清液，将冻存液加入细胞沉淀中，混匀后移入冻存管中，依次置于4℃中30分钟；-20℃中2小时；-80℃中保存，以达到缓慢降温的效果。-80℃冰箱中过夜后移入液氮中保存。
[0057]
(5)流式分选提取cafs：选取m-hcc术后新鲜标本，立即用pbs清洗3次，在培养基中用剪刀轻柔修剪呈大约1mm3大小的组织块，用10ml0.1％胰蛋白酶溶液和0.75μg/μl胶原酶i消化。37℃恒温摇床消化2小时后，通过过滤器收集原代细胞。接下来，通过流式分选(facs)纯化cafs细胞。通过facs分离，将α-sma阳性细胞重新悬浮，并用10％双抗(青霉素/链霉素)溶液及pbs分别清洗后，接种在dmem、1％双抗、10％胎牛血清(fbs)中培养，24小时后更换培养基去除漂浮细胞，得到纯化的cafs细胞。
[0058]
实施例2：mtt
[0059]
处于对数生长期的实施例1获得的细胞，0.25％胰蛋白酶消化置备细胞悬液，吹打至单个细胞。调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入100μl共2000细胞于96孔板每孔内，至细胞单层铺满孔底，边缘孔用无菌pbs填充。接种4小时细胞贴壁后，取dmso(1％)或cay10650
(3nm)进行干预，继续用5％co2，37℃细胞培养箱进行培养，当培养终点时，每孔加入20μl mtt溶液，孵育4h后终止，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od 490nm处测量各孔的吸光值。
[0060]
实施例3：肝癌动物模型建立
[0061]
应用balb/c裸鼠建立肝细胞癌动物模型，应用5周龄的雄性裸鼠，对照组(ctrl组)在裸鼠背部一侧皮下注射肝癌huh7细胞(100μl，105个细胞)；huh7和cafs共培养组在裸鼠背部一侧皮下注射肝癌huh7细胞(50μl，105个细胞)和cafs(50μl，105个细胞)；cay10650组在裸鼠背部一侧皮下注射肝癌huh7细胞(50μl，105个细胞)和cafs(50μl，105个细胞)。3天后，观察裸鼠背部均形成皮下肿瘤。对照组和共培养组给与100μl含1％dmso的pbs缓冲液，腹腔注射(每两天一次)；cay10650组小鼠给予cay10650(用1％dmso溶解cay10650，用pbs稀释，使剂量为1.5mg/kg)，腹腔注射(每两天一次)。药物干预两周后，处死小鼠，记录小鼠病灶长宽及重量，根据以下公式计算病灶体积：v＝长
×
宽2×
0.52。
[0062]
实施例4：hfd诱发的nafld动物模型建立
[0063]
对8周雄性c57bl/6j小鼠喂养hfd饲料，经过24周喂养，建立nafld模型。建模成功后，对照组和共培养组给与100μl 1％dmso腹腔注射(每两天一次)；cay10650组小鼠给予100μl cay10650(1.5mg/kg)腹腔注射(每两天一次)。
[0064]
喂养结束时，取小鼠眼眶静脉血；血液静置于无内毒素试管2h，在4℃、1000
×
g条件下离心10min后取上清液(血清)。血清alt、ast，肝脏tg检测均按照试剂盒说明书进行。取血后，用颈椎脱位法处死小鼠，剥离肝脏。肝脏称质量后，取1cm
×
1cm
×
0.5cm大小肝组织，浸于4％多聚甲醛固定24h，随后用浓度递增乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后切片。苏木精-伊红(h-e)染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用苏木精染色10s，水洗，1％盐酸乙醇分化数秒，水洗，1％氨水返蓝30s，再次水洗，用伊红染液染色2min，洗涤；常规用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。天狼星红染色：将石蜡切片梯度脱蜡后，用苏木精染液染色10s，水洗，天狼星红染液滴染1h，水洗；常规脱水，透明，中性胶封片，光学显微镜下观察cay10650治疗nafld效果。
[0065]
效果例1：cay10650抑制肝癌细胞增殖能力
[0066]
为了评估cay10650对于肝细胞癌细胞增殖能力的影响，使用mtt实验检测了cay10650处理后huh7细胞增殖能力的变化，方法步骤如实施例2所述。mtt实验显示cafs和癌细胞共培养组，癌细胞增殖速度明显高于对照组(huh7)；cay10650组(cafs和癌细胞共培养同时加入cay10650)后癌细胞增殖速度显著低于cafs和癌细胞共培养组，p《0.001(如图1和表1所示)。mtt实验结果表明cay10650可以抑制肝癌细胞增殖能力。
[0067]
表1：mtt实验检测cafs细胞和癌细胞huh7共培养或共培养同时加入cay10650处理后od值变化
[0068] day0day1day2day3ctrl(huh7)0.220.550.831.17ctrl(huh7)0.230.570.891.29ctrl(huh7)0.260.620.861.14huh7+cafs0.220.661.081.68huh7+cafs0.250.731.151.77
huh7+cafs0.240.761.271.93huh7+cafs+cay106500.270.680.941.14huh7+cafs+cay106500.230.640.981.35huh7+cafs+cay106500.250.590.811.26
[0069]
效果例2：cay10650抑制小鼠肝癌病灶生长
[0070]
按照实施例3的方法步骤，通过建立小鼠模型构建肝癌动物模型，对模型小鼠进行药物干预，评估cay10650对于肝癌的治疗作用。病灶体积测量结果提示，相比于对照组，共培养组小鼠病灶体积和重量最大，说明cafs可以在体内促进肝癌生长；cay10650组小鼠重量和体积均显著小于共培养组，p《0.05(如图2、表2和表3所示)。实验结果说明：cay10650可以在体内显著抑制cafs促进肝癌生长的作用。
[0071]
表2：cay10650对肝癌模型小鼠病灶体积的影响
[0072]
组别数目最小值最大值均值(mean)标准差(sd)ctrl6419.9491.2455.9327.227huh7+cafs6544.5655.1605.7243.597huh7+cafs+cay106506406.6491.8449.1731.897
[0073]
表3：cay10650对肝癌模型小鼠病灶重量的影响
[0074]
组别数目最小值最大值均值(mean)标准差(sd)ctrl60.530.70.620.06957huh7+cafs60.780.940.851670.065549huh7+cafs+cay1065060.530.790.628330.097245
[0075]
效果例3：cay10650减轻nafld模型小鼠的脂肪肝
[0076]
按照实施例4的方法步骤，通过对8周雄性c57bl/6j小鼠喂养hfd饲料，建立nafld模型。应用cay10650治疗的小鼠转氨酶(alt和ast)，甘油三酯(tg)检测均显著低于对照组，天狼星红染色，观察到cay10650治疗组的肝纤维化区域明显少于对照组(如图3、表4～7所示)。以上实验证明cay10650可以有效减轻脂肪肝(nafld)导致的肝功能损伤和肝硬化。
[0077]
表4：cay10650对nafld模型小鼠肝功能alt的影响
[0078]
alt(u/l)数目最小值最大值均值(mean)标准差(sd)ctrl648.365.156.21716.95cay10650613.222.316.9516.95
[0079]
表5：cay10650对nafld模型小鼠肝功能ast的影响
[0080]
ast(u/l)数目最小值最大值均值(mean)标准差(sd)ctrl640.854.447.3175.1511cay10650622.334.928.9175.2082
[0081]
表6：cay10650对nafld模型小鼠肝功能tg的影响
[0082]
tg(mmol/l)数目最小值最大值均值(mean)标准差(sd)ctrl65.087.86.611.02cay1065061.593.722.700.97
[0083]
表7：cay10650对nafld模型小鼠肝纤维化的(天狼星红染色)影响
[0084][0085]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.cay10650在制备降低血液中alt、ast或肝脏中tg的药物中的应用。2.cay10650在制备抑制肝癌细胞增殖的药物或试剂中的应用。3.cay10650在制备抑制cafs细胞对肝癌细胞增殖的促进作用的药物或试剂中的应用。4.cay10650在制备治疗肝癌的药物中的应用。5.cay10650在制备治疗脂肪肝的药物中的应用；所述脂肪肝包括非酒精性脂肪肝。6.cay10650在制备促进肝脂肪代谢、减轻肝纤维化、减轻肝硬化或减轻肝功能损伤的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，特别涉及CAY10650在制备治疗肝癌和脂肪肝的药物中的应用。经实验验证CAY10650能够通过抑制肿瘤微环境中CAFs细胞的促癌作用，抑制肝癌细胞增殖，抑制体内肝癌病灶生长，促进肝细胞脂肪代谢，减轻高脂饮食导致的NAFLD，且未观察到CAY10650治疗中的严重的副作用。CAY10650治疗中的严重的副作用。


技术研发人员：晏冬 佟庆
受保护的技术使用者：新疆医科大学第三附属医院
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/7