6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸及其制备方法和用途

1.本发明涉及生物医药领域。更具体地说，本发明涉及6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸及其制备方法和用途。


背景技术：

[0002]
已有研究(chen ms,lee rt,garbern jc.senescence mechanisms and targets in the heart.cardiovasc res.2022mar 25；118(5):1173-1187.doi:10.1093/cvr/cvab161.)证实，心脏细胞的衰老是导致动脉粥样硬化、心肌梗死和心脏纤维化等多种心血管疾病的功能退变的主要因素。心脏纤维化是心脏衰老的一个标志性事件，它随年龄增长而增加。心脏纤维化的减少有利于维持心脏器官的正常功能。另外也有研究(1)zhao y,simon m,seluanov a,gorbunova v.dna damage and repair in age-related inflammation.nat rev immunol.2023feb；23(2):75-89.doi:10.1038/s41577-022-00751-y.(2)schumacher b,pothof j,vijg j,hoeijmakers jhj.the central role of dna damage in the ageing process.nature.2021apr；592(7856):695-703.doi:10.1038/s41586-021-03307-7.证实，dna损伤的累积被认为是诱导细胞死亡、衰老和组织功能退变的主要起始因素。因此，维护细胞基因组稳定性有利于从细胞命运的根本上抑制细胞衰老，促使衰老器官重新迈入正常功能的轨道。
[0003]
目前市售治疗心脏纤维化的药物暂未发现兼具保护细胞基因组稳定性和抵抗细胞衰老的功能。


技术实现要素：

[0004]
本发明的一个目的是提供6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸这种化合物，该化合物是对申请号202210976338.5中所述化合物结构优化升级后新合成的化合物，该化合物具有保护细胞基因组稳定、抵抗心肌细胞衰老和防治心脏纤维化的功效，能够预防心血管疾病。
[0005]
本发明的另一个目的是提供6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，本发明化合物的合成路线采用两步合成法，具有简单高效、绿色低毒的特点，所用原料及辅助材料仅有微弱刺激性气味，对人体健康和生态环境无明显危害。
[0006]
本发明的还一个目的是提供6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的应用，该化合物具有抑制多种肿瘤(肝癌、高转移性肝癌、肺癌、急性单核细胞白血病、结肠癌、前列腺癌)细胞生长、保护细胞基因组稳定性、治疗心脏纤维化的功效。
[0007]
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸，化学结构式如式(i)所示：
[0008][0009]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
s1.1,4-二苯基-1,3丁二烯与马来酸酐在二甲苯蒸汽和碱性溶液中反应得到产物一；
[0011]
s2.产物一与苯胺衍生物在弱酸环境中反应获得目标化合物。
[0012]
优选的是，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，所述苯胺衍生物为3-甲基苯胺、3-乙基苯胺、3,5-二甲基苯胺、对甲基苯胺或对乙基苯胺中的一种或几种。
[0013]
优选的是，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，s1中的反应条件为180℃、湿度65％，反应时间不小于10h。
[0014]
优选的是，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，s2中的反应条件为弱酸、干燥环境，反应时间20～30min。
[0015]
优选的是，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，所述碱性溶液为氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液中的一种或几种。
[0016]
优选的是，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，所述弱酸为冰醋酸、碳酸中的一种或几种。
[0017]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备抑制细胞衰老、保护基因组稳定性的药物中的应用。
[0018]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗肝癌、高转移性肝癌、肺癌、急性单核细胞白血病、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。
[0019]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗心脏纤维化的药物中的应用。
[0020]
本发明至少包括以下有益效果：
[0021]
本发明制备的化合物具有抑制多种肿瘤(肝癌、高转移性肝癌、肺癌、急性单核细胞白血病、结肠癌、前列腺癌)细胞生长、抑制细胞衰老、保护心肌细胞基因组稳定性、抑制心脏纤维化的功效。
[0022]
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0023]
图1是本发明目标化合物的nmr图；
[0024]
图2是对多种癌细胞活性od值的测试图；
[0025]
图3是对心肌衰老细胞干预前后的染色鉴定图；
[0026]
图4是对小鼠心脏纤维化干预前后的染色鉴定图；
[0027]
图5是本发明化合物实物图。
具体实施方式
[0028]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0029]
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0030]
实施例1
[0031]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸，化学结构式如式(i)所示：
[0032]
该化合物以下用代号cxm10012表示。
[0033]
制备的化合物的实物图如图5所示。
[0034]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
s1.将1,4-二苯基-1,3丁二烯与马来酸酐按质量比1:2.5比例混合，在二甲苯蒸汽和质量分数为65％的氢氧化钾(koh)溶液中反应10小时，然后冷却至常温得到产物一；
[0036][0037]
s2.将产物一与3-乙基苯胺按质量比2：1比例混合，在弱酸环境中反应20～30分钟，获得目标化合物。
[0038]
[0039]
所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，s1中的反应条件为180℃、湿度65％。
[0040]
所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法中，s2中的反应条件为室温、干燥通风环境，反应时间20～30分钟。
[0041]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备保护心肌细胞基因组稳定性、抑制心脏衰老药物中的应用。
[0042]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗肝癌、高转移性肝癌、结肠癌、肺癌、急性单核细胞白血病细、前列腺癌的药物中的应用。
[0043]
6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗老年性心脏纤维化药物中的应用。
[0044]
实验
[0045]
1、体外抗肿瘤活性实验
[0046]
采用mtt方法，参考发明专利申请号202210976338.5中实验操作对人肝癌hep3b细胞、高转移性肝癌hcclm3细胞、结肠癌hct116细胞、肺癌a549细胞、单核细胞白血病thp-1细胞、前列腺癌du145细胞进行体外细胞毒性测定。
[0047]
将培养板置于37℃、5％co2及饱和湿度的条件下培养12h后，每孔加入10μlcck-8溶液，继续培养2h，置于摇床上低速震荡5min，用酶标仪(光源为450nm波长)检测各孔的od值，od值越高表明细胞存活越多，越低则表明细胞存活越少。测得结果如图2所示，图2中左上角的图，表示不同药物浓度下(0、5、10、20、30、50μm)在12h和24h时所测得的细胞活性，由此可见肝癌细胞经该化合物处理12h后即表现出明显的活性下降，即本发明所述化合物具有抑制肝癌细胞生长功效。因此，在对上述其他细胞的活性进行测试时，只需测定化合物处理12h后的细胞活性即可评估该化合物对细胞活性的调控作用。最后，将每种细胞在化合物处理12h下的细胞活性经换算获得药物ic50浓度，结果见表1。
[0048]
表1各细胞对应的药物ic50浓度值
[0049]
细胞株ic50(μm)hep3b62.5hcclm380hct11622.5a54965thp-18.5du14512
[0050]
由表1可知，本发明的化合物cxm10012与申请号202210976338.5中所述化合物cxm102具有类似的抑制癌细胞生长效果，但抑制作用更明显。
[0051]
2、体外抑制细胞衰老和维护人心肌细胞基因组稳定性实验
[0052]
采用细胞衰老特异性蛋白标志物p16ink4a和细胞基因组损伤γh2ax的双重染色进行鉴定。
[0053]
将人心肌细胞种于含有质量分数为10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(双抗)的专用干细胞培养液，置于37℃、5％co2及饱和湿度的培养皿中培养，每3天换一次液，待细胞长满培养皿后用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化后进行传代培养。
[0054]
取培养液中生长至对数生长期的细胞，用含10％胚胎牛血清和1％双抗的培养液配成浓度为1
×
105/ml的单个细胞悬液，按每孔10000个细胞接种于12孔细胞培养板，于37℃、5％co2及饱和湿度的条件下培养24h。细胞贴壁后，在实验组中加入实施例1中的化合物和600μm浓度的过氧化氢，作为实验组；其中，对于实验组中的抗细胞衰老的化合物的添加，设置2个浓度梯度(10μm、20μm)。同时设置阴性对照组，阴性对照组只加600μm过氧化氢且不加入实施例1中的化合物。其中，过氧化氢处理细胞时间为2h，而后换一半新鲜培养基继续培养12h。
[0055]
(2)对于细胞衰老和细胞基因组损伤的分子标志物的鉴定，分别用细胞衰老特异性分子p16ink4a的抗体和基因组损伤特异性分子γh2ax的抗体对细胞内分子的表达水平同时进行免疫荧光染色鉴定。将培养基从孔板吸干后用pbs缓冲液清洗一次，用质量分数为4％的多聚甲醛(每孔500μl)处理细胞20min，然后用质量分数为0.1％的triton溶液(100μl)处理细胞10min，再用质量分数为1％的bsa(50μl)稀释的分子p16ink4a、γh2ax抗体稀释液(1:200)4℃孵育细胞12h，pbs缓冲液洗净后用荧光抗体室温孵育1h，最后用dapi染液对细胞核染色10min，而后洗净在显微镜下拍照，如图3所示，左边一列control表示不经本发明实施例1化合物处理的细胞，中间一列和右边一列cxm10012分别表示用10μm、20μm实施例1化合物处理细胞。图中绿色表示细胞衰老特异性分子标志物p16ink4a，绿色越多表明细胞衰老越多。红色表示细胞基因组损伤特异性分子标志物γh2ax，红色越多表明细胞基因组损伤越多。蓝色表示细胞定位染色(dapi)，一个蓝色表示一个细胞。merge表示将表达p16ink4a和γh2ax分子的图片和细胞定位合成图，便于观察衰老细胞内表达p16ink4a和γh2ax的分布情况。由此可见，本发明化合物能抑制mscs衰老，并能促进细胞基因组损伤后的修复。
[0056]
3、体内抑制老龄鼠心肌纤维化实验
[0057]
为检测心肌纤维化情况，采用masson染液对心脏组织切片进行染色。
[0058]
实验设置年轻对照组、老龄鼠dmso注射对照组和老龄鼠给药实验组。给药实验组按10mg/kg剂量通过肌肉注射方式给16月龄c57bl6小鼠给药，每周注射给药两次。对照组按药物等体积(10μl)肌肉注射。3月后处死小鼠取肾脏，用质量分数为4％的多聚甲醛浸泡48h，而后用质量分数为30％的蔗糖浸泡，直至心脏组织块从悬浮状态沉底，再进行冷冻切片。染色时，将切片再用质量分数为4％的多聚甲醛浸泡20min，pbs洗净后用masson染液进行染色，10min后用pbs洗净，显微镜下拍照，如图4所示，图中蓝色越多，表明心脏纤维化越严重。由此可知，与年轻鼠(如图4第一行所示)相比，老龄鼠心脏(如图4第二行所示)发生了严重的纤维化变化，在经过本发明实施例1化合物处理后，老龄鼠心脏纤维化显著减少(如图4第三行所示)，表明本发明化合物可抑制老龄鼠心脏纤维化。
[0059]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例和实施例。

技术特征：
1.6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸，其特征在于，化学结构式如式(i)所示：2.6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.1,4-二苯基-1,3丁二烯与马来酸酐在二甲苯蒸汽和碱性溶液中反应得到产物一；s2.产物一与苯胺衍生物在弱酸环境中反应获得目标化合物。3.如权利要求2所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，所述苯胺衍生物为3-甲基苯胺、3-乙基苯胺、3,5-二甲基苯胺、对甲基苯胺或对乙基苯胺中的一种或几种。4.如权利要求2所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，s1中的反应条件为180℃、湿度65％，反应时间不小于10h。5.如权利要求2所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，s2中的反应条件为弱酸、干燥环境，反应时间20～30min。6.如权利要求2所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液中的一种或几种。7.如权利要求2所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，所述弱酸为冰醋酸、碳酸中的一种或几种。8.如权利要求1所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备抑制细胞衰老、保护基因组稳定性的药物中的应用。9.如权利要求1所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗肝癌、高转移性肝癌、肺癌、急性单核细胞白血病、结肠癌、前列腺癌药物中的应用。10.如权利要求1所述的6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸在制备治疗心脏纤维化的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸及其制备方法和用途，6-{[(3-乙基苯)氨基]羰基}-2,5-二苯基环己-3-烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：1,4-二苯基-1,3丁二烯与马来酸酐在二甲苯和碱性溶液中反应得到产物一；产物一与苯胺衍生物在弱酸环境中反应获得目标化合物。本发明制备的化合物具有抑制多种癌细胞生长、抵抗细胞衰老、保护细胞基因组稳定性和抑制老龄化心脏纤维化的功效。纤维化的功效。纤维化的功效。


技术研发人员：罗自维 张振伟 高红伟 崔浩 凌勇威 周红海
受保护的技术使用者：广西中医药大学
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/7