一种蛋白酶提取的预处理工艺及应用的制作方法

1.本发明涉及一种蛋白酶提取的预处理工艺及应用，属于工业酶制剂加工技术领域。


背景技术：

2.蛋白酶作为一种生物催化剂，通过催化肽键水解将蛋白质类大分子物质分解为多肽和氨基酸。根据蛋白酶催化反应的最适ph值，可将蛋白酶分为酸性蛋白酶(ph 2.5-5.0)、中性蛋白酶(ph 7.0-8.0)和碱性蛋白酶(ph 9.5-10.5)。2019年蛋白酶产值约为13.4亿美元，占到了工业酶制剂市场的28％，涉及到皮革加工、肉类加工、洗涤日化、食品加工、饲料加工、生物活性肽、生丝羽绒、乳制品加工等各个行业，具有很大的市场价值。
3.目前碱性蛋白酶的品种主要有2709型，主要有地衣芽孢杆菌通过液体深层高密度发酵获得。其生产过程主要包括种子液培养、深层发酵以及蛋白酶提取。其中蛋白酶的提取工艺复杂，在提取过程中要求既要保持蛋白酶的活性，又要将提取成本降低至最低，因此，研究蛋白酶提取工艺显得十分必要。


技术实现要素：

4.为解决上述的问题，本发明提供了一种蛋白酶提取的预处理工艺及应用。此提取制备方法包括在对蛋白酶提取的预处理过程中使用的工艺方法、药剂类型、药剂配方。使用该预处理方法，蛋白酶的提取效率可以提高2倍以上。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明提供了一种蛋白酶提取的预处理工艺，所述的预处理工艺中包括具体的处理方法及药剂配方。
7.所述的预处理工艺采用无机盐作为主要絮凝剂，改变发酵液原液的胶体性能，调整发酵液的酸碱度之后，再使用聚丙烯酰胺(pam)作为助凝剂，将发酵液原液中的杂质以絮状沉淀的形式从原液中沉淀下来。所述的预处理药剂类型包括氯化钙-硫酸镁无机絮凝剂，氢氧化钠调碱剂，pam有机助凝剂。
8.在本发明的一种实施方式中，所述的无机絮凝剂氯化钙和硫酸镁与发酵液原液的质量比均为1:500；
9.在本发明的一种实施方式中，所述的预处理过程中的液体ph为8.0-8.5.
10.在本发明的一种实施方式中，所述的预处理过程中所述的助凝剂为聚丙烯酰胺。
11.在本发明的一种实施方式中，所述的蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶及其他以芽孢杆菌发酵生产的蛋白酶。
12.本发明提供了上述一种蛋白酶提取的预处理工艺，所述工艺的步骤如下：在50r/min的低速搅拌下，每1l发酵液原液中分别均匀加入10ml200g/l的氯化钙浓溶液和10ml200g/l硫酸镁浓溶液，反应5min，使用40g/l氢氧化钠缓慢调节发酵液酸碱度为8.0-8.5，搅拌5min，充分混匀，最后均匀地加入10ml1.6g/l的聚丙烯酰胺溶液，并持续搅拌
5min，形成絮凝沉淀。
13.本发明的有益效果在于：
14.(1)本发明选用的无机盐絮凝剂，有效解决了在使用铝盐类无机絮凝剂中的蛋白酶存在铝残留问题，避免了铝离子残留引起的健康风险问题。
15.(2)本发明选用的无机盐絮凝剂，有效解决了在使用铝盐类无机絮凝剂中产生的含铝残渣问题，避免了含铝残渣处理中产生的高昂的危废处置成本。
16.(3)本发明选用的无机盐絮凝剂，有效解决了在使用铁盐类无机絮凝剂中蛋白酶损失的问题，预处理前后蛋白酶酶活未发生降低，回收率100％。
17.(4)本发明使用的蛋白酶提取的预处理工艺，显著提高了蛋白酶的提取效率，通过絮凝作用，将发酵液中大部分残渣以沉淀的形成分离出来，大大提高后续工艺的提取效率和设备损耗。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中使用预处理工艺后的分离效果图；
19.图2为本发明实施例2中使用预处理工艺后的絮凝沉淀图片。
具体实施方式
20.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体的实施例以及附图对本发明作进一步的详细说明。
21.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。
22.实施例1
23.对地衣芽孢杆菌2709产的碱性蛋白酶发酵原液进行预处理，具体步骤如下：
24.步骤1)、配制无机絮凝剂溶液，分别称取无水氯化钙和无水硫酸镁20g，分别定溶于100ml；
25.步骤2)、ph调碱液，称取片碱40g，定溶于1l。
26.步骤3)、配制有机絮凝剂容易，称取1.6g聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的种类可为阳离子聚丙烯酰胺、阴离子聚丙烯酰胺、中性聚丙烯酰胺中的一种或多种。在搅拌机100r/min的搅拌速率下，加入1l自来水中，均匀搅拌30min以上，使聚丙烯酰胺充分容易，停止搅拌，放置8h以上，使聚丙烯酰胺充分溶解水化。
27.步骤4)、取10l碱性蛋白酶发酵原液，打开搅拌机，调整转速为50r/min，缓慢均匀地加入步骤1)中配制的氯化钙溶液100ml，搅拌均匀后，缓慢均匀地加入步骤1)中配制的硫酸镁溶液100ml，搅拌均匀。
28.步骤5)、在50r/min的搅拌速度下，缓慢加入步骤2)中配制的naoh溶液，使用ph试纸随时检测发酵液的ph值，最终使ph值稳定在8.0-8.5之间。
29.步骤6)、在50r/min的搅拌速度下，缓慢加入步骤3)中配制的聚丙烯酰胺助凝剂溶液，加入量约10ml，根据发酵液中发酵配方的不同，助凝剂用量略有调整，需要边加入助凝剂边观察絮凝情况，直至形成絮状沉淀为止。
30.步骤7)、絮凝前后的发酵液取10ml置于15ml离心管中，分别在3000r/min、6000r/
min、9000r/min的转速下离心5min，检测絮凝分离效果。
31.结果如1图和表1所示，从图1中可以看出，经过预处理工艺之后的发酵液，经过离心分离，可以将发酵液中的固体残渣轻易分离出来。从表1中可以看出，在3000r/min时，发酵液中固液分离的效率提升了8倍，即使是高转速下，也提升了2倍，表明使用预处理工艺后，可以再后续的离心分离中使用更低转速进行固液分离，获得较好的效果，大大降低了后续分离的能耗和设备要求。
32.表1预处理前后不同转速下的离心分离效果
33.编号样品离心转速r/min沉淀物/g提升倍数1发酵液原液30000.1790/2发酵液原液60000.4486/3发酵液原液90000.4750/4预处理后发酵液30001.48998.35预处理后发酵液60001.20352.76预处理后发酵液90000.96872.0
34.实施例2
35.对实施例1中絮凝前后的酶活进行检测。
36.步骤1)、分别取实施案例1预处理工艺前后的发酵液各10ml，9000r/min离心5min，上清液作为蛋白酶酶活待测液体。
37.步骤2)、将蛋白酶酶活待测液按照标准蛋白酶酶活测定方法(gb/t28715-2012)测定蛋白酶活性。
38.结果详见表2和图2：从表2中可见，使用实施案例1的预处理工艺后，酶收率为79％-95％，根据图2中对絮凝沉淀的观察，确定絮凝效果，以上清液为澄清状、絮状沉淀最大为最佳。从表2中可知，pam的使用量越大，絮凝效果越好，但酶收率相对较低，因此在使用pam助凝剂时，需一边加入pam助凝剂一边观察，尽量减少pam使用量。在成本允许的情况下，可以适当增加氯化钙和硫酸镁的用量增强聚沉效果，不会引起酶收率的降低。
39.表2使用本发明预处理工艺前后的蛋白酶收率
[0040][0041]
注：“+++”:絮凝效果明显；“++”：絮凝效果较明显；“+”：有絮凝；
“‑”
：无絮凝。
[0042]
步骤3)、将实施案例1中的无机盐絮凝剂改为常用的絮凝剂-聚合氯化铝(pac)进行对比试验。
[0043]
结果详见表3：从表3中可见，使用常见的铝盐作为絮凝剂，上清液的酶活最高能保存84％，与表2中的酶收率相当。
[0044]
表3使用铝盐(pac)絮凝前后的蛋白酶收率
[0045]
样品上清液酶活u/ml酶收率％对照组原液11464-1.0％pac9635841.5％pac9424822.0％pac9635842.5％pac9530833.0％pac7877693.5％pac777168
[0046]
步骤4)、将步骤3)中以铝盐(pac)为絮凝剂进行絮凝后的上清液，使用电感耦合等离子体法(icp)检测其中的铝离子含量。
[0047]
结果详见表4：从表4中可见，金属铝离子含量为14ppm，明显存在铝离子残留的风险，且其余的铝离子随着絮凝沉淀以残渣的形式被分离出来，含铝残渣的特殊处理需要生产单位付出较高的处理成本。
[0048]
表4使用铝盐(pac)絮凝前后蛋白酶溶液中的铝离子残留
[0049]
样品铝离子含量/ppm对照组原液2.581.0％pac11.981.5％pac14.032.0％pac11.562.5％pac4.633.0％pac2.743.5％pac2.58
[0050]
步骤5)、将实施案例1中的无机盐絮凝剂改为常用的絮凝剂-聚合硫酸铁进行对比试验。
[0051]
结果详见表5：从表5中可见，使用常见的铁盐(聚合硫酸铁)作为絮凝剂，上清液的酶活最高能保存78％，铁盐使用得当也可以作为一种蛋白酶发酵液预处理的絮凝剂，但是随着在铁盐使用量增加时，酶收率会大幅度降低，增加了使用难度及风险。
[0052]
表5使用铁盐絮凝前后的蛋白酶收率
[0053]
样品上清液酶活u/ml酶收率/％对照组原液13749/1.0％10725781.5％7771572.0％9857
[0054]
上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的预处理药剂配方和工艺可用于提升蛋白酶的提取效率。所述的预处理工艺和药剂配方包括如下：在低速搅拌下，均匀加入氯化钙浓溶液和硫酸镁浓溶液，缓慢调节发酵液酸碱度充分混匀，最后均匀地加入助凝剂聚丙烯酰胺溶液，并持续搅拌形成絮凝沉淀。2.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的搅拌速度为50r/min。3.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的氯化钙浓溶液和硫酸镁浓溶液的浓度为200g/l。4.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的氯化钙浓溶液和硫酸镁浓溶液的用量为每1l发酵液依次加入10ml。5.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的调节发酵液酸碱度的ph为8.0-8.5。6.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的助凝剂聚丙烯酰胺溶液浓度为1.6g/l。7.如权利要求1所述的一种蛋白酶提取的预处理工艺，其特征在于，所述的助凝剂加入量为每1l发酵液，缓慢加入10ml1.6g/l聚丙烯酰胺溶液。8.权利要求1-7任一所述的一种提取工艺在蛋白酶提取加工过程中的应用。

技术总结
本发明公开了一种蛋白酶提取的预处理工艺及应用，属于工业酶制剂加工技术领域。为了提高蛋白酶的提取效率，本发明提供了上述一种蛋白酶提取的预处理工艺，所述工艺的步骤如下：在50r/min的低速搅拌下，每1L发酵液原液中分别均匀加入10mL200g/L的氯化钙浓溶液和10mL200g/L硫酸镁浓溶液，反应5min，使用40g/L氢氧化钠缓慢调节发酵液酸碱度为8.0-8.5，搅拌5min，充分混匀，最后均匀地加入10mL1.6g/L的聚丙烯酰胺溶液，并持续搅拌5min，形成絮凝沉淀。使用本发明所公开的提取工艺，可提高离心分离效率2倍以上，酶收率在80％以上，且无有害金属残留和固废产生。害金属残留和固废产生。


技术研发人员：马鑫 黄海萍 廖振威 兰恩牛 朱鹏 周小峰 蔡振山
受保护的技术使用者：山东准诺检测有限公司
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/7