一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒与流程

一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于食品检测领域，尤其涉及一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒。


背景技术：

2.细菌性食物中毒占我国食物中毒总数的首位，动物性食品是引起细菌性食物中毒的主要原因。目前对食品中致病菌检测的方法以微生物常规培养法为主，需要2～7天，操作繁琐，所用试剂复杂多样，费用很高，不能满足实际商品流通需要。pcr(聚合酶链式反应)技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点，使用pcr技术检测食品中致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌o157：h7、小肠结肠炎耶尔森氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌是污染动物性食品的三种重要的致病菌。
3.现有技术在食品中致病菌检测方面存在以下缺陷和问题：
4.1.时间消耗长：传统的微生物常规培养法需要2～7天才能获得检测结果，这对于迅速追溯食品安全问题和及时采取措施来说是不够快速的。
5.2.操作繁琐：传统的微生物常规培养法需要复杂的样品处理、培养基制备、菌落鉴定等步骤，操作繁琐，需要经验丰富的专业人员进行操作。
6.3.费用高昂：传统的微生物常规培养法涉及大量的培养基、试剂和耗材，成本较高，不适应大规模、高效率的检测需求。
7.4.无法满足实际商品流通需要：由于传统方法时间长、操作复杂，无法满足实际商品流通的快速检测需求，可能导致产品已经流入市场或被消费者购买后才发现问题。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒。
9.本发明是这样实现的，一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒，其特征在于，该试剂盒具体包括：扩增引物和特异性荧光探针；
10.所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
11.根据大肠埃希氏菌o157：h7的紧密黏附素基因eaea的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：
12.上游引物eaea-s2：caccagaggaatcggagta(seq id no:1)
13.下游引物eaea-a2：ctgaaagcgaaatgatgaag(seq id no:2)
14.根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素o基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：
15.上游引物hly-s1：ttcggcaaagctgttacta(seq id no:3)
16.下游引物hly-a1：ggcaaatagatggacgatg(seq id no:4)
17.根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引
物，并组成第三对引物：
18.上游引物ail-s1：tgaagtaccgttatgaactcg(seq id no:5)
19.下游引物ail-a1：tgacttaacctttccgtgag(seq id no:6)
20.特异性荧光探针：tamara-5
’‑
cagtcctcgctcactgggca-3
’‑
fam，其为seq id no:3序列，其中fam为荧光报告基因，tamara为荧光淬灭基因。
21.进一步，所述每对引物的上游引物、所述下游引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:2。
22.进一步，所述试剂盒还包括dna提取液、pcr反应试剂。
23.进一步，所述dna提取试剂包括：trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75％的depc乙醇；
24.所述pcr反应试剂包括：taqdna酶、10
×
buffer缓冲液、dntps、mgcl2和cdna。
25.本发明另一目的在于提供一种基于所述同时检测食品中三种致病菌的三重
26.实
27.时荧光pcr试剂盒的动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，该方法具体包括：
28.s1：将采集回来的样本进行处理，得到样本基因组dna；
29.s2：将获得样本基因组dna使用特异性荧光探针进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；
30.s3：在纯化后的产物进行多重pcr检测。
31.进一步，所述s1具体包括：
32.取待检食品样品1g或1ml加入到9ml灭菌lb液体培养基中36℃，120r/min振荡培养，6h后，取1ml培养液用dna提取液提取dna，得到样本基因组dna。
33.进一步，所述s2中pcr扩增反应的条件为：在pcr仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：90℃预变性4min，90℃变性45s，53℃退火30s，65℃延伸50s，共35个循环，最后70℃延伸7min。
34.进一步，所述将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体包括制胶、电泳、检测步骤。
35.进一步，所述制胶过程如下，准备好胶模，凝胶托盘的规格25
×
20cm，等距离平行插四排梳子，称取7.5g琼脂糖粉末至500ml的三角锥瓶中，加入250ml0.5
×
tbe电泳缓冲溶液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化成为溶胶，冷却至60℃以下，再在瓶中加入50μl终浓度为0.5μg/ml的eb，充分混匀，将溶胶倒入胶模，凝固后即成为凝胶；
36.所述电泳过程如下，小心拔出插在凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5
×
tbe电泳缓冲溶液至液面覆盖凝胶1-2mm，用移液排枪吸取4.5μl的含上样缓冲液的pcr产物小心加入梳子孔，待所有样品上完样后，接通电源，调节电压至4-5v/cm，核酸分子从负极移到正极，待上样缓冲液跑到合适位置时，停止电泳，约需45-60min；
37.所述检测过程如下，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的dna条带，在电脑中观察并保存图像。
38.进一步，所述s3具体包括：若纯化后的产物中存在866bp的dna片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若纯化后的产物中存在605bp的dna片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若纯化后的产物中存在461bp的dna片段，表明所述待检食品中
有荧光假单胞菌，目前在动物性食品中没有检测要求，可建议修改为空肠弯曲菌。
39.结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
40.本发明结合通用前增菌技术研究，建立了一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒和检测方法，可以在lb培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的这三种致病菌。该方法具有特异性良好、简便快速、经济实用的优点。
41.本发明建立了大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和空肠弯曲菌的单重和多重pcr检测方法，并确定了多重pcr体系和热循环参数。经实验证实了所建立的方法特异性很强。
42.1)高度特异性：通过设计特异引物和荧光探针，能够针对大肠埃希氏菌o157：h7、单核细胞增生李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌这三种致病菌进行高度特异性的检测。
43.2)快速检测：采用实时荧光pcr技术，具有快速的检测速度和实时结果反馈，大大缩短了检测时间。
44.3)高灵敏度：实时荧光pcr技术结合特异性荧光探针，能够实现对少量目标dna的灵敏检测，即使在低浓度下也能够可靠地检测到致病菌的存在。
45.4)高效性：该方法采用多重pcr扩增，可以同时检测多种致病菌，提高了检测效率和工作效益。
46.5)简便操作：试剂盒中包含了所需的扩增引物、荧光探针和pcr反应试剂，为实验人员提供了一种方便易用的工具，减少了实验操作的复杂性。
47.6)可靠性：通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和测序验证，能够确保检测结果的准确性和可靠性。
48.7)广泛适用性：该方法可应用于动物性食品样本中的四种致病菌检测，具有广泛的应用前景。
49.综上所述，该方案具有高特异性、快速、灵敏、高效、简便、可靠和广泛适用性等优点和积极效果，能够为食品安全监测和疫情控制提供有力支持。
附图说明
50.图1是本发明实施例提供的动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法流程图。
具体实施方式
51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
52.本发明涉及到的菌株都为市售产品，可以很容易的买到。
53.针对现有技术的存在的问题，pcr技术具有以下优势：
54.1)快速检测：pcr技术可以在短时间内完成扩增和检测过程，通常只需要数小时即可获得结果，大大缩短了检测时间。
55.2)高特异性和灵敏度：pcr技术通过设计特异性引物和荧光探针，能够高度特异地
检测目标致病菌的dna序列，同时具有极高的灵敏度，能够检测到少量的致病菌。
56.3)操作简单：pcr技术的操作相对简单，只需进行样品处理、pcr反应混合物配置和实时pcr仪器操作等几个步骤，适用于大规模、高效率的检测需求。
57.4)提供快速反馈：pcr技术可以实时监测扩增产物的荧光信号，通过实时pcr仪器读取信号，能够提供即时的检测结果，有助于及时采取控制措施。
58.基于上述优势，pcr技术在食品中致病菌检测领域具有广阔的应用前景，可以提高检测效率、降低成本，并为食品安全监测提供更可靠的手段。
59.本发明实施例提供一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr方法及试剂盒，该试剂盒具体包括：扩增引物和特异性荧光探针；
60.所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
61.根据大肠埃希氏菌o157：h7的紧密黏附素基因eaea的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：
62.上游引物eaea-s2：caccagaggaatcggagta(seq id no:1)
63.下游引物eaea-a2：ctgaaagcgaaatgatgaag(seq id no:2)
64.根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素o基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：
65.上游引物hly-s1：ttcggcaaagctgttacta(seq id no:3)
66.下游引物hly-a1：ggcaaatagatggacgatg(seq id no:4)
67.根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：
68.上游引物ail-s1：tgaagtaccgttatgaactcg(seq id no:5)
69.下游引物ail-a1：tgacttaacctttccgtgag(seq id no:6)
70.特异性荧光探针：tamara-5
’‑
cagtcctcgctcactgggca-3
’‑
fam，其为seq id no:3序列，其中fam为荧光报告基因，tamara为荧光淬灭基因。
71.所述每对引物的上游引物、所述下游引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:2。
72.所述试剂盒还包括dna提取液、pcr反应试剂。
73.所述dna提取试剂包括：trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75％的depc乙醇；
74.所述pcr反应试剂包括：taqdna酶、10
×
buffer缓冲液、dntps、mgcl2和cdna。
75.本发明实施例提供一种基于所述同时检测食品中三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒的动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，该方法具体包括：
76.s1：将采集回来的样本进行处理，得到样本基因组dna；
77.s2：将获得样本基因组dna使用特异性荧光探针进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；
78.s3：在纯化后的产物进行多重pcr检测。
79.所述s1具体包括：
80.取待检食品样品1g或1ml加入到9ml灭菌lb液体培养基中37℃，120r/min振荡培养，6h后，取1ml培养液用dna提取液提取dna，得到样本基因组dna。
81.所述s2中pcr扩增反应的条件为：在pcr仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：90
℃预变性4min，90℃变性45s，53℃退火30s，65℃延伸50s，共35个循环，最后70℃延伸7min。
82.所述将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体包括制胶、电泳、检测步骤。
83.所述制胶过程如下，准备好胶模，凝胶托盘的规格25
×
20cm，等距离平行插四排梳子，称取7.5g琼脂糖粉末至500ml的三角锥瓶中，加入250ml 0.5
×
tbe电泳缓冲溶液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化成为溶胶，冷却至60℃以下，再在瓶中加入50μl终浓度为0.5μg/ml的eb，充分混匀，将溶胶倒入胶模，凝固后即成为凝胶；
84.所述电泳过程如下，小心拔出插在凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5
×
tbe电泳缓冲溶液至液面覆盖凝胶1-2mm，用移液排枪吸取4.5μl的含上样缓冲液的pcr产物小心加入梳子孔，待所有样品上完样后，接通电源，调节电压至4-5v/cm，核酸分子从负极移到正极，待上样缓冲液跑到合适位置时，停止电泳，约需45-60min；
85.所述检测过程如下，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的dna条带，在电脑中观察并保存图像。
86.所述s3具体包括：若纯化后的产物中存在866bp的dna片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若纯化后的产物中存在605bp的dna片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若纯化后的产物中存在461bp的dna片段，表明所述待检食品中有空肠弯曲菌。
87.以下是六个具体的实施例，描述了基于三重实时荧光pcr试剂盒的动物性食品中四种致病菌的多重pcr快速检测方法：
88.实施例一：
89.1)采集动物性食品样本。
90.1.使用dna提取液(如trizol裂解液)处理样本，提取样本基因组dna。
91.3)准备pcr反应混合液，包括taqdna酶、10
×
buffer缓冲液、dntps、mgcl2、特异性荧光探针(例如tamara-5
’‑
cagtcctcgctcactgggca-3
’‑
fam)以及针对四种致病菌的扩增引物(eaea-s2、eaea-a2、hly-s1、hly-a1、ail-s1、ail-a1)。
92.4)将获得的样本基因组dna加入pcr反应混合液，进行三重实时荧光pcr扩增。
93.5)扩增反应结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增的特异性。
94.6)对特异性扩增产物进行纯化处理，以获得纯化后的产物。
95.7)对纯化后的产物进行荧光检测，使用实时荧光pcr设备读取荧光信号。
96.8)根据荧光信号的强度和阈值设置，判断样本中是否存在大肠埃希氏菌o157：h7、单核细胞增生李斯特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等致病菌。
97.实施例二：
98.除了步骤1到步骤7与实施例一相同外，进一步增加以下步骤：
99.8)对纯化后的产物进行测序，验证扩增产物的特异性。
100.9)根据测序结果判断样本中是否存在四种致病菌，并进行相应的分析和鉴定。
101.实施例三：
102.除了步骤1到步骤7与实施例一相同外，进一步增加以下步骤：
103.8)对纯化后的产物进行逆转录反应，将rna转录为cdna。
104.9)将逆转录后的cdna加入pcr反应混合液，进行三重实时荧光pcr扩增。
105.10)利用实时荧光pcr设备读取荧光信号，并根据阈值设置判断样本中是否存在大
肠埃希氏菌o157：h7、单核细胞增生李斯特氏菌。
106.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒，其特征在于，该试剂盒具体包括：扩增引物和特异性荧光探针；所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：根据大肠埃希氏菌o157：h7的紧密黏附素基因eaea的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：上游引物eaea-s2：caccagaggaatcggagta(seq id no:1)下游引物eaea-a2：ctgaaagcgaaatgatgaag(seq id no:2)根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素o基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：上游引物hly-s1：ttcggcaaagctgttacta(seq id no:3)下游引物hly-a1：ggcaaatagatggacgatg(seq id no:4)根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：上游引物ail-s1：tgaagtaccgttatgaactcg(seq id no:5)下游引物ail-a1：tgacttaacctttccgtgag(seq id no:6)特异性荧光探针：tamara-5
’‑
cagtcctcgctcactgggca-3
’‑
fam，其为seq id no:3序列，其中fam为荧光报告基因，tamara为荧光淬灭基因。2.如权利要求1所述检测三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述每对引物的上游引物、所述下游引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:2。3.如权利要求1所述检测三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna提取液、pcr反应试剂。4.如权利要求3所述检测三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述dna提取试剂包括：trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75％的depc乙醇；所述pcr反应试剂包括：taqdna酶、10
×
buffer缓冲液、dntps、mgcl2和cdna。5.一种基于如权利要求1-4所述同时检测食品中三种致病菌的三重实时荧光pcr试剂盒的动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，该方法具体包括：s1：将采集回来的样本进行处理，得到样本基因组dna；s2：将获得样本基因组dna使用特异性荧光探针进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；s3：在纯化后的产物进行多重pcr检测。6.如权利要求5所述动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述s1具体包括：取待检食品样品1g或1ml加入到9ml灭菌lb液体培养基中37℃，120r/min振荡培养，6h后，取1ml培养液用dna提取液提取dna，得到样本基因组dna。7.如权利要求5所述动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述s2中pcr扩增反应的条件为：在pcr仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：90℃预变性4min，90℃变性45s，53℃退火30s，65℃延伸50s，共35个循环，最后70℃延伸7min。8.如权利要求5所述动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体包括制胶、电泳、检测步骤。9.如权利要求8所述动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，所
述制胶过程如下，准备好胶模，凝胶托盘的规格25
×
20cm，等距离平行插四排梳子，称取7.5g琼脂糖粉末至500ml的三角锥瓶中，加入250ml0.5
×
tbe电泳缓冲溶液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化成为溶胶，冷却至60℃以下，再在瓶中加入50μl终浓度为0.5μg/ml的eb，充分混匀，将溶胶倒入胶模，凝固后即成为凝胶；所述电泳过程如下，小心拔出插在凝胶中的梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5
×
tbe电泳缓冲溶液至液面覆盖凝胶1-2mm，用移液排枪吸取4.5μl的含上样缓冲液的pcr产物小心加入梳子孔，待所有样品上完样后，接通电源，调节电压至4-5v/cm，核酸分子从负极移到正极，待上样缓冲液跑到合适位置时，停止电泳，约需45-60min；所述检测过程如下，将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可见到发出荧光的dna条带，在电脑中观察并保存图像。10.如权利要求5所述动物性食品中四种致病菌多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述s3具体包括：若纯化后的产物中存在866bp的dna片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若纯化后的产物中存在605bp的dna片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若纯化后的产物中存在461bp的dna片段，表明所述待检食品中有荧光假单胞菌。

技术总结
本发明属于食品检测领域，公开了一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒，该试剂盒具体包括：扩增引物和特异性荧光探针。本发明结合通用前增菌技术研究，建立了一种检测三种致病菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒和检测方法，可以在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的这三种致病菌。该方法具有特异性良好、简便快速、经济实用的优点。优点。优点。


技术研发人员：刘廷菊 黄家瑞 张谦 孙端方 杨勇 王楠馨 王赛楠
受保护的技术使用者：贵州省产品质量检验检测院
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/7