一种野油菜黄单胞菌HA-1及其透明质酸生物合成方法与流程

一种野油菜黄单胞菌ha-1及其透明质酸生物合成方法
技术领域
1.本发明属于透明质酸微生物发酵工艺技术领域，具体涉及一种野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)ha-1，及其在透明质酸生物合成领域的应用及一种透明质酸的高效低成本生物合成方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.透明质酸(hyaluronic acid，ha)是广泛存在于生物体内的功能性糖胺高分子聚合物，在日化、医疗和食品领域应用前景广阔。经过多年的研究，对透明质酸的结构、理化性质、生理功能和应用方面已有了明确的认识，其分子结构是由β-1,3-n-乙酰基-d-葡萄糖胺(udp-glcnac)和β-1,4-d-葡萄糖醛酸(udp-glcua)的双糖单位聚合而成的线性大分子酸性黏多糖，天然多糖分子量在1.0～40
×
105da。透明质酸具有良好的保湿作用，又是皮肤和其他组织中广泛存在的天然分子，其优良的性能受到化妆品界的广泛关注。同时透明质酸无色无味、易溶于水、不改变产品本来的性质，被批准为新的食品原料，可作为食品原料添加到各类应用中，前景十分广阔。
4.制备透明质酸的主要方法有从动物组织中分离提取和通过微生物发酵法获得。动物组织提取法是早期采用的生产方法，但是由于原料来源局限性大、产品提取率极低、工艺过程复杂导致不宜进行大规模工业化生产。因此，目前透明质酸主要是采用微生物发酵法生产获得，采用的微生物菌种一般是兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)，但是该菌对发酵培养基的营养比较挑剔，如对氮源要求非常苛刻，必须不同氮源搭配使用才能收到较好的发酵效果，导致其发酵生产成本与黄原胶、普鲁兰多糖等微生物多糖比较发酵生产效率与生产成本居高不下，对透明质酸产业规模的扩大有明显制约。


技术实现要素：

5.针对目前微生物发酵制备透明质酸还存在发酵产率低、生产成本高的产业化瓶颈问题，本发明首先提供了一株能够外源表达透明质酸的野油菜黄单胞菌ha-1，其发酵工艺相比现有菌株对底物的要求更低。进一步的，为了实现透明质酸生物合成工艺的工业化、实现透明质酸的高效低成本生产，本发明针对上述菌株的发酵工艺进行了优化，提供了一种分段式发酵方法，具体方案如下：
6.第一方面，提供一株野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)ha-1，该菌株已于2023年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：cctcc no.m 2023763。
7.上述菌株野油菜黄单胞菌ha-1，其形态学特征如下：
8.菌体特征：杆状、革兰氏染色阴性。
9.菌落特征：黄色湿润、粘稠、表面光滑、易挑起。
10.所述野油菜黄单胞菌ha-1的生理生化特征如下：化能异养、需氧、可合成淀粉酶、无特殊营养需求。
11.第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的野油菜黄单胞菌ha-1(xanthomonas campestris)或该菌株的培养物。
12.所述菌剂中有效成分包括上述野油菜黄单胞菌ha-1，可行的剂型如液体制剂、粉剂或颗粒剂；其中，液体制剂可以为包含上述菌株培养液或溶液；所述粉剂为上述菌株的菌粉，可行的制备方式如扩培发酵后干燥制得；所述颗粒剂中包括上述菌株及载体，可行的载体成分如沸石粉、硅藻土、蛭石、膨润土等无机材料，也有草炭、风化煤、海藻糖脂等惰性有机质材料。
13.所述培养物表示菌株在适宜条件发酵后的活性产物，本发明提供的方案中，所述活性产物主要表示透明质酸成分。
14.第三方面，第一方面所述野油菜黄单胞菌ha-1、或第二方面所述菌剂在透明质酸生物合成领域的应用。
15.所述应用的具体形式之一在于：以野油菜黄单胞菌ha-1作为工业发酵菌株，进行透明质酸的合成。
16.现有研究中，野油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)为黄原胶生产的标准菌株，对底物中营养成分的要求相比兽疫链球菌更加温和，可以以低成本的碳源及氮源作为底物进行发酵，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、大豆粉、玉米浆、鱼粉、花生饼粉等。为了实现透明质酸的工业化放大生产，本发明针对上述菌株发酵产生透明质酸的过程着重进行了优化，透明质酸发酵生产过程一般可分为菌体生长期与多糖合成期，而且随着发酵进行，发酵液粘度迅速上升，ph则快速下降，因此优选的技术方案是在不同的发酵阶段进行培养温度、ph、通风比、溶解氧(do)的阶段性控制，以有效提高发酵产率与透明质酸产物分子量。即上述分段控制发酵的方式如下：
17.第四方面，一种透明质酸的生物合成方法，包括如下步骤：将第一方面所述野油菜黄单胞菌ha-1经固体斜面和种子液扩大培养后，按照发酵培养液体积分数5～10％的量接种于发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得透明质酸产物。
18.0～16h：温度32～35℃、ph自然、通风量1.2～1.5v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧30％以上；
19.16h～放罐共计发酵40～50h：温度26～28℃、补加ump、每隔1h流加碱液调控发酵液ph至6.5、通风量1.8～2.0v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧5～15％。
20.优选的，补加ump量为0.5～1.5ppm。
21.优选的，所述发酵培养液由如下质量份数的组分组成：玉米淀粉3.5～5.0g/100ml；大豆粉0.2～0.4g/100ml；nacl 0.2～0.4g/100ml；卡那霉素100ng/ml；微量元素2.0～5.0ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02～0.05g/100ml；其他为软化水；ph 7.0～7.2。其中，微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
22.本发明一种实施方式中，还提供上述菌株的活化工艺：
23.将-80℃保藏的菌种无菌接种于斜面培养基上，28～32℃静置培养1～2天，获得活
化菌种，用于发酵生产种子液制备。进一步的，所述斜面固体培养基为lb培养基，含100ng/ml卡那霉素。
24.又一种实施方式中，本发明还提供上述菌株种子液制备方法：
25.挑取经斜面活化培养的野油菜黄单胞菌ha-1菌株2～3环，接种于发酵种子液里，32～35℃培养16～20h，获得成熟种子液。
26.优选的，所述种子培养液由如下质量份数的组分组成：玉米淀粉1.0～2.0g/100ml；大豆粉0.3～0.5g/100ml；nacl 0.2～0.4g/100ml；卡那霉素100ng/ml；微量元素0.5～2.0ppm(终浓度)；聚醚消泡剂0.02～0.05g/100ml；其他为软化水；ph 7.0～7.2；所述微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
27.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
28.(1)本发明首先提供了一种具有外源表达透明质酸能力的野油菜黄单胞菌ha-1，与现有透明质酸微生物发酵菌株相比，上述菌株对底物的要求更加温度，采用低成本的碳源及氮源即可实现高效合成，为透明质酸生物合成工艺的扩大奠定良好的技术基础。
29.(2)本发明针对上述菌株的发酵工艺进行了优化，提供了一种分段发酵工艺，经验证，基于本发明优化后的发酵工艺，所述菌株xanthomonas campestris ha-1发酵制备透明质酸的结果如下：
30.a.透明质酸的产率为1.8～2.3g/100g发酵液；
31.b.透明质酸发酵液的粘度为12450～18860mpa
·
s；
32.c.透明质酸分子量为1.35
±
0.12
×
106da，及市售透明质酸产品(1.33
±
0.15
×
106da)的分子量没有显著差异。
具体实施方式
33.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
34.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
35.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
36.实施例1
37.本实施例中，提供一种基于野油菜黄单胞菌ha-1的透明质酸发酵生产工艺：
38.(1)菌株活化：
39.将处于-80℃保藏的野油菜黄单胞菌ha-1无菌接种于含100ng/ml卡那霉素的lb斜面培养基上，32℃静置培养1天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
40.(2)生产种子液制备：
41.挑取经斜面活化培养的野油菜黄单胞菌ha-1菌株2～3环，接种于发酵种子液里，32℃培养16～20h，获得成熟种子液。
42.所述种子培养液由如下质量分数的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉2.0；大豆粉0.3；nacl 0.2；微量元素0.5ppm(终浓度)；卡那霉素100ng/ml；聚醚消泡剂0.05；其他为软化水；ph 7.0～7.2。
43.所述微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
44.(3)透明质酸发酵生产：
45.将培养成熟的野油菜黄单胞菌ha-1菌株种子液接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得透明质酸产物。
46.所述发酵培养液有如下质量分数的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉.0；大豆粉0.4；nacl 0.4；微量元素5.0ppm(终浓度)；卡那霉素100ng/ml；聚醚消泡剂0.05；其他为软化水；ph 7.0～7.2。
47.所述微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
48.发酵控制条件如下：
49.0～16h：温度32℃、ph自然、通风量1.2v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧30％以上；
50.16h～放罐(50h)：温度28℃、补加ump 1.0ppm、每隔1h流加碱液调控发酵液ph至6.5、通风量2.0v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧5～15％。
51.获得透明质酸发酵液，经测定发酵透明质酸含量2.13
±
0.08g/100g发酵液；发酵液表观粘度17680
±
160mpa
·
s；产物分子量为1.31
±
0.11
×
106da。
52.实施例2
53.本实施例中，提供又一种基于野油菜黄单胞菌ha-1的透明质酸发酵生产工艺：
54.(1)菌种活化：
55.将处于-80℃保藏的野油菜黄单胞菌ha-1无菌接种于含100ng/ml卡那霉素的lb斜面培养基上，28℃静置培养2天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。
56.(2)生产种子液制备：
57.挑取经斜面活化培养的野油菜黄单胞菌ha-1菌株2～3环，接种于发酵种子液里，32～35℃培养16～20h，获得成熟种子液。
58.所述种子培养液由如下质量分数的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉1.0；大豆粉0.3；nacl 0.2；微量元素2.0ppm(终浓度)；卡那霉素100ng/ml；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0～7.2。
59.所述微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
60.(3)透明质酸发酵生产：
61.将培养成熟的野油菜黄单胞菌ha-1菌株种子液接种到经灭菌的发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得透明质酸产物。
62.所述发酵培养液有如下质量分数的组分组成(单位g/100ml)：玉米淀粉3.5；大豆
粉0.2；nacl 0.2；微量元素2.0ppm(终浓度)；卡那霉素100ng/ml；聚醚消泡剂0.02；其他为软化水；ph 7.0～7.2。
63.所述微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。
64.发酵控制条件如下：
65.0～16h：温度35℃、ph自然、通风量1.5v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧30％以上；
66.16h～放罐(40h)：温度28℃、补加ump 0.5ppm、每隔1h流加碱液调控发酵液ph至6.5、通风量1.8v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧5～15％。
67.获得透明质酸发酵液，经测定发酵透明质酸含量1.83
±
0.09g/100g发酵液；发酵液表观粘度13680
±
180mpa
·
s；产物分子量为1.34
±
0.11
×
106da。
68.对比例1
69.本实施例中，提供一种另一种透明质酸发酵方法：
70.与实施例1不同之处在于，步骤(3)“透明质酸发酵生产”未采用分段发酵工艺，发酵控制条件如下：
71.0h～放罐(40h)：温度28℃、补加ump 0.5ppm、每隔1h流加碱液调控发酵液ph至6.5、通风量1.8v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧5％以上。
72.获得透明质酸发酵液，经测定发酵透明质酸含量1.66
±
0.09g/100g发酵液；发酵液表观粘度12080
±
180mpa
·
s；产物分子量为1.14
±
0.11
×
106da。
73.对比上述产量数据可以看出，分段发酵的方式能够有效提升透明质酸的产量。
74.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种野油菜黄单胞菌ha-1(xanthomonas campestris)，该菌株已于2023年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：cctcc no.m 2023763。2.如权利要求1所述菌株，其特征在于，所述野油菜黄单胞菌ha-1的形态学特征如下：菌体特征：杆状、革兰氏染色阴性；菌落特征：黄色湿润、粘稠、表面光滑、易挑起；生理生化特征如下：化能异养、需氧、可合成淀粉酶、无特殊营养需求。3.一种菌剂，所述菌剂包括权利要求1或2所述的野油菜黄单胞菌ha-1(xanthomonas campestris)或菌的培养物。4.如权利要求3所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型选自液体制剂、粉剂或颗粒剂，为包含上述菌株的液体制品、所述菌株的菌粉或所述菌株的载体形式。5.权利要求1或2所述野油菜黄单胞菌ha-1(xanthomonas campestris)、或权利要求3或4所述菌剂在透明质酸生物合成领域的应用。6.一种透明质酸的高效低成本生物合成方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1或2所述野油菜黄单胞菌ha-1经固体斜面和种子液扩大培养后，按照发酵培养液体积分数5～10％的量接种于发酵培养液中，调整发酵培养液的ph，进行通气搅拌发酵培养，通过分阶段控制发酵条件，生产获得透明质酸产物；所述分段控制发酵的方式如下：0～16h：温度32～35℃、ph自然、通风量1.2～1.5v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧30％以上；16h～放罐：温度26～28℃、补加ump、每隔1h流加碱液调控发酵液ph至6.5、通风量1.8～2.0v.v.m、罐压0.05～0.08mpa、溶解氧5～15％。7.如权利要求6所述透明质酸的生物合成方法，其特征在于，补加ump量为0.5～1.5ppm。8.如权利要求6所述透明质酸的生物合成方法，其特征在于，所述发酵培养液由如下质量分数的组分组成：玉米淀粉3.5～5.0g/100ml；大豆粉0.2～0.4g/100ml；nacl 0.2～0.4g/100ml；卡那霉素100ng/ml；微量元素终浓度为2.0～5.0ppm；聚醚消泡剂0.02～0.05g/100ml；其他为软化水；ph 7.0～7.2；其中，微量元素为硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锌、氯化钴、硼酸中的一种或几种的组合。9.如权利要求6所述透明质酸的生物合成方法，其特征在于，所述菌株的活化工艺如下：将处于-80℃保藏的菌种无菌接种于斜面培养基上，28～32℃静置培养1～2天，获得活化菌种，用于发酵生产种子液制备。10.如权利要求6所述透明质酸的生物合成方法，其特征在于，所述菌株种子液的制备方法：挑取经斜面活化培养的生产野油菜黄单胞菌ha-1菌株2～3环，接种于发酵种子液里，32～35℃培养16～20h，获得成熟种子液；所述种子培养液由如下质量分数的组分组成：玉米淀粉1.0～2.0g/100ml；大豆粉0.3～0.5g/100ml；nacl 0.2～0.4g/100ml；卡那霉素100ng/ml；微量元素终浓度0.5～2.0ppm；
聚醚消泡剂0.02～0.05g/100ml；其他为软化水；ph 7.0～7.2。

技术总结
本发明涉及一种野油菜黄单胞菌HA-1及透明质酸生物合成方法。针对目前透明质发酵产率低、生产成本高的产业化瓶颈问题，本发明首先提供了一株能够外源表达透明质酸的野油菜黄单胞菌HA-1，并针对该菌株的发酵工艺进行了优化，提供了一种分段发酵工艺，在发酵阶段通过调控培养温度、pH、通风比、溶解氧(DO)，有效的提高了透明质酸发酵产率，对透明质酸的高效低成本合成具有重要意义。成本合成具有重要意义。


技术研发人员：董学前 张永刚 王伟 张艳敏 韩鸿宇 刘洋 周思多 刘建军
受保护的技术使用者：山东省食品发酵工业研究设计院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/10/7