标志物在热敏感诊断或预测中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及生物标志物在热敏感诊断或预测中的应用。


背景技术：

2.热应激指在高环境温度中的机体对热环境对机体提出的任何要求所做的非特异性的生理反应的总和。热应激时的人体生理反应在温度应激环境下，正常的热平衡受到破坏，人体将产生一系列复杂的生理和心理变化。不管是人或者动物，其机体机能都会受到热应激的影响。
3.丁酰胆碱酯酶(bche)也称为血清胆碱酯酶和伪胆碱酯酶，广泛分布于人类中枢系统和外周组织，包括脑，皮肤，血浆和骨骼肌等；其中脑部bche在杏仁核、海马和垂体中高度表达。早期bche基因沉默的人类除了手术时对个别麻醉剂敏感外并无其他不同之处，因此早期的研究者们认为bche生理作用并不重要，对它的研究较少。但随着broomfield等人1991年证明了bche具有抗神经毒剂的神经保护功能，自此bche便得到了研究人员的广泛关注。


技术实现要素：

4.鉴于上述发展现状，本发明旨在提供一种诊断或预测热敏感的生物标志物。
5.本发明第一方面提供了检测样本中bche生物标志物的试剂在制备诊断或预测受试者是否热应激敏感的产品中的应用。
6.在本发明中所使用的术语“生物标志物”或“生物标记物”互相通用，是指基因或基因产物，其是用于调节一种或多种目标表型(例如髓系细胞中的目标表型)的靶标。在这种情形下，术语“生物标志物”与“靶标”同义。然而，在一些实施方案中，所述术语还涵盖已被确定为指示目标输出例如一种或多种诊断、预后和/或治疗输出(例如，用于调节炎性表型、癌症状态等)的靶标的可测量实体。在其他实施方案中，所述术语还涵盖调节基因或基因产物的组合物，包括抗基因产物抗体及其抗原结合片段。因此，生物标志物可包括但不限于核酸(例如，基因组核酸和/或转录的核酸)、蛋白质和抗体(以及其抗原结合片段)。
7.在一些实施方案中，生物标志物可以是或包括特定疾病状态或阶段的标志物，或者特定疾病、病症或病状可能发展的可能性的标志物。在一些实施方案中，生物标志物可以是包括特定疾病或治疗结果或其可能性的标志物。
8.进一步，所述样本包括组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合。
9.进一步，所述检测样本为血清。
10.进一步，所述受试者包括人或非人哺乳动物。
11.进一步，所述受试者为人。
12.在本发明中使用的术语“样本”是指从患有待通过本发明方法治疗的疾病的个体获得的任何样本，包括组织样本(诸如组织切片和组织针穿刺活检)；细胞样本(例如，细胞学涂片(诸如pap或血涂片)或通过显微切割获得的细胞样本)；骨髓样本(其全部、完整细胞或其中的细胞亚群体)；或细胞、片段或细胞器(诸如通过裂解细胞并通过离心或其它方式分离其组分而获得)。生物样本的其它实例包括血液、血清、尿液、精液、粪便物质、脑脊液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓液、活检组织(例如，通过外科活检或针穿刺活检获得)、乳头吸出物、阴道液、唾液，拭子(诸如口腔拭子)，或含有衍生自第一生物样本的生物分子的任何材料。
13.在本发明中使用的术语“受试者”是指动物、脊椎动物、非人哺乳动物或人类，尤其是施用药剂以例如用于实验、诊断和/或治疗目的或获得样品或实施程序者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)或其他动物(例如骆马和骆驼)。在一些实施方案中，受试者是人类。术语“受试者”与“患者”可互换。
14.进一步，所述试剂包括特异性检测bche基因表达水平的引物或探针，或特异性结合bche基因编码的蛋白的试剂。
15.本发明中所使用的术语“试剂”是指任何小蛋白质或其它化合物，抗体，核酸分子或多肽，或其片段。
16.本发明中所使用的术语“引物”是指初始的核酸片段，通常是与由目标核酸分子全部或部分的引物结合位点互补的rna寡核苷酸、dna寡核苷酸或嵌合序列。引物链可包含天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下可以形成稳定双链体所需的最小长度。
17.本发明中所使用的术语“探针”是指合成的或生物制造的核酸，其含有在严格条件下与靶核酸序列杂交的特定核苷酸序列。一个探针可以与多个标志部分相连。优选的部分是识别性标记物，例如荧光团。标记的探针也可以包含多个不同的核酸序列，每个核酸序列用一个或多个标志部分标记。每个标志部分可以相同或不同。标记各具有不同标志部分的不同探针(例如核酸序列)可能是有益的。这可通过在每个探针上具有单个可区分部分来实现。例如，探针a与x部分相连，探针b与y部分相连。或者，探针a与x和y部分相连，而探针b与z和w部分相连。或者，探针a与x和y部分相连，而探针b与y和z部分相连。上述的所有探针“a”和“b”将是可区分的和独特标记的。
18.进一步，所述产品包括能检测bche生物标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片、核酸膜条或试纸。
19.进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测bche基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测bche蛋白表达水平的试剂或芯片。
20.进一步，所述试剂盒包括通过western印迹法、elisa、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、facs、蛋白质芯片检测法检测bche基因或蛋白表达水平的试剂。
21.在本发明中所使用的术语“试剂盒”是指可以或不可以包装在一起的化合物、工具或试剂的集合。试剂盒的组分可以包含在单独的小瓶中(即作为单独部分的试剂盒)或提供
在单个小瓶中。此外，应当理解，本发明的试剂盒优选用于实施上文提及的方法或用途。优选地，设想所有组分都以即用方式提供以用于实施上述方法或用途。此外，该试剂盒优选地包含用于实施所述方法或用途的说明。这些说明可以由纸质或电子形式的用户手册提供。此外，该手册可以包括使用本发明的试剂盒的施用说明和/或剂量说明。
22.进一步，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测bche基因转录水平的针对bche基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括bche蛋白的特异性抗体或配体；所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
23.本发明还提供了一种预测或诊断受试者是否热应激敏感的产品，所述产品包括检测样本中bche基因或蛋白表达水平的试剂。
24.本文使用的术语“诊断”是指本领域技术人员通过其可估计和/或确定患者是否患有给定的疾病或病症的可能性的方法，是一种辅助诊断。在本发明的情况下，“诊断”包括使用用于本发明的热应激敏感生物标志物的检测结果，任选地，与其他临床特征一起使用，以从患者得到的样品和检测来实现诊断(即，是或否)热应激敏感。这样的诊断是“确定”，其不意味着暗示诊断是100％准确。因此，在预确定诊断阈值的一侧的测量的生物标志物的水平表示受试者发生疾病的可能性较大，相对于测量水平在预确定诊断阈值的另一侧。
25.进一步，所述受试者包括人或非人哺乳动物。
26.进一步，所述受试者为人。
27.进一步，所述样本包括组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合。
28.进一步，所述检测样本为血清。
29.进一步，所述产品包括能检测bche生物标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片、核酸膜条或试纸。
30.进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测bche基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测bche蛋白表达水平的试剂或芯片。
31.进一步，所述试剂盒包括通过western印迹法、elisa、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、facs、蛋白质芯片检测法检测bche基因或蛋白表达水平的试剂。
32.进一步，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测bche基因转录水平的针对bche基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括bche蛋白的特异性抗体或配体。
33.本文使用的术语“抗体”是指肽或多肽，其源自基本上免疫球蛋白基于编码或免疫球蛋白基因后模拟或免疫球蛋白基因或其片段，能够特异性结合抗原或表位。
34.进一步，所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。
35.本发明还提供了一种利用生物标志物bche诊断或预测受试者是否热应激敏感的系统，所述系统包括结果判定单元，将得到的所述生物标志物丰度与热应激敏感个体样本中检测的所述生物标志物丰度的平均值进行比较。
36.进一步，所述系统包括检测单元或数据处理单元。
37.进一步，所述检测单元用于检测个体信息，获得检测结果。
38.进一步，所述数据处理单元用于对检测单元的检测结果进行分析处理。
39.本发明还提供了一种诊断或预测受试者是否热应激敏感的方法，所述方法包括检测受试者样本中前面所述的生物标志物的基因或蛋白表达水平的步骤。
40.本发明还提供了一种非治疗非诊断目的筛选治疗或预防热应激损伤的药物的方法，所述方法包括检测受试者样本中前面所述的生物标志物的基因或蛋白表达水平的步骤。
41.本发明中所使用的术语“药物”是指一种或多种化合物或其生理学上可接受的盐与其它化学成分(诸如生理学上可接受的载体及赋形剂)的混合物。药物的目的旨在促进化合物给予生物。本文中的药物还包含药学上可接受的药物载体，对生物不产生明显刺激且不会消除所给予的化合物的生物活性及特性的载体，例如：稀释剂，如水等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；吸附载体，如高岭土和皂粘土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外，还可以在上述药物中加入其它辅料，如香味剂和甜味剂等。
附图说明
42.图1是1组人群热应激前后bche的roc曲线图；
43.图2是2组人群热应激前后bche的roc曲线图；
44.图3是总人群热应激前后血清bche表达水平分析图；
45.图4是总人群热应激前后bche的roc曲线图；
46.图5是a组大鼠中对照大鼠和热应激大鼠bche的roc曲线图；
47.图6是b组大鼠中对照大鼠和热应激大鼠bche的roc曲线图；
48.图7是总大鼠中对照大鼠和热应激大鼠血清bche表达水平分析图；
49.图8是总大鼠中对照大鼠和热应激大鼠bche的roc曲线图；
50.图9是总大鼠中ache标准曲线检测和对照大鼠和热应激大鼠血清ache表达水平分析图，其中，a为ache标准曲线检测图，b为总大鼠中对照大鼠和热应激大鼠血清ache表达水平分析图。
具体实施方式
51.为了对本发明进行详细的说明，提供以下的实施例以供参考，应当理解并清晰认识的是，所述实施例旨在描述其目的，而非限制本发明的范围。
52.如本文所用，术语“敏感性”是指相对于患者总数量(100％)的真阳性患者数量(％)。个体为任何选中的受试者。敏感性通过以下公式计算：敏感性性＝tp/(tp+fn)(tp＝真阳性；fn＝假阴性)。
53.如本文所用，术语“特异性”涉及相对于健康受试者总数量(100％)的真阴性个体数量(％)。特异性通过以下公式计算：特异性＝tn/(tn+fp)(tn＝真阴性；fp＝假阳性)。
54.如本文所用，术语“auc”涉及曲线下面积的缩写。特别是，它是指受试者工作特征
(roc)曲线下的面积。如本文所用，术语“受试者工作特征(roc)曲线”是指针对诊断测试的不同可能的切点的真阳性率相对于假阳性率的绘图。它显示了灵敏性和特异性之间的权衡，取决于所选的切点(灵敏性的任何提高都会伴随特异性的降低)。roc曲线下的面积是诊断测试的准确性的度量(面积越大越好，最优为1，随机测试的roc曲线位于对角线，面积为0.5)。
55.实施例1
56.一、实验方法
57.1、热应激人群：
58.研究对象：本研究共涉及50名年轻健康男性，年龄17-20岁，无吸烟饮酒习惯，每天工作性质、工作时长、锻炼强度和饮食结构近似一致。在实验实施过程中，所有参试人员随机分为两组，编号为1组、2组，每组25人，于40℃高温环境暴露4小时，连续7天。
59.样本采集：在实验实施前于7：00am取静脉血1次；热应激结束后第2天早7:00第二次取静脉血保存待测。
60.2、热应激大鼠：
61.研究对象：采用8周龄、雄性sd大鼠、符合spf级(北京斯贝福)20只。称重并标记后，随机分为两组，编号为a组、b组，每组中有对照组大鼠5只、热应激大鼠5只；对照组大鼠于正常12小时光照、12小时黑暗，22℃室温饲养；热应激组大鼠每天置于38℃，湿度》70％的环境温度舱进行热应激暴露，每天暴露2小时(15∶00-17∶00)，连续3天，暴露期间保证大鼠可自由摄食和饮水。
62.样本采集：建模结束后第2天早7:00眼球取血，分离血清保存待测。
63.3、指标检测：采用酶联免疫吸附实验(elisa)方法进行检测人及大鼠血清中bche表达水平。检测试剂盒由云克隆公司提供。
64.二、实验结果
65.1)以1组25名年轻健康男性为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图1所示，显示auc值为0.8909，敏感性为1，特异性为0.8182，最佳临界值点为0.8182，提示以bche作为检测变量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
66.2)为验证实验结果1)中的结论，以2组25名年轻健康男性为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图2所示，显示auc值为0.8200，敏感性为0.8，特异性为0.8，最佳临界值点为0.6，证明bche作为检测变量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
67.3)检测人群热应激前后血清bche表达水平。以两组50名年轻健康男性为研究对象，采用gragh prism 9.0软件分析elisa检测结果，p《0.05被视为有统计学差异。结果如图3所示，由图3可知，检测人群热应激之后bche表达水平显著性降低；以两组50名年轻健康男性为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图4所示，显示auc值为0.8357，敏感性为1，特异性为0.5714，最佳临界值点为0.5714，佐证以bche作为检测变量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
68.4)以a组大鼠为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图5所示，显示auc值为0.875，敏感性为0.75，特异性为1，最佳临界值点为0.75，提示以bche作为检测变
量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
69.5)为验证实验结果4)的结论，以b组大鼠为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图6所示，显示auc值为0.8984，敏感性为0.75，特异性为0.875，最佳临界值点为0.625，证明以bche作为检测变量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
70.6)检测对照组大鼠和热应激大鼠血清bche表达水平。以两组大鼠为研究对象，采用gragh prism 9.0软件分析elisa检测结果，p《0.05被视为有统计学差异。结果如图7所示，由图7可知，热应激大鼠血清中bche表达水平相较于对照组大鼠显著性降低；以两组大鼠为研究对象，以bche作为检测变量，绘制roc曲线，结果如图8所示，显示auc值为0.8926，敏感性为0.8125，特异性为0.9375，最佳临界值点为0.75，佐证以bche作为检测变量用于诊断热应激敏感具有较高的特异性和敏感性，显示出较高的诊断效能。
71.7)以两组大鼠为研究对象，检测对照组大鼠和热应激大鼠血清ache表达水平，并检测标准曲线，结果如图9所示，采用gragh prism 9.0软件分析elisa检测结果，p《0.05被视为有统计学差异，经检测，标准曲线检测最高值为100ng/ml,最低浓度0ng/ml,健康组与热应激组的od值均接近标准曲线的最低od值，说明血清中分泌ache非常低，接近0且无差异性。
72.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.检测样本中bche生物标志物的试剂在制备诊断或预测受试者是否热应激敏感的产品中的应用；优选地，所述样本包括组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合；优选地，所述检测样本为血清；优选地，所述受试者包括人或非人哺乳动物；优选地，所述受试者为人。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性检测bche基因表达水平的引物或探针，或特异性结合bche基因编码的蛋白的试剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括能检测bche生物标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片、核酸膜条或试纸；优选地，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测bche基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测bche蛋白表达水平的试剂或芯片；优选地，所述试剂盒包括通过western印迹法、elisa、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、facs、蛋白质芯片检测法检测bche基因或蛋白表达水平的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测bche基因转录水平的针对bche基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括bche蛋白的特异性抗体或配体；所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。5.一种预测或诊断受试者是否热应激敏感的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中bche基因或蛋白表达水平的试剂；优选地，所述受试者包括人或非人哺乳动物；优选地，所述受试者为人。6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述样本包括组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物中的一种或其组合；优选地，所述检测样本为血清。7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括能检测bche生物标志物的试剂，包含所述试剂的试剂盒、芯片、核酸膜条或试纸；优选地，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测bche基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测bche蛋白表达水平的试剂或芯片；优选地，所述试剂盒包括通过western印迹法、elisa、放射性免疫测定、放射性免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测
定法、facs、蛋白质芯片检测法检测bche基因或蛋白表达水平的试剂；优选地，所述芯片包括基因芯片和蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测bche基因转录水平的针对bche基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括bche蛋白的特异性抗体或配体；优选地，所述试纸包括基因检测试纸、蛋白检测试纸。8.一种利用生物标志物bche诊断或预测受试者是否热应激敏感的系统，其特征在于，所述系统包括结果判定单元，将得到的所述生物标志物丰度与热应激敏感个体样本中检测的所述生物标志物丰度的平均值进行比较；优选地，所述系统包括检测单元或数据处理单元。9.一种诊断或预测受试者是否热应激敏感的方法，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中权利要求1中所述的生物标志物的基因或蛋白表达水平的步骤。10.一种非治疗非诊断目的筛选治疗或预防热应激损伤的药物的方法，其特征在于，所述方法包括检测受试者样本中权利要求1中所述的生物标志物的基因或蛋白表达水平的步骤。

技术总结
本发明公开了标志物在热敏感诊断或预测中的应用，具体涉及BCHE生物标志物，本发明首次发现了BCHE在热应激受试者血清中丰度降低，通过检测BCHE的表达水平，可以诊断受试者是否为热应激敏感，从而实现受试者的便捷诊断，具有较高的实际应用价值。有较高的实际应用价值。有较高的实际应用价值。


技术研发人员：宋伦 文青 曹广文 谭晓
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/10/7