一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对Keap1/Nrf2信号通路的干扰作用预测方法与流程

一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于分子对接技术的医用包材迁移物质对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，尤其是涉及一种基于计算机模拟的评估包材迁移物质潜在危害的快速预测方法。


背景技术：

2.塑料药物包材具有密度小、质量轻、机械性能强等特点，因此广泛用于各种药物的储藏、运输等方面。为了提高塑料药物包材的机械性能，在其加工过程中添加抗氧化剂、增塑剂、稳定剂等一些添加剂。而这些添加剂与包材基质的结合方式并不是通过化学键结合，当它们遇到高温、酸碱性等特殊条件时很有可能从基质中分离出来，迁移到药物中，污染药物，给患者带来潜在的危害。目前，塑料医药包材迁移物质的研究主要集中于其鉴定上，缺乏迁移物质对人体带来的潜在危害的研究。
3.核因子e2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，nrf2)是碱性亮氨酸拉链转录因子(cap-n-collar，cnc)家族的核转录因子，也是维持细胞内氧化还原平衡状态、防御多种应激损伤的重要因子。在细胞质中nrf2通常与kelch2样ech2相关蛋白(kelch 2 like ech2 associated protein 1，keap1)结合。正常情况下，当机体受到外界刺激时，keap1改变构想，释放nrf2，使其转运到细胞核与抗氧化反应元件(antioxidant response element，are)结合，促进下游抗氧化基因血红素加氧酶-1、谷胱甘肽硫基转移酶、醌氧化还原酶1等的表达作用，从而维持细胞稳态，并保护细胞免受损伤。
4.有文献显示，当氧化应激信号通路中keap1、nrf2等单元受到外来污染物、石化制品、重金属等的干扰时，无法正常运转，从而导致氧化应激反应，而氧化应激是破坏细胞、蛋白质以及dna的主要因素，甚至会造成糖尿病、动脉硬化以及阿尔茨默氏症等疾病。因此，评估包材迁移物质对keap1/nrf2信号通路的干扰作用，从而预测包材迁移物体内产生的氧化应激效应尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明提供一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，包括以下步骤：
6.a)样品前处理：称取适量聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯材质的输液袋样品，在酸性、碱性及脂溶性模拟提取液中提取，用二氯甲烷萃取，浓缩复溶，微孔滤膜过滤，制得样品溶液；
7.b)挥发性迁移物质鉴定：将样品中的待测物质利用气相色谱质谱联用仪测定，结合测定物质的色谱质谱参数与nist数据库上的匹配度确定迁移物质；
8.c)确定抗氧化剂与增塑剂：根据pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和相关文献上物质用途信息，上述b)中定性的物质中筛选出抗氧化剂和增塑剂；
9.d)增塑剂和抗氧化剂的筛查：采用计算机虚拟筛选方法，对鉴定的增塑剂和抗氧化剂进行批量对接，通过打分函数打分，根据它们与keap1蛋白结合的结合能大小，筛查出潜在的keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质；
10.e)潜在keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质与keap1蛋白之间的作用力揭示：采用分子对接方法揭示潜在keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质与keap1蛋白之间的作用力、结合位点及作用力大小，初步揭示潜在干扰物对keap1/nrf2信号通路的干扰作用。
11.其中，增塑剂和抗氧化剂的筛查具体步骤为：首先，将pyrx和autogrid 4软件安装好，之后将autodock 4.exe和autogrid 4.exe两个文件拷贝到pyrx目录中，保证pyrx在本地电脑上顺利运行；使用autodock 4优化受体peak1蛋白，之后用open babble准备小分子(增塑剂和抗氧化剂)，采用vina wizard进行虚拟筛选，保存结果，将结合能＞-5kj/mol的塑化剂和抗氧化剂删除，而结合能＜-5kj/mol的保留。
12.潜在移物质与keap1蛋白之间的作用力揭示的方法为：从蛋白数据中获取keap1蛋白(pdb id：4zy3)的晶体结构，采用pymol可视化软件将多余的配体和水分子删除，获取pdb文件，采用autodock软件加氢、加电荷，并转换为pdbqt文件；从pubchem数据库中获取所述的增塑剂和抗氧化剂的3d结构，用pymol可视化软件转换为pdb文件，采用autogrid 4激活旋转氢，并获取pdbqt文件，之后进行vina对接；对接结果用pymol及ligplot软件可视化，并分析相互作用力。
13.本发明的有益效果：本发明为快速预测批量包材迁移物质对氧化应激中keap1/nrf2信号通路的潜在干扰提供新的方法。
附图说明
14.图1.概括本发明整体内容的图形摘要
15.图2.筛查的20种增塑剂和抗氧化剂与keap1蛋白的分子对接2d平面图
16.图3.蝶呤-6-羧酸、抗氧化剂2246与keap1蛋白的分子对接的3d示意图
具体实施方式
17.实施例一
18.1.样品前处理
19.准确称取2g聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯输液袋切片，置于100ml酸性、碱性及脂溶性模拟提取液中，在40℃下进行周期为7天的加速试验，取10ml提取液，加4ml二氯甲烷，涡旋混匀，超声30min，静置5min，收集二氯甲烷层，将所得的萃取液于40℃旋蒸至干，加入1ml甲醇和二氯甲烷(v∶v＝9∶1)混合溶剂复溶，过0.22μm滤膜，置于-20℃，备用。
20.2.气相色谱质谱联用仪条件
21.仪器：安捷伦7890a气相色谱系统与安捷伦5975c质谱联用仪；仪器参数：色谱柱：hp-5ms(30m
×
250μm
×
0.25μm)；柱温箱初始温度为60℃，保持1min，之后以12℃/min的速率升到210℃，再以8℃/min的速率升到310℃，保持5min；进样口温度为270℃，进样量为1μl，采用不分流模式；氦气流速为1ml/min；质谱传递线温度为320℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃；溶剂延迟时间为4min；扫描方式为全扫描，扫描范围为29.0-450.0m/z；采用nist数据库对测定的数据进行分析，聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯材质的输液袋中总共鉴
定出31种增塑剂和抗氧化剂(参见表1)。
22.表1聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯输液袋中鉴定的塑化剂、抗氧化剂及其与keap1蛋白结合的结合能大小
[0023][0024][0025]
3.虚拟筛选
[0026]
将autodock 4、autogrid 4和pyrx软件安装好，之后将autodock 4.exe和
autogrid4.exe两个文件拷贝到pyrx目录中，保证pyrx在本地电脑上顺利运行；使用autodock 4优化受体peak1蛋白，用open babble准备上述步骤2种鉴定的31种增塑剂和抗氧化剂，之后用vina wizard进行虚拟筛选，保存结果，删除结合能＞-5kj/mol的增塑剂和抗氧化剂，保留结合能＜-5kj/mol的抗氧化剂和增塑剂，虚拟筛选结果如表1所示。
[0027]
4.分子对接
[0028]
从蛋白数据库(rcsb pdb：homepage)中获取keap1蛋白(pdb id：4zy3)的晶体结构，采用pymol可视化软件将多余的配体和水分子删除，获取pdb文件，采用autodock4软件加氢、加电荷，并转换为pdbqt文件，同时建立刚性盒子的三维坐标参数，刚性盒子的三维坐标参数为：center-x＝-3.5，center-y＝4.8，center-z＝-31.4，size-x＝30.0，size-y＝30.0，size-z＝30.0，exhaustiveness＝20，num-modes＝20；从pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取表1所显示的20种增塑剂和抗氧化剂的3d结构，用pymol可视化软件转换为pdb文件，采用autodock激活旋转氢，并获取pdbqt文件，之后进行vina对接；对接结果用pymol及ligplot软件可视化，并分析相互作用力。20种增塑剂和抗氧化剂分别与keap1蛋白结合的结合位点及作用力如表2所示。
[0029]
[0030][0031]
由表2、图2和图3中可知，蝶呤-6-羧酸、磷酸异癸基二苯酯及抗氧化剂2246等具有较好的结合能，且形成的作用力也较多。有文献报道，上述物质对人体有一定的危害，使用
过程中严格把控其用量，且需要进一步研究其潜在危害。本发明预测到，蝶呤-6-羧酸、抗氧化剂2246等与keap1蛋白的氨基酸残基结合，形成疏水键和氢键作用力，改变keap1蛋白的构象，影响nrf2的正常释放，从而影响氧化应激信号通路各单元的正常运转。
[0032]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)样品前处理：称取适量聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯输液袋样品，在酸性、碱性及脂溶性模拟提取条件下提取，用二氯甲烷萃取，浓缩复溶，微孔滤膜过滤，制得样品溶液；b)迁移物质鉴定：将样品中的待测物质利用气相色谱质谱联用仪测定，结合被测物质的色谱质谱信息与nist数据库上的匹配度确定迁移物质；c)增塑剂和抗氧化剂的筛查：采用计算机虚拟筛选方法，对鉴定的增塑剂和抗氧化剂进行批量对接，通过打分函数打分，根据它们与keap1蛋白结合的结合能大小，筛查出潜在的keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质；d)潜在keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质与keap1蛋白之间的作用力揭示：采用分子对接方法揭示潜在keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质与keap1蛋白之间的作用力、结合位点及作用力大小，初步揭示潜在干扰物对keap1/nrf2信号通路的干扰作用。2.根据权利要求1所述的一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，其特征在于，所述样品前处理的方法为：称取聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯输液袋切片各2g，置于100ml酸性、碱性及脂溶性模拟提取液中，在40℃下进行周期为7天的加速试验，取10ml提取液，加4ml二氯甲烷，超声30min，萃取收集二氯甲烷层，将萃取液旋转蒸干，加1ml体积比为9∶1的甲醇和二氯甲烷混合溶剂复溶，用微孔滤膜过滤，低温储藏，备用。3.根据权利要求1所述的一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，其特征在于，所述增塑剂和抗氧化剂的鉴定方法为：色谱柱选用hp-5ms 30m
×
250μm
×
0.25μm；氦气流速为1ml/min；柱温箱初始温度为60℃，保持1min，之后以12℃/min的速率升到210℃，再以8℃/min的速率升到310℃，保持5min；进样口温度为270℃，进样量为1μl，采用不分流模式；质谱传递线温度为320℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃；溶剂延迟时间为4min；扫描方式为全扫描gc-ms，扫描范围为29.0-450.0m/z；采用nist数据库对测定的数据进行分析。4.根据权利要求1所述的一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，其特征在于，所述的增塑剂和抗氧化剂的筛查具体步骤为：首先，将pyrx和autogrid 4软件安装好，之后将autodock 4.exe和autogrid 4.exe两个文件拷贝到pyrx目录中，保证pyrx在本地电脑上顺利运行；使用autodock 4优化受体peak1蛋白，之后用open babble准备小分子(增塑剂和抗氧化剂)，之后用vina wizard进行虚拟筛选，保存结果，将结合能＞-5kj/mol的增塑剂和抗氧化剂删除，而结合能＜-5kj/mol的保留。5.根据权利要求1所述的一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对keap1/nrf2信号通路的干扰作用预测方法，其特征在于，所述潜在keap1/nrf2信号通路干扰迁移物质与keap1蛋白之间的作用力揭示的具体步骤为：从蛋白数据中荻取keap1蛋白(pdb id：4zy3)的晶体结构，采用pymol可视化软件将多余的配体和水分子删除，获取pdb文件，采用autodock软件加氢、加电荷，并转换为pdbqt文件；从pubchem数据库中获取所述的增塑剂和抗氧化剂的3d结构，用pymol可视化软件转换为pdb文件，采用autodock激活旋转氢并获取pdbqt文件，之后进行vina对接；对接结果用pymol及ligplot软件可视化及分析相
互作用力。

技术总结
本发明公开了一种基于分子对接技术的医用包材增塑剂与抗氧化剂对Keap1/Nrf2信号通路的干扰作用预测方法，包括以下步骤：(1)称取适量不同材质的输液袋，选取合适的注射液模拟溶液，在40℃开展模拟试验，超声提取，浓缩复溶，微孔滤膜过滤，制得含有输液袋迁移物质的溶液；(2)用气相色谱质谱联用仪分析鉴定输液袋迁移物质；(3)通过虚拟筛选和分子对接方法，筛选出干扰Keap1/Nrf2信号通路的潜在干扰迁移物，并揭示潜在干扰物质与Keap1蛋白之间的作用力，作用位点及作用力大小。本发明通过简化塑料包材添加剂潜在风险评估的程序，最大程度上增大添加剂评估库容，为筛查潜在风险添加剂带来方便。剂带来方便。剂带来方便。


技术研发人员：托合提萨伊普
受保护的技术使用者：谱尼测试集团股份有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/10/7