一种载肽模拟物PKHB1的脂质体眼用制剂及其制备方法与流程

一种载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂及其制备方法
技术领域
1.本发明属于医学技术领域，具体涉及一种载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂及其制备方法。


背景技术：

2.单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，hsk）是由单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus 1, hsv-1）感染所导致的严重感染性角膜病，是角膜盲的首要病因。目前hsk的治疗方法主要为使用抗病毒药物、皮质类固醇激素以及进行手术，虽有一定的疗效，但仍存在局的局限性。抗病毒疗法仅限于抑制复制阶段的病毒，对潜伏期的病毒无效，且已有病毒对阿昔洛韦产生了耐药性的研究报告。局部皮质类固醇的治疗可能导致诸多后遗症的产生，包括形成角膜瘢痕、新生血管和神经营养性角膜炎，不仅如此，类固醇反应青光眼和白内障形成也与其有关，还容易引起上皮性角膜炎的复发。作为治疗最后手段的角膜移植手术，不仅受到角膜供体数量、医生技术和医疗条件的限制，且术后易发生排异反应。因此，我们亟待寻找新的靶点对hsk进行更有效的治疗。hsv-1在与人体免疫博弈过程中，病毒使眼部处于在免疫抑制的微环境中，组织细胞表达抑制性受体/配体，免疫细胞释放抑制性细胞因子，抑制固有免疫和适应性免疫，以规避免疫介导的靶向和杀伤，病毒进行大量复制和迅速扩散，最终导致感染加重和破坏性组织损伤。因此，开发一种增强宿主免疫系统的滴眼液对治疗hsk至关重要。
3.血小板反应蛋白-1肽模拟物pkhb1作为免疫原性细胞死亡的诱导剂，通过诱导死亡细胞发出一组免疫刺激损伤相关分子模式（damps）和细胞因子，促进抗原呈递细胞（apcs）的募集、吞噬和成熟，引发细胞毒性t淋巴细胞依赖的免疫反应。其吸收速度快、分子结构小、活性强、安全性高、副作用小等优点，使其应用于眼表感染性疾病具有一定的医疗前景和临床潜力。
4.常规滴眼液剂型有很多缺点，如药物在眼表作用时间短、吸收率差、易从泪道流出等。而脂质体眼用制剂具有类似细胞膜的磷脂双分子层结构，可携带亲水性或亲脂性药物。脂质体作为药物输送载体，可以增加包封药物的溶解度；提高药物的治疗效果，减少用药量；减轻药物的不良反应；延长药物的体内循环时间；提高药物输送的靶向性；具有良好的生物相容性。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明公开了一种载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂及其制备方法。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂及其制备方法，所述载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂的结构如下所示：
；所述制备方法包括以下步骤：步骤（1）树脂溶胀：称量0.6g 2-氯三烷基氯树脂（ctc resin），将树脂放入反应管中，加1.5ml/g二氯甲烷（dcm），振荡30min后，得到充分溶胀的树脂；步骤（2）缩合氨基酸：通过沙芯抽滤掉步骤（1）中的产物，加入3倍摩尔过量的n-(9-芴甲氧羰基)-l-赖氨酸（fmoc-lys-oh），滴加数滴二甲基甲酰胺（dmf）使其溶解，再加入乙基二异丙胺（dipea）和缩合试剂苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯（hbtu），最后鼓氮气0.5h，使用dmf洗涤3次，取少量树脂进行茚三酮检测；步骤（3）脱保护：加20%哌啶/dmf溶液，5min后去掉再加20%哌啶，震荡15min，使用dmf洗涤，取少量树脂后进行茚三酮检测；重复步骤（2）和步骤（3），最后用甲醇洗树脂并抽干，得到流沙状的树脂肽；步骤（4）切割：洗涤并充分干燥步骤（3）所得树脂肽，加入切割液，并于室温摇床震荡，抽滤并收集滤液，以转速3000转/分钟离心洗涤，抽干后得到粗品肽；步骤（5） 纯化：纯化步骤（4）所得粗品肽，最终得到纯度＞95%的粉末状pkhb1多肽，并用质谱法（ms）和高效液相色谱法（hplc） 进行分析；步骤（6）溶解脂质材料：将胆固醇18mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱52mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺6mg加入烧瓶中，以25ml氯仿甲醇混合溶液充分溶解，得到混合溶液； 步骤（7）蒸馏和水合：使用旋转蒸发仪蒸馏步骤（6）所得的混合溶液，完全蒸发溶剂后，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面，加入pbs溶液5ml，同时加入pkhb1 5mg，利用超声波清洗仪震荡5min，使所得脂质膜充分重悬，得到载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用试剂，-20℃保存。
7.进一步地，步骤（2）和步骤（3）中所述茚三酮检测的步骤为：配制显色试剂：试剂a：80g苯酚溶于20ml乙醇；试剂b： 2ml 0.001m的氰化钾（kcn）加入98ml重蒸吡啶中；试剂c：5g茚三酮溶于100ml乙醇中，待测树脂中加入上述配制好的试剂a、试剂b、试剂c三种试剂各两滴，100℃加热3min，树脂无色，说明偶联反应完全。
8.进一步地，步骤（3）中所述甲醇为200-500ml和所述树脂为10mg。
9.进一步地，步骤（4）中所述纯化的方法为使用含三氟乙酸（tfa）ph2.0的缓冲体系，通过214nm c8反相柱纯化粗品肽。
10.进一步地，步骤（4）中所述多肽的序列为seq_1：krfyvvmwkk。
11.进一步地，步骤（4）中所述切割液为三氟乙酸（tfa）：水（h2o）：三异丙基硅烷（tis）=95%：2.5%：2.5%。
12.进一步地，步骤（4）中所述摇床震荡的时间为2h。
13.进一步地，步骤（5）中所述高效液相色谱法（hplc） 的分析条件为：色谱柱inertsil ods-3，4.6
×
250mm，流动相a：含有0.065%三氟乙酸乙酯的水溶液，流动相b：含有0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，流速1 ml/min，检测波长：220 nm；所述质谱法（ms）的分析条件为先经离子化带上一定量的电荷，然后通过检测器可得到肽段的质荷比（m/z），从而得知其相对分子质量为1384.74，如图2所示。
14.进一步地，步骤（6）所述氯仿甲醇混合溶液体积比为氯仿：甲醇=2：1。
15.本发明的有益效果为：（1）本发明制作合成步骤简单，原材料便宜且常见易于购买，产品更加经济实惠，可减轻患者经济负担；主要成分易于吸收，无毒无刺激性具有良好的生物相容性，对眼表无损害；（2）本发明为脂质体眼用制剂，达到纳米级，提高药物输送的靶向性；可以有效的穿过泪膜屏障到达角膜等眼表组织，引起免疫反应，迅速彻底清除病毒；（3）本发明中眼用制剂首次采用了免疫治疗方法，通过高生物安全性的肽模拟物pkhb1，激活先天性免疫反应和适应性免疫反应，更迅速地清除病毒，阻碍了hsk病程的进展，对hsk有很好的治疗效果。
附图说明
16.图1为本发明实施例1的制备方法流程图；图2为本发明实施例1的质谱法（ms）和高效液相色谱法（hplc） 的分析图；图3为本发明实施例2的载肽模拟物pkhb1脂质体的电镜图；图4为本发明实施例3的载肽模拟物pkhb1脂质体细胞活性试验的示意图；图5为本发明实施例4-5的体内实验证明载肽模拟物pkhb1脂质体抑制hsv-1在小鼠眼部复制的示意图；图6为本发明实施例6的体内实验证明载肽模拟物pkhb1脂质体缓解hsk小鼠角膜病变的示意图。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
18.参照图1所示的制备方法流程图，称量0.6g ctc resin，将树脂放入反应管中，加1.5ml/gdcm，振荡30min后，得到充分溶胀的树脂；缩合氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-leu-oh，滴加数滴dmf溶解，再加入dipea和缩合试剂hbtu，最后鼓氮气0.5h，使用dmf洗涤3次，取少量树脂进行茚三酮检测，所述茚三酮检测的步骤为：配制显色试剂：试剂a：80g苯酚溶于20ml乙醇；试剂b：2ml 0.001m的氰化钾（kcn）加入98ml重蒸吡啶中；试剂c：5g茚三酮溶于100ml乙醇中，待测树脂中加入上述配制好的试剂a、试剂b、试剂c三种试剂各两滴，100℃加热3min；脱保护，加15ml 20%哌啶/dmf溶液，5min后去掉再加20%哌啶，震荡15min，使用dmf
洗涤，取少量树脂后进行茚三酮检测；重复缩合氨基酸和脱保护，最后用甲醇洗树脂并抽干，得到流沙状的树脂肽；切割，洗涤并充分干燥树脂肽，加入切割液tfa：h2o：tis=95%：2.5%：2.5%，并于室温摇床震荡2h，抽滤并收集滤液，以转速3000转/分钟离心洗涤，抽干后得到粗品肽；使用含三氟乙酸（tfa）ph2.0的缓冲体系，通过214nm c8反相柱纯化粗品肽，纯化后，最终得到纯度＞95%，序列为krfyvvmwkk的多肽，并用质谱法（ms）和高效液相色谱法（hplc） 进行分析；hplc：色谱柱inertsil ods-3，4.6
×
250mm。流动相a：含有0.065%三氟乙酸乙酯的水溶液,流动相b：含有0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，流速1 ml/min。检测波长：220 nm，ms：先经离子化带上一定量的电荷，然后通过检测器可得到肽段的质荷比（m/z），从而得知其相对分子质量；溶解材料：将胆固醇18mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱52mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺6mg、pkhb1 5mg加入烧瓶中，以25ml氯仿甲醇混合溶液充分溶解，加热促进溶解，得到混合溶液；蒸馏和水合：使用旋转蒸发仪蒸馏混合溶液，完全蒸发溶剂后，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面，加入pbs溶液5ml，利用超声波清洗仪震荡5min，使所得脂质膜充分重悬，得到载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂，-20℃保存。
实施例2
19.实施例1中载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂的物理形态观察。
20.将样品取出10μl，常温干燥3-5min后，进行透射电子显微镜镜（80-120 kv， jem-1400 plus，jeol，日本）检测成像。
21.结果参照图3所示，图像显示本眼用制剂中的脂质体形状为球形纳米结构。
实施例3
22.将不同细胞（hcec、raw264.7、thp1）分别培养在96孔板中，去除上清液，并加入不同浓度载pkhb1脂质体配制的新培养基。置于含有5% co2的37℃培养箱静置培养24小时后，吸弃培养基，每孔加入含有10μl cck-8工作液的100μl新鲜培养基，继续孵育2小时。最后使用酶标仪在450nm处测量每个孔的od值，将处理细胞od值与未处理细胞od值进行对比，得到不同浓度载pkhb1脂质体下细胞活度的百分比，结果如图4所示。
实施例4
23.参照图5所示，构建小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型：使用30号针头在小鼠角膜水平垂直方向各做5次划痕，然后滴入5μl的hsv-1（mckrae， 1
×
106pfu/ml）。
24.分组及治疗情况：将小鼠分为2组，实验组和对照组。实验组滴加实施例1中制备的眼用制剂，对照组滴加pbs缓冲液。构建模型后，连续三天给药pkhb1多肽或者pbs，每天1次，每次5μl。
25.于感染第3天取角膜和三叉神经节进行qrt-pcr检测感染病毒基因表达，显示实验组hsv-1 gb水平明显下降。
实施例5
26.参照图5所示，构建小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型：使用30号针头在小鼠角膜水平垂直方向各做5次划痕，然后滴入5μl的hsv-1（mckrae, 1
×
106pfu/ml）。
27.分组及治疗情况：将小鼠分为2组，实验组和对照组。实验组滴加实施例1中制备的眼用制剂，对照组滴加pbs缓冲液。构建模型后，连续三天给药pkhb1多肽或者pbs，每天1次，每次5μl。
28.于感染第3天取眼拭子进行tcid50检测病毒的滴度，显示实验组hsv-1水平明显下降。
实施例6
29.参照图6所示，构建小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型：使用30号针头在小鼠角膜水平垂直方向各做5次划痕，然后滴入5μl的hsv-1（mckrae，1
×
106pfu/ml）。
30.分组及治疗情况：将小鼠分为2组，实验组和对照组。实验组滴加实施例1中制备的眼用制剂，对照组滴加pbs缓冲液。构建模型后，连续三天给药pkhb1多肽或者pbs，每天1次，每次5μl。
31.于感染第3、6天，对小鼠眼表进行观察并拍照。使用hsk病变程度评分和荧光素钠染色评分来量化症状，显示实验组小鼠临床症状明显缓解。
32.需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

技术特征：
1.一种载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂及其制备方法，其特征在于，所述载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂的结构如下所示：；所述制备方法包括以下步骤：步骤（1）树脂溶胀：称量0.6g氯三烷基氯树脂（ctc resin），将树脂放入反应管中，加1.5ml/g二氯甲烷（dcm），振荡30min后，得到充分溶胀的树脂；步骤（2）缩合氨基酸：通过沙芯抽滤步骤（1）中所得产物，继续加入3倍摩尔过量的n-(9-芴甲氧羰基)-l-赖氨酸（fmoc-lys-oh），滴加数滴二甲基甲酰胺（dmf）使其溶解，再加入乙基二异丙胺（dipea）和缩合试剂苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯（hbtu），最后鼓氮气0.5h，使用二甲基甲酰胺（dmf）洗涤3次，取少量树脂进行茚三酮检测；步骤（3）脱保护：加20%哌啶/dmf溶液，5min后去掉再加20%哌啶，震荡15min，使用dmf洗涤，取少量树脂后进行茚三酮检测；重复步骤（2）和步骤（3），最后用甲醇洗树脂并抽干，得到流沙状的树脂肽；步骤（4）切割：洗涤并充分干燥步骤（3）所得树脂肽，加入切割液，并于室温摇床震荡，抽滤并收集滤液，沉淀离心洗涤，抽干后得到粗品肽；步骤（5） 纯化：纯化步骤（4）所得粗品肽，最终得到纯度＞95%的粉末状pkhb1多肽，并用质谱法（ms）和高效液相色谱法（hplc）进行分析；步骤（6）溶解脂质材料：将胆固醇18mg、二硬脂酰磷脂酰胆碱52mg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 6mg加入烧瓶中，以25ml氯仿甲醇混合溶液充分溶解，得到混合溶液；步骤（7）蒸馏和水合：使用旋转蒸发仪蒸馏步骤（6）所得混合溶液，完全蒸发溶剂后，脂质材料混合物形成一层薄膜附着于烧瓶表面，加入pbs溶液 5ml，同时加入pkhb1 5mg，利用超声波清洗仪震荡5min，使所得脂质膜充分重悬，得到载肽模拟物pkhb1的脂质体眼用制剂，-20℃保存。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中所述茚三酮检测的步骤为：配制显色试剂：试剂a：80g苯酚溶于20ml乙醇；试剂b：2ml 0.001m的氰化钾（kcn）加入98ml重蒸吡啶中；试剂c：5g茚三酮溶于100ml乙醇中，待测树脂中加入上述配制好的试剂a、试剂b、试剂c三种试剂各两滴，100℃加热3min。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述甲醇为200-500ml，所述树脂为10mg。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述纯化的方法为使用含三氟乙酸（tfa）ph2.0的缓冲体系，通过214nm c8反相柱纯化粗品肽。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述多肽的序列为seq_1：krfyvvmwkk。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述切割液重量配比为三氟乙酸（tfa）：水（h2o）：三异丙基硅烷（tis）=95%：2.5%：2.5%。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述摇床震荡的时间为2h。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述高效液相色谱法（hplc） 的分析条件为：色谱柱inertsil ods-3，4.6
×
250mm，流动相a：含有0.065%三氟乙酸乙酯的水溶液，流动相b：含有0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，流速1 ml/min，检测波长：220 nm；所述质谱法（ms）的分析条件为先经离子化带上一定量的电荷，然后通过检测器可得到肽段的质荷比（m/z），从而得知其相对分子质量。9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述氯仿甲醇混合溶液体积比为氯仿：甲醇=2：1。

技术总结
本发明提供一种载肽模拟物PKHB1的脂质体眼用制剂及其制备方法，所述制备方法步骤依次为：树脂溶胀、缩合氨基酸、脱保护、切割、纯化后，得到高纯度的多肽，然后溶解磷脂、胆固醇等脂质基础材料，通过蒸发和水合包裹PKHB1，最终得到治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的多肽模拟物PKHB1脂质体眼用制剂；本发明可根据实际需要制备多种剂型，使用更加便捷，提高了患者的依从性；纳米级的药物递送系统，有效的穿过泪膜屏障到达角膜等眼表组织，可提高药物在眼球表面的浓度，延长药物的作用时间；PKHB1可以增强眼部固有免疫和适应性免疫，有效抑制病毒复制，控制感染扩散。控制感染扩散。控制感染扩散。


技术研发人员：胡凯 何赟 王晨晨
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/10/7