一种提高慢病毒稳定性的PEG修饰方法与流程

一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法
技术领域
1.本发明涉及生物制剂保存技术领域，具体地说，涉及一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法。


背景技术：

2.car-t疗法，也称为嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，其通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法；
3.技术人员通过基因工程技术，使用慢病毒，感染t细胞，装上定位导航装置car(肿瘤嵌合抗原受体)，即car-t细胞，可以特异性识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的；
4.慢病毒的生产和制备，是改造t细胞很重要的一环，如何生产、有效保存并发挥其独特的感染改造t细胞的特性，值得研究，慢病毒整体大小约100nm，在病毒载体中属于体积较大类型，属于逆转录病毒科的一种，但其结构和基因组的复杂程度远超其他逆转录病毒，在日常生产中，慢病毒体积较大，容易受到剪切力的影响而导致结构受到破坏，还有蛋白之间相互黏连、降解等因素，同时考虑到37℃条件下慢病毒的半衰期只有6-12h，工业化慢病毒生产，收集慢病毒上清、柱层析纯化回收、浓缩换液、制剂分装过程长达2-4天，制剂冻融过程也会造成慢病毒活性降低，病毒降解速率过快导致t细胞感染时效果不佳，因此在生产中，如何提高慢病毒的稳定性以及延长其半衰期是重要课题。
5.聚乙二醇修饰即peg化，是将活化的peg通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子表面，自davis1977年首次用peg修饰牛血清白蛋白以来，peg修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，它可以使蛋白半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9
×
106da，本身的免疫原性也很低，临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生，然而peg修饰蛋白质主要通过peg末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现，而peg末端羟基活性很差，必须使用活化剂对其进行活化，才能在体内温和的条件下对蛋白质进行共价修饰。
6.为了提高慢病毒的稳定性以防止其降解，提出一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明目的在于，提供了一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，包括以下步骤：
9.s1、培养悬浮293f细胞并转染制备dna和pei相混合的混合液；
10.s2、配制a、b液，涡旋混匀后室温静止后，将a液加入到b液中吹打混匀，室温静置形成培养液；
11.s3、将混合液加入到培养液中进行灌流培养后深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液；
12.s4、细胞上清液加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯，继续摇动反应后，浓缩慢病毒上清液；
13.s5、通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存。
14.作为本技术方案的进一步改进，所述s1中，通过培养基和细胞波浪反应器培养悬浮293f细胞，并在37℃，8％co2，角度为7
°
时以30rpm/min的频率摇动。
15.作为本技术方案的进一步改进，所述s1中，转染前一天按照2.0
×
106cells/ml密度接种，并且转染时采用瞬时转染工艺。
16.作为本技术方案的进一步改进，所述s2中，a液为3mg质粒+60ml培养基，b液为12mg pei+60ml培养基。
17.作为本技术方案的进一步改进，所述s3中，灌流培养时速率为1ml/min，培养至65h后进行深层过滤。
18.作为本技术方案的进一步改进，所述s3中，深层过滤去除细胞及碎片时的速率为15ml/min，且压力小于1ba，收集细胞上清液后在4℃环境中放置保存。
19.作为本技术方案的进一步改进，所述s4中，细胞上清液以1.5g/l的比例加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯。
20.作为本技术方案的进一步改进，所述s4中，使用中空纤维柱浓缩慢病毒上清液，且浓缩时流速为35ml/min，跨膜压差为0.5ba。
21.作为本技术方案的进一步改进，所述s5中，低压层析柱为26/100网络预填充管柱。
22.作为本技术方案的进一步改进，所述s5中，分装时以500ul/管进行分装，且分装后在-80℃环境中进行保存。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果：
24.该提高慢病毒稳定性的peg修饰方法中，经过mpeg修饰的慢病毒，有效降低了病毒降解，可以在t细胞上清中存在更久，提高了感染效率，并且其在溶液中无论是处于游离还是结合形式，不仅对慢病毒没有副作用，还可以增加其水溶性外，减少免疫原性，提高慢病毒的稳定性，延长慢病毒的半衰期。
附图说明
25.图1为本发明的整体流程图；
26.图2为本发明的4℃病毒稳定性试验曲线图；
27.图3为本发明的22℃病毒稳定性试验曲线图；
28.图4为本发明的37℃病毒稳定性试验曲线图。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.请参阅图1所示，本实施例目的在于，提供了一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，包括以下步骤：
32.s1、培养2l悬浮293f细胞并转染制备dna和pei相混合的混合液(目的质粒pgkc-egfp-cd19带有绿色荧光标签蛋白)，其中，通过培养基和细胞波浪反应器培养悬浮293f细胞，并在37℃，8％co2，角度为7
°
时以30rpm/min的频率摇动，转染前一天按照2.0
×
106cells/ml密度接种，培养第二天细胞密度可至4.0
×
106cells/ml左右，并且转染时采用瞬时转染工艺，瞬时转染工艺是将dna导入真核细胞的方式之一，在瞬时转染中，重组dna导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的dna不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测；
33.s2、配制a、b液，涡旋混匀后室温静止5min后，将a液加入到b液中轻轻吹打混匀，室温静置15min形成培养液，a液为3mg质粒(plp1:plp2:plvx:pvsvg 1.5：1.5：2：1共3mg)+60ml培养基，b液为12mg pei+60ml培养基；
34.s3、将混合液加入到培养液中进行灌流培养后，使用科百特8-10um与0.45/0.22um深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液，其中，灌流培养时间为12h-24h，灌流培养时速率为1ml/min，培养至65h后进行深层过滤，深层过滤去除细胞及碎片时的速率为15ml/min，且压力小于1ba，收集细胞上清液后在4℃环境中放置保存；
35.s4、实验组细胞上清液加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯，37
°
条件下，继续摇动反应2h后，再与对照组aa一起进行后续处理，浓缩慢病毒上清液，其中，细胞上清液以1.5g/l的比例加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯，浓缩时使用300kd的0.26m2中空纤维柱浓缩慢病毒上清液，且浓缩时流速为35ml/min，跨膜压差为0.5ba；
36.s5、通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存，低压层析柱为26/100网络预填充管柱，且平衡/洗杂液：1
×
pbs，ph7.4，流速6-10ml/min，上样20个柱体积，且分装时以500ul/管进行分装，且分装后在-80℃环境中进行保存。
37.任取一管，进行滴度检测，该实验重复三次，结果如表1，
38.表1
[0039][0040]
如表1所示，在有peg修饰的情况下，慢病毒降解速率减缓，同时能承受更高的剪切力，回收率提高，但是实验组有peg修饰的条件下，慢病毒理化特性不一致，层析回收过程中，发现回收率降低，但是总病毒滴度仍然高于对照组aa。
[0041]
注：滴度检测方法为jurkat计数测活率》90％，取适量细胞离心，重悬，计数，稀释
1e6/ml(至0.9-1.1e6皆可)，200ul/孔铺板，采用梯度稀释法，取10ul至40ul的opti-mem中，混匀得到5倍稀释液，取10ul的5倍稀释液至第二管40ul opti-mem中，得到25倍稀释液，分别取10ul的原液、5倍稀释液、25倍稀释液，加入96孔板中，36h，流式检测荧光率，根据25倍稀释液的荧光率，代入公式计算病毒生物滴度：
[0042]
2x10
5 x 25x荧光率/(10x10-3
)＝病毒滴度。
[0043]
试验例1
[0044]
慢病毒稳定性实验：如图2-4所示，在4
°
，22
°
，37
°
温度下，对未修饰的病毒与peg修饰的慢病毒，每5h取样，进行时间-滴度检测实验，滴度结果4℃条件下，实验组0-40h病毒滴度变化微小，未有peg修饰的情况下，病毒20-30h降解一半，40-60h已经完全无法满足实验要求，22℃与37℃条件下结果类似。
[0045]
试验例2
[0046]
慢病毒感染实验：提取pbmc，使用cd3磁珠分离提取t细胞，t细胞激活后，分别取实验组与对照组慢病毒，直接加入t细胞上清中，48h后换液，96h时流式检测细胞荧光率，实验分组表2。
[0047]
表2
[0048][0049][0050]
结论：peg修饰的慢病毒，有效降低了病毒降解，可以在t细胞上清中存在更久，提高了感染效率，但是短时间(10h内)感染率不如未进行peg修饰的慢病毒，可能是与peg修饰后空间体积的变化，影响了慢病毒的感染效率，但48h感染率要远高于未修饰的慢病毒。
[0051]
总结:
[0052]
mpeg修饰慢病毒，其在溶液中无论是处于游离还是结合形式，不仅对慢病毒没有副作用，还可以增加其水溶性外，减少免疫原性，提高慢病毒的稳定性，延长慢病毒的半衰期。
[0053]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、培养悬浮293f细胞并转染制备dna和pei相混合的混合液；s2、配制a、b液，涡旋混匀后室温静止后，将a液加入到b液中吹打混匀，室温静置形成培养液；s3、将混合液加入到培养液中进行灌流培养后，深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液；s4、细胞上清液加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯，继续摇动反应后，浓缩慢病毒上清液；s5、通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存。2.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s1中，通过培养基和细胞波浪反应器培养悬浮293f细胞，并在37℃，8％co2，角度为7
°
时以30rpm/min的频率摇动。3.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s1中，转染前一天按照2.0
×
106cells/ml密度接种，并且转染时采用瞬时转染工艺。4.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s2中，a液为3mg质粒+60ml培养基，b液为12mg pei+60ml培养基。5.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s3中，灌流培养时速率为1ml/min，培养至65h后进行深层过滤。6.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s3中，深层过滤去除细胞及碎片时的速率为15ml/min，且压力小于1ba，收集细胞上清液后在4℃环境中放置保存。7.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s4中，细胞上清液以1.5g/l的比例加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯。8.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s4中，使用中空纤维柱浓缩慢病毒上清液，且浓缩时流速为35ml/min，跨膜压差为0.5ba。9.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s5中，低压层析柱为26/100网络预填充管柱。10.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s5中，分装时以500ul/管进行分装，且分装后在-80℃环境中进行保存。

技术总结
本发明涉及生物制剂保存技术领域，具体地说，涉及一种提高慢病毒稳定性的PEG修饰方法。其包括以下步骤：培养并转染制备混合液；配制A、B液形成培养液；将混合液加入到培养液中进行灌流培养，深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液；细胞上清液加入mPEG-马来酰亚胺正己酸酯，继续摇动反应后，浓缩慢病毒上清液；通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存。本发明中经过mPEG的修饰慢病毒，有效降低了病毒降解，可以在T细胞上清中存在更久，提高了感染效率，并且其在溶液中无论是处于游离还是结合形式，不仅对慢病毒没有副作用，还可以增加其水溶性外，减少免疫原性，提高慢病毒的稳定性，延长慢病毒的半衰期。延长慢病毒的半衰期。延长慢病毒的半衰期。


技术研发人员：唐东起 王道光 吴雨菲 马鑫鑫 辛家伟 田玲
受保护的技术使用者：山东大华凯特生物集团有限公司
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/10/7