一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法。


背景技术：

2.细胞治疗，是目前靶向治疗癌症的重要研究方向。在细胞治疗领域，用慢病毒转染t细胞，以实现外源基因的导入是常用的构建慢病毒载体的技术手段。t细胞转导率是最终产品质量把控的重要指标。转导率过低时，会导致病人体内存在大量无关细胞；此外，为保证外源基因的导入量，转导率低则需要使用大量的病毒，从而直接提高细胞治疗的生产成本；与此同时，为了达到所需的剂量，低转导率还会导致细胞培养的时间增长，而长时间的培养则会导致t细胞的分化，进而降低临床疗效。由此可见，提高病毒的转导率是提升细胞治疗效率的关键性问题。
3.目前，现有技术中，提高细胞转导率主要有两个方向，一是在病毒载体本身层面进行研究，比如尝试不同的启动子、优化基因序列等；二是在病毒感染细胞的方法层面进行研究，如添加如鱼精蛋白、聚凝胺polybrene等促进转导的试剂，或者采用离心转导的方式来提高转导效率。然而，对于病毒载体本身的优化，具有一定的局限性和不确定性；二添加促转导试剂，则需要促转导试剂在药用辅料的级别上产生明显的促转导效率，聚凝胺polybrene并非药用辅料，而鱼精蛋白的促转导效率有限，仅能在原有基础上提高20％-50％；此外，离心转导的方式则需在专门设备的基础上进行，既增加了工艺的复杂性，还提高了生产成本，对于放大生产中转导率的提高是有限的。
4.因此，基于以上现有检测方法的局限性，本领域亟需一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，在不增加工艺复杂性且兼顾生产成本的基础上，能够大幅提高慢病毒转导t细胞的效率。


技术实现要素：

5.铂乐沙姆p338通过亲水性区域偶联目的物质，即慢病毒，疏水性区域降低细胞膜的微粘度，来提高磷脂的交换，增强细胞膜对离子和溶液的运输，从而达到促进慢病毒lvv转导的作用。然而，单纯的铂乐沙姆p338等促转导剂的添加，对慢病毒lvv的转导率的提升是有限的，目前主流的培养条件下，采用培养瓶或透气袋进行静态培养，病毒的转导率为10％，添加了铂乐沙姆p338等促转导剂后，一般可提升至30％，仍处于较低的水平。
6.为解决以上技术问题，本发明提供了一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，包括如下步骤：
7.步骤1、慢病毒载体的构建：采用四质粒系统，采用293细胞进行转染包装，得到构建好的慢病毒载体；
8.步骤2、外周血单核细胞的获取和前处理：从人外周血中分离获得待转导的外周血单核细胞，激活后，接种至培养基中进行培养，所述外周血单核细胞包括t细胞、nk细胞、b细
胞和单核细胞；
9.步骤3、联合转导：向步骤2中获取并处理完成的外周血单核细胞中加入步骤1中构建好的慢病毒载体，进行病毒转导，所述联合转导是指添加促转导剂的同时，对细胞进行动态培养，所述动态培养为水平摇床摇晃培养或搅拌培养。
10.具体地，步骤1中，所述四质粒系统包括gag-pol包装质粒、rev包装质粒、包膜质粒和转移质粒。
11.具体地，步骤2中，所述培养基为optmizer培养基、texmacs培养基、x vivo培养基、optivitro培养基和nutri t培养基中的一种。
12.具体地，步骤2中，所述培养的条件为37℃，co2浓度为5％。
13.具体地，步骤2中，所述培养的时间为36-48h。
14.优选地，步骤2中，所述培养的时间为36h或48h。
15.具体地，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338、鱼精蛋白protamine、聚凝胺polybrene、letiboost和vfusion中的一种。
16.优选地，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338。
17.具体地，步骤3中，所述促转导剂的浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。
18.优选地，步骤3中，所述促转导剂的浓度为1.0mg/ml。
19.具体地，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。
20.优选地，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速100rpm，培养时间7天。
21.具体地，步骤3中，所述搅拌培养是指使用先使用搅拌桨混匀，再进行水平摇床摇晃培养，所述搅拌桨的转速为50-150rpm，所述搅拌的时间为6h。
22.具体地，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。
23.优选地，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速100rpm，培养时间7天。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.1)本发明提供的方法，通过动态培养的方式，克服了静态培养下病毒仅能够在自身600微米范围内做布朗运动，而无法接触600微米以外细胞的弊端，增加了病毒和细胞的接触面积和频次，解决了病毒的浪费和转导的低效率问题。
26.2)本发明提供的方法，通过联合转导的方式，将促转导剂和动态培养的方式联合，并探索出最适宜的转导培养方法，使得动态培养的转导率进一步提升，且动态培养也进一步提升了促转导剂对磷脂交换的提高作用，二者相辅相成，共同促进了慢病毒转导外周血单核细胞的效率。
27.3)本发明提供的方法，操作简便，成本可控，可将主流培养条件下10％-30％的转导率提升至70％左右，最多可产生7倍的转导率提升效果，节省了病毒用量，降低细胞治疗的成本。
附图说明
28.图1为本发明实施例1中，7组不同条件下，慢病毒转导t细胞的转导率对比图。
具体实施方式
29.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均为商品化试剂，可从市售渠道获得。
31.实施例1
32.根据本发明提供的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，本实施例示出了一种以铂乐沙姆p338为促转导剂，采用本发明提供的方法，转导t细胞并检测转导率。
33.共设置7组进行转导率的对比，并在培养7天后进行转导率检测：
34.第一组：组名d7 blank，作为空白对照，不添加病毒；
35.第二组：组名d7 static，进行静态培养，整个培养过程在培养瓶或透气袋中静置进行，具体步骤为：人外周血获取t细胞并激活培养，培养48h后，加入构建好的慢病毒进行转导，继续培养，在第7天时检测该组别转导率；
36.第三组：组名d7 static+p0.5，进行静态培养并添加0.5mg/ml的铂乐沙姆p338，静态培养的具体步骤与第二组相同，添加铂乐沙姆p338的时间为培养后48h；
37.第四组：组名d7 static+p1，进行静态培养并添加1mg/ml的铂乐沙姆p338，静态培养的具体步骤与第二组相同，添加铂乐沙姆p338的时间为培养后48h；
38.第五组：组名d7 static+p2，进行静态培养并添加2mg/ml的铂乐沙姆p338，静态培养的具体步骤与第二组相同，添加铂乐沙姆p338的时间为培养后48h；
39.第六组：组名d7 shake，进行动态培养，具体操作步骤为：人外周血获取t细胞并在摇瓶中培养，培养条件为振幅25毫米，转速100rpm，37℃，5％ co2；培养48h后，加入构建好的慢病毒进行培养，并继续摇晃培养，至第7天时检测该组别转导率；
40.第七组：组名d7 shake+p1，进行联合转导，动态培养且添加1mg/ml的铂乐沙姆p338，动态培养的具体步骤与第六组相同，添加铂乐沙姆p338的时间为培养后48h。
41.培养至第七天，使用流式细胞仪检测每组的转导率，根据流式细胞仪检测的发出荧光的细胞所占百分比，得出转导率。所得转导率如下表1所示：
42.表1：七组实验的慢病毒转导t细胞的转导率
43.组别d7 car+(td％)d7 blank0.01％d7 static11.62％d7 static+p0.537.16％d7 static+p136.78％d7 static+p235.22％d7 shake23.77％d7 shake+p173.98％
44.如图1所示，为七组实验的慢病毒t细胞转导率的对比图，根据上表1结合图1，可以明显且直观地看出，静态培养进行转导的转导率为11.62％，在静态培养的基础上添加适当浓度的促转导剂后，转导率可提升至35％-37％，而本发明提供的方法，采用联合转导，在动态培养的基础上，结合促转导剂，可将转导率大幅提升至73％以上，转达率相较静态培养可
提升七倍。
45.综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、慢病毒载体的构建：采用四质粒系统，采用293细胞进行转染包装，得到构建好的慢病毒载体；步骤2、外周血单核细胞的获取和前处理：从人外周血中分离获得待转导的外周血单核细胞，激活后，接种至培养基中进行培养，所述外周血单核细胞包括t细胞、nk细胞、b细胞和单核细胞；步骤3、联合转导：向步骤2中获取并处理完成的外周血单核细胞中加入步骤1中构建好的慢病毒载体，进行病毒转导，所述联合转导是指添加促转导剂的同时，对细胞进行动态培养，所述动态培养为水平摇床摇晃培养或搅拌培养。2.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤1中，所述四质粒系统包括gag-pol包装质粒、rev包装质粒、包膜质粒和转移质粒。3.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养基为optmizer培养基、texmacs培养基、x vivo培养基、optivitro培养基和nutri t培养基中的一种。4.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的条件为37℃，co2浓度为5％。5.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的时间为36-48h。6.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338、鱼精蛋白protamine、聚凝胺polybrene、letiboost和vfusion中的一种。7.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述促转导剂的浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。8.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。9.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述搅拌培养是指使用先使用搅拌桨混匀，再进行水平摇床摇晃培养，所述搅拌桨的转速为50-150rpm，所述搅拌的时间为6h。10.根据权利要求9所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。

技术总结
本发明公开了一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，通过动态培养和促转导剂的联合转导方式，克服了静态培养下病毒仅能够在自身600微米范围内做布朗运动，而无法接触600微米以外细胞的弊端，增加了病毒和细胞的接触面积和频次，解决了病毒的浪费和转导的低效率问题，通过探索最适宜的转导培养方法，使得动态培养的转导率进一步提升，同时，本方法操作简便，成本可控，可将主流培养条件下10％-30％的转导率提升至70％左右，对于病毒转导效率提升，节省病毒用量，降低细胞治疗成本具有重要的意义。重要的意义。重要的意义。


技术研发人员：颜海波 陈飞
受保护的技术使用者：无锡生基医药科技有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/10/7