灵芝过氧化物酶GlDyP基因及其编码蛋白和应用

灵芝过氧化物酶gldyp基因及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于真菌分子生物学领域，更具体地说，涉及灵芝过氧化物酶gldyp基因及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.dyps(dye-decolorizing peroxidases)即染料脱色过氧化物酶，是一类含有血红素，最先在担子菌烟管菌(bjerkandera adusta)中发现，能够降解多种染料的过氧化物酶。其远端血红素区域不同于锰过氧化物酶(manganese peroxidase，mnp)、多功能过氧化物酶(versatile peroxidase，vp)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，lip)等血红素过氧化物酶，因此dyps是一种新型的血红素过氧化物酶。dyps广泛分布在真菌、细菌和古细菌的基因组中。基于序列比对，dyps在peroxibase数据库中分为4种类型，a、b和c型主要来源于细菌和古生菌，d型是真菌来源。然而，基于结构对齐的分类，dyps被分为三类：p(初级)表示以前的b类，结构最紧凑；i(中级)是指以前的a级，带有附加序列；v(高级)表示以前的c和d类，也有附加序列。
3.dyps具有广泛的底物特异性，不仅能够降解一些典型的过氧化物酶底物如abts和酚类化合物，还能降解多种复杂的染料。并且在原核生物中，已证实dyps具有降解木质素的生理功能。dyp在真菌生物学中的作用是不确定的，据报道它也可能是白腐真菌木质素分解系统的一个重要部分。例如从黑木耳(auricularia auricula-judae)培养液中纯化得到的dyp能氧化非酚木质素模型化合物藜芦醇(va)；在大肠杆菌中异源表达白囊耙齿菌(irpex lacteus)dyp基因，纯化的dyp蛋白能氧化酚型木质素模型化合物2，6-二甲氧基苯酚(dmp)。目前为止，关于真菌dyps的研究内容较少，我们对其具体的功能与应用也知之甚少，因此丰富真菌dyps的种类及明确它们的功能具有重要意义。
4.灵芝(ganoderma lucidum)俗称“赤芝”，是一种典型的白腐真菌，能将富含木质纤维素的农林废弃物转化为具有药食同源价值的子实体。在木质纤维素中，纤维素、半纤维素和木质素相互交联，形成牢固的网络结构，其中木质素包被在纤维素和半纤维素的外层，降解木质素能有效地促进纤维素、半纤维素的释放，是木质纤维素物质高效利用的关键。经研究，灵芝菌株能够产生染料脱色过氧化物酶，并且在灵芝菌丝生长阶段，gldyp基因的表达量显著高于其它发育阶段。我们推测gldyp基因在基质利用方面也可能发挥重要作用，具有降解木质素的作用。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供灵芝过氧化物酶gldyp基因，满足染料脱色使用需求。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种上述灵芝过氧化物酶gldyp基因的编码蛋白。本发明还要解决的一技术问题是提供一种上述灵芝过氧化物酶gldyp基因的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.灵芝过氧化物酶gldyp基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.含有所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的宿主菌。
10.所述的宿主菌是大肠杆菌bl21。
11.含有所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白。
12.所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在降解过氧化物酶底物abts中的应用。
13.所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在降解木质素模型化合物中的应用。
14.所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在染料脱色中的应用。
15.所述的染料为蒽醌染料、偶氮染料和三甲苯烷类染料中的一种或几种。
16.所述的染料为活性蓝19、活性艳蓝x-br、活性黑5、甲基橙、台盼蓝、孔雀绿中的一种或几种。
17.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18.本发明从灵芝不同发育阶段的转录组数据出发，挖掘到在灵芝菌丝阶段表达量较高的过氧化物酶gldyp基因，通过大肠杆菌重组表达gldyp基因，经镍柱纯化获得具有活性的g1dyp蛋白，降解实验结果表明gldyp蛋白对rb19的脱色率为60.73％
±
0.01，活性艳蓝的脱色率为53.58％
±
0.02，rb5的脱色率为55.13％
±
0.00，甲基橙的脱色率为75.53％
±
0.01，台盼蓝的脱色率为79.14％
±
0.01，孔雀绿的脱色率为79.03％
±
0.01。
附图说明
19.图1为从灵芝cdna中pcr扩增得到的gldyp基因电泳图(泳道m为dna分子量标记物(dna marker)；泳道1为gldyp基因的核苷酸片段)；
20.图2为sds-page分析大肠杆菌表达gldyp的情况图(泳道m为蛋白质分子量标准(蛋白marker)；泳道1为经iptg和28℃诱导，e.coli-gldyp裂解后上清和沉淀；泳道2为经iptg和16℃诱导，e.coli-gldyp裂解后上清和沉淀；泳道3为经iptg和28℃诱导，e.coli-gldyp裂解后上清；泳道4为经iptg和16℃诱导，e.coli-gldyp裂解后上清；泳道5为经iptg和28℃诱导，e.coli-g1dyp裂解后沉淀；泳道6为经iptg和16℃诱导，e.coli-g1dyp裂解后沉淀；泳道7为未经iptg诱导，e.coli-gldyp全细胞；泳道8为经iptg和28℃诱导，e.coli-pet32a裂解后上清和沉淀；泳道9为经iptg和16℃诱导，e.coli-pet32a裂解后上清和沉淀)；
21.图3为g1dyp的western blot分析图(泳道m为蛋白质分子量标准(蛋白marker)；泳道1、2和3为诱导后的重组g1dyp蛋白；泳道4为诱导后的空载体对照)；
22.图4为纯化后gldyp蛋白的sds-page电泳分析图(泳道m为蛋白质分子量标准(蛋白marker)；泳道1和2为纯化后的重组gldyp蛋白)。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进
行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.实施例1：过氧化物酶gldyp基因的克隆
25.1、通过对灵芝菌丝、原基、小菇及大菇四个发育阶段的转录组数据(liu d，sun x，diao w，qi x，bai y，yu x，li l，fang h，chen z，liu q，liang c.comparative transcriptome analysis revealed candidate genes involved in fruiting body development and sporulation in ganoderma lucidum.arch microbiol，2022，204(8)：514.)进行unigene基因的表达分析，筛选到一个仅在菌丝阶段表达量较高的染料脱色过氧化物酶基因，即gldyp基因。
26.2、利用kk超快植物总rna提取试剂盒提取灵芝菌丝阶段的总rna，利用反转录试剂盒hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit(+gdna wiper)将其反转录成cdna。
27.3、根据转录组中gldyp基因的序列设计并合成如下特异性引物：
28.1-f：5
′‑
atggctcccaccgtagcacc-3
′
：
29.1-r：5
′‑
tcatgctaacgcgaaagtac-3
′
。
30.4、以cdna为模板进行pcr扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。将片段大小正确的pcr产物纯化后连接t载体，转化到大肠杆菌dh5α中。挑取单克隆，经pcr检测后送到上海生工生物工程有限公司测序，得到的gldyp基因核苷酸序列为1461bp，其核苷酸序列如seq id no.1所示，其对应的编码蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。
31.实施例2：gldyp基因的异源表达
32.1、将gldyp基因片段通过同源重组的方法与表达载体pet-32a(+)连接(载体经ecor1和xho1酶切)，转化到大肠杆菌bl21(de3)中。同源重组引物序列如下：
33.2-f：gctgatatcggatccgaattcatggctcccaccgtagcac；
34.2-r：gtggtggtggtggtgctcgagtgctaacgcgaaagtactgcg。
35.挑取单克隆，经pcr检测后送到上海生工生物工程有限公司测序。将测序正确的单菌落进行扩大培养，提取质粒，酶切验证，将测序和酶切验证均正确的单克隆进行保藏。
36.2、将含有重组质粒的bl21菌株，接种于20ml lb培养基中，37℃220r/min震荡培养过夜后，按1％比例转接于100ml lb培养基中，37℃220r/min震荡培养4h左右，使od
600
在0.4和0.6之间。然后加入终浓度为0.1mm的诱导剂iptg分别于16℃(120r/min)和28℃(220r/min)诱导过夜，以选出合适的诱导温度。同时以含有空载体的bl21菌株为对照。
37.3、8000r/min离心10min收集上述诱导的菌体，加入pbs缓冲液重悬，再次离心收集菌体，加入20ml tris-hcl缓冲液(ph＝7.4，0.5m nacl)重悬，再加入终浓度为1mm的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，置于冰水浴中超声破碎20min(200w，工作6s，间歇6s)；分别取破碎后总蛋白、上清液和沉淀进行sds-page电泳分析，结果如图2所示，与对照相比，在65kda偏上位置出现一条特异性的条带，与预计的目的蛋白和his融合表达蛋白的分子质量吻合，且在16℃诱导时，上清中表达量较高；并对破碎后重组蛋白和空载体的上清进行western blot分析，结果如图3所示，与对照相比，在65kda偏上位置出现一条特异性的条带，与预计的目的蛋白和his融合表达蛋白的分子质量吻合。说明该染料脱色过氧化物酶蛋白能在大肠杆菌bl21中高效表达。
38.实施例3：gldyp蛋白的纯化
39.根据实施例2的结果，选择16℃诱导，用于蛋白的纯化。将ni-nta层析柱中的缓冲液排出，加入tris-hcl缓冲液冲洗柱子，然后加入上清，控制流速缓慢流出(使蛋白与膜充分结合)，收集流穿液；分别用含不同浓度咪唑(0mm、20mm、50mm、100mm、250mm)的缓冲液洗脱，每种浓度洗脱得到的洗脱液经考马斯亮蓝g-250检测至不变蓝，即可换下一个浓度的洗脱液；选择验证得到的较纯的蛋白，用超滤管进行浓缩，最终纯化得到的蛋白经sds-page检测纯度，结果如图4所示，酶纯度已经达到了酶学性质分析的要求，可用于后续酶学性质的测定。
40.实施例4：g1dyp蛋白降解典型的过氧化物酶底物abts
41.反应体系包含100mm醋酸钠缓冲液(ph 3.5)、0.5mm abts、0.1mm h2o2、50μlgldyp蛋白(187μg/ml)，混匀后，40℃保温10min，测定反应液在420nm处的吸光值变化。定义每毫克g1dyp蛋白每分钟氧化1nmol abts所需的酶量为一个酶活力单位(u)。经计算酶活值为1399.67u/mg
±
10.68。
42.实施例5：gldyp蛋白降解木质素模型化合物
43.反应体系包含100mm醋酸钠缓冲液(ph 3.5)、2.5mm dmp或者5mm愈创木酚、0.1mm h2o2、50μlgldyp蛋白(187μg/ml)，混匀后，40℃保温10min，测定反应液在469nm(dmp)和465nm(愈创木酚)处的吸光值变化。定义每毫克g1dyp蛋白每分钟氧化1nmol dmp或者1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位(u)。经计算dmp酶活值为194.97u/mg
±
6.62，愈创木酚酶活值为534.50u/mg
±
5.10。
44.实施例6：g1dyp蛋白对不同染料的脱色测定
45.本实施例共选择了6种染料，其中活性蓝19(rb19)和活性艳蓝x-br为蒽醌染料，活性黑5(rb5)、甲基橙、台盼蓝为偶氮染料，孔雀绿为三甲苯烷类染料。
46.rb19所用的浓度为150μm，活性艳蓝x-br浓度为50μm，rb5浓度为50μm，甲基橙浓度为100μm，台盼蓝浓度为15μm，孔雀绿浓度为150μm。
47.反应体系包含100mm醋酸钠缓冲液(ph 3.5)、不同染料、0.1mm h2o2、50μl蛋白(187μg/ml)，混匀后，40℃保温10min。
48.测定反应液在595nm(rb19)、592nm(活性艳蓝x-br)、598nm(rb5)、460nm(甲基橙)、606nm(台盼蓝)和614am(孔雀绿)处的吸光度值变化，脱色率计算公式如下：
49.染料的脱色率(％)＝(a
0-a
t
)/a0×
100％
50.a0为初始吸光度值，at为脱色处理后的吸光度值。
51.g1dyp蛋白对不同染料的脱色率如表1所示，rb19的脱色率为60.73％
±
0.01，活性艳蓝的脱色率为53.58％
±
0.02，rb5的脱色率为55.13％
±
0.00，甲基橙的脱色率为75.53％
±
0.01，台盼蓝的脱色率为79.14％
±
0.01，孔雀绿的脱色率为79.03％
±
0.01。
52.表1g1dyp蛋白对不同染料的脱色率
[0053] 脱色率rb1960.73％
±
0.01活性艳蓝x-br53.58％
±
0.02rb555.13％
±
0.00甲基橙75.53％
±
0.01台盼蓝79.14％
±
0.01
孔雀绿79.03％
±
0.01

技术特征：
1.灵芝过氧化物酶gldyp基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.含有权利要求1所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的宿主菌。4.根据权利要求3所述的含有灵芝过氧化物酶gldyp基因的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌是大肠杆菌bl21。5.含有权利要求1所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白。6.权利要求5所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在降解过氧化物酶底物abts中的应用。7.权利要求5所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在降解木质素模型化合物中的应用。8.权利要求5所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在染料脱色中的应用。9.根据权利要求8所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在染料脱色中的应用，其特征在于，所述的染料为蒽醌染料、偶氮染料和三甲苯烷类染料中的一种或几种。10.根据权利要求9所述的灵芝过氧化物酶gldyp基因的重组蛋白在染料脱色中的应用，其特征在于，所述的染料为活性蓝19、活性艳蓝x-br、活性黑5、甲基橙、台盼蓝、孔雀绿中的一种或几种。

技术总结
本发明公开了灵芝过氧化物酶GlDyP基因及其编码蛋白和应用，属于真菌分子生物学领域。本发明公开的灵芝过氧化物酶GlDyP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明从灵芝不同发育阶段的转录组数据出发，挖掘到在灵芝菌丝阶段表达量较高的过氧化物酶GlDyP基因，通过大肠杆菌重组表达GlDyP基因，经镍柱纯化获得具有活性的G1DyP蛋白。该G1DyP蛋白可氧化过氧化物酶底物和木质素模型化合物，可使蒽醌染料、偶氮染料和三甲苯烷类等染料脱色，将其投入到环境污染治理中，具有巨大的应用潜力及可利用价值。利用价值。利用价值。


技术研发人员：刘冬梅 梁呈元 刁文彤 亓希武 房海灵 于盱 李莉 柏杨
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/10/7