同时检测ZEN、OTA和AFB1的荧光增敏传感器、制备方法及应用

同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及粮食食品安全技术领域，涉及脱氧核酶剪切与杂交链式反应引发荧光信号检测技术，具体为同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.粮食食品中最常见的真菌毒素组合形式为玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)、黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)、呕吐毒素(deoxynivalenol，don)和赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)。黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，主要产毒真菌包括黄曲霉(aspergillus flavus)与寄生曲霉(aspergillus parasiticus)。在已知的真菌毒素中，黄曲霉毒素的毒性最大，对人类健康危害最突出，是世界上毒性最强的物质之一，其中毒性最强、分布最广的一类黄曲霉毒素是黄曲霉毒素b1(afb1)。由于具有极强的致癌、致畸和致突变的作用，afb1在1988年被国际癌症研究机构(international agency of research on cancer，iarc)归为第一类致癌物质。玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)是一种真菌雌激素，主要存在玉米中。zen的衍生物常常被用于一些牲畜饲料中以促进家畜的生长发育，而过量摄入zen时，可能会导致家畜不育，或者在家畜怀孕时投喂含过量zen的饲料会使幼仔身体虚弱或者个头过小。对人体来说，过量的zen会对中枢神经系统造成影响，并伴有恶心、发冷、头痛、神智抑郁等症状，此外，zen还具有生殖毒性和遗传毒性。赭曲霉毒素是由青霉属和曲霉属的几种真菌菌株产生的，因为这些真菌各自都有不同的生理和生态环境，因此导致赭曲霉毒素结构变得很特殊。赭曲霉毒素具有致畸性和免疫毒性，对肾脏造成有毒性损害，iarc将赭曲霉毒素分类为2b类致癌物质。其中赭曲霉属a(ochratoxin a，ota)是赭曲霉毒素中毒性最强的一种。ota一般通过谷物、葡萄酒、葡萄汁、咖啡和猪肉等几种食物进入人体，在我国，ota在粮油食品中的限量为5μg/kg。
3.多种真菌毒素共存时，由于之间的协同作用导致毒性增加，使得对人体与动物的危害加剧。这使得对食品中进行单一的真菌毒素检测已经无法满足食品安全检测的要求，这对开发一种能同时检测多种真菌毒素的方法提出了迫切要求。目前大多数对多种目标物进行同时检测的荧光传感器往往需要修饰多种荧光素和猝灭剂，这样不仅增加了探针的修饰难度与纯化时间，还增加了检测的成本。


技术实现要素：

4.解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，通过设计特异性的dna序列结构，结合核酸外切酶的剪切特性，利用dna序列碱基互补特性，进行特定dna框架结构的组装与杂交链式反应，进行荧光信号的富集与增强。dna框架结构上特定的聚(at/ta)双链结构可以引发cu nps的生成，从而产生荧光检测信号。而fe3o4磁性纳米材料与氧化石墨烯结合形成复合吸附材料fe3o4@go可以有效吸附检测体系中背景荧光信号，从而增加检测灵敏度，降低本底干扰。鉴于此，本发明提供了同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器及其制备方法
和应用。
5.技术方案：同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器，所述传感器包括：由fe3o4磁性纳米材料和go结合形成荧光信号复合吸附材料fe3o4@go；zen、ota和afb1与对应核酸适配体特异性识别，在核酸外切酶剪切特性和dna自组装特性下组装成dna四边形框架，并在框架的两条支链上分别引发hcr反应，在框架边框聚at/ta双链结构上生成cu纳米粒子，从而产生检测zen、ota和afb1的3种荧光信号；其中zen的核酸适配体序列为seq id no.1，ota的核酸适配体序列为seq id no.2，afb1的核酸适配体序列为seq id no.3。
6.同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，所述方法包括以下步骤：
7.s1、构建磁性纳米材料fe3o48.将fecl3·
6h2o和naac加入乙二醇溶液中，剧烈搅拌直至粉末完全溶解，超声混匀，然后倒入ptfe反应釜中反应，产物经磁分离、乙醇重复清洗后干燥、研磨得到fe3o
4 nps；
9.s2、制备fe3o4@go复合吸附材料
10.将s1制得的fe3o
4 nps分散于pdda溶液中，超声、磁分离、超纯水洗涤后重悬于超纯水中，向其中加入go，室温搅拌后磁分离，纯水清洗、真空干燥制得fe3o4@go复合吸附材料；
11.s3、构建荧光增敏传感器
12.将zen的核酸适配体、ota的核酸适配体、afb1的核酸适配体、p1、p2、p3、h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3和f4用te缓冲液稀释，95℃恒温水浴变性后置于室温中2h；向含有目标毒素zen、ota和afb1的溶液中加入3种核酸适配体，95℃变性后37℃水浴反应1h使得适配体与目标毒素结合；加入发卡结构p1、p2、p3反应1h，加入核酸外切酶进行双链降解，灭活核酸外切酶，加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4并重新置于37℃及核酸外切酶环境中孵育，形成dna四边形框架，并在框架的两条支链上产生hcr荧光信号产物。
13.优选的，s1中fecl3·
6h2o物质的量、naac物质的量及乙二醇体积比为1mmol:14～30mmol:40ml。
14.优选的，s2中pdda物质的量、fe3o
4 nps物质的量、go物质的量、超纯水体积比为1μmol:1.71～2.09μmol:25.2～30.8μmol:30ml。
15.优选的，s3中zen的核酸适配体、ota的核酸适配体、afb1的核酸适配体混合物，p1、p2、p3、h1、h2、h3、h4混合物及f1、f2、f3、f4混合物物质的量比为1pmol:3～5pmol:58.3～71.3μmol。
16.优选的，s3中涉及的核苷酸序列为：h1为seq id no.4，h2为seq id no.5，h3为seq id no.6，h4为seq id no.7，p1为seq id no.8，p2为seq id no.9，p3为seq id no.10，f1为seq id no.11，f2为seq id no.12，f3为seq id no.13，f4为seq id no.14。
17.核酸适配体及发卡结构等序列具体如表1所示：
18.表1核苷酸序列信息
[0019][0020]
优选的，s3中采用的核酸外切酶为exo iii 20～40u，降解温度为37℃，降解时间为1h，降解完成后混合溶液在70℃下反应10min对exo iii进行灭活。
[0021]
以上所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器在检测粮食食品中真菌毒素的应用。
[0022]
优选的，检测的步骤为：
[0023]
(1)向含目标真菌毒素的待测样品中加入3种核酸适配体混合物20～40μl，孵育结合反应，加入发卡结构p1、p2、p3混合物20～40μl继续孵育反应，加入20～40u exo iii进行双链降解与灭活，再依次加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4进行孵育；向其中加入0.1～0.5mg/ml的fe3o4@go复合吸附材料吸附60～120min后磁分离，上清液中加入1～3mm抗坏血酸和80～120μm cu
2+
进行反应，反应5～15min生成cu nps，检测体系荧光强度，建立荧光强度与zen、ota、afb1的标准曲线；
[0024]
(2)dna发夹结构f1和f3上分别标记荧光素amca和cy5.5，检测体系中cu nps、
amca、cy5.5的激发波长分别为340nm、350nm和684nm，发射波长为600nm、440nm和710nm。
[0025]
优选的，所述方法对zen的检测限为0.008ng/ml，对ota的检测限为0.003ng/ml,对afb1的检测限为0.006ng/ml。
[0026]
有益效果：(1)本发明所述传感器结构与尺寸可控、成本低、磁性能优异、偶联活性强、制备方法成熟稳定；(2)所述传感器用于zen、afb1和ota的富集捕获，运用成熟，稳定性强；(3)所述传感器应用于真菌毒素检测时，具有迅速便捷、高灵敏度的优点，且无需修饰猝灭剂就能降低检测的背景信号；(4)所述方法采用荧光光谱仪进行荧光信号检测，对zen的检测限为0.008ng/ml，对afb1的检测限为0.003ng/ml,对afb1的检测限为0.006ng/ml。
附图说明
[0027]
图1为本发明同时荧光检测传感器结构示意图，其中(a)为fe3o4磁性纳米材料；(b)为fe3o4@go复合吸附材料；(c)为制备特定dna框架；(d)为dna框架两个支链上分别引发hcr；(e)为dna框架边框聚(at/ta)双链结构生成cu nps。
[0028]
图2为荧光检测的传感器的检测原理示意图；
[0029]
图3为fe3o4、go、fe3o4@go的tem电镜图，其中(a)为fe3o4磁性纳米材料；(b)为go；(c)为fe3o4@go；
[0030]
图4为fe3o
4 nps、go、fe3o4@go的红外光谱图；
[0031]
图5不同浓度(a)ota，(b)zen，(c)afb1下的荧光光谱图；以及标准曲线图(d)ota的线性曲线,(e)zen的线性曲线，(f)afb1的线性曲线。
具体实施方式
[0032]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033]
实施例1
[0034]
一种可同时对玉米赤霉烯酮(zen)、赭曲霉毒素a(ota)和黄曲霉毒素b1(afb1)进行荧光检测的传感器的制备，包括以下步骤：
[0035]
(1)fe3o4磁性纳米材料的制备
[0036]
将fecl3·
6h2o和naac加入乙二醇溶液中，剧烈搅拌直至粉末完全溶解，超声10min使混合物充分混合。将所得到的混合物倒入100ml ptfe反应釜中200℃下反应12小时后，通过磁分离，用乙醇清洗以除去多余的溶剂，重复清洗数次后将产物在60℃下干燥6h，研磨后即可得到fe3o
4 nps；
[0037]
(2)fe3o4@go复合吸附材料的制备
[0038]
将合成的fe3o
4 nps分散于pdda溶液中，超声30min后，通过磁分离，用超纯水冲洗3次，洗去多余的pdda，得到经过pdda修饰的fe3o
4 nps。再将材料重悬于30ml超纯水中，加入30ml go，在室温下搅拌1h后通过磁分离、水洗得到fe3o4@go。最终在真空干燥箱中40℃烘6h得到最终产物；
[0039]
(3)dna框架检测结构的形成
[0040]
所有dna发夹粉末(zen-适配体、ota-适配体、afb
1-适配体、p1、p2、p3、h1、h2、h3、
h4、f1、f2、f3、f4)用te缓冲液稀释成10μm，在恒温水浴锅中95℃加热5min后在室温下放置2h。首先在离心管中依次加入20μl的10nm zen-apt、ota-apt、afb
1-apt和含有不同浓度目标物标准品的溶液(zen、ota、afb1)，在95℃下反应5min后放入37℃水浴锅中反应1h使相应适配体与目标物分别结合。再依次加入20μl的40nm的发卡结构p1、p2、p3，反应1h后加入20u exoⅲ进行双链降解实验。1h后将混合溶液在70℃下反应10min对exoⅲ进行灭活，从而产生三种不同的dna短链，即o1、o2和o3。在离心管中依次加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4并重新放于37℃下孵育2h，dna短链引发发卡结构形成dna四边形框架，并在两条支链上产生富有hcr的产物。在上述溶液中加入0.3mg/ml的fe3o4@go，在室温下均匀摇晃1h后磁分离，在上清液中加入2mm的抗坏血酸(aa)和100μm的cu
2+
反应5min后检测体系荧光强度。
[0041]
实施例2
[0042]
基于实施例1制备的传感器在食品中玉米赤霉烯酮(zen)、赭曲霉毒素a(ota)和黄曲霉毒素b1(afb1)上的应用，具体检测方法如下：
[0043]
将制备的荧光检测传感器对两种同时含有三种目标真菌毒素的天然阳性样品(玉米和花生)进行检测。检测过程如下：将实际样品的提取液分别稀释1、10、100倍，用于后续检测。在不同浓度目标物标准品的溶液(zen、ota、afb1)中依次加入20μl的10nm zen-适配体、ota-适配体、afb
1-适配体，在95℃下反应5min后放入37℃水浴锅中反应1h，使相应适配体与目标物分别结合，再依次加入20μl的40nm的发卡结构p1、p2、p3，反应1h，加入20u exo iii进行双链降解实验，1h后将混合溶液在70℃下反应10min对exo iii进行灭活，产生o1、o2和o3，依次加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4，37℃下孵育2h。加入0.3mg/ml的fe3o4@go，室温下均匀摇晃1h后磁分离，上清液中加入2mm的抗坏血酸(aa)和100μm的cu
2+
，反应5min，检测体系荧光强度。其中cu nps、amca、cy5.5的激发波长分别为340nm、350nm和684nm，发射波长为600nm、440nm和710nm。
[0044]
所有最终检测到的浓度都对应于实际样品中目标物的初始稀释浓度。结果如表2所示，表明该方法具有较好的稳定性和实际意义，均获得了较好的相对回收率。
[0045]
表2三种真菌毒素荧光检测传感器测定玉米、花生样品中的zen、ota和afb1[0046][0047]a相对回收率＝(总浓度-空白浓度)/掺入浓度
[0048]
本发明方法操作简单便捷，检测迅速，运用适用于高灵敏快速检测分析。该分析方法对zen、afb1和ota的最低检测限分别为0.008ng/ml、0.003ng/ml和0.006ng/ml，线性范围分别为0.01-100ng/ml、0.01-100ng/ml和0.01-50ng/ml。在实际样品分析中，rsd％s《5.23％，zen、afb1和ota的平均相对回收率分别为99.6％、100.95％和101.05％。因此本方法能够实现对粮食样品中三种真菌毒素的同时检测。与其他检测方法相比，该方法所使用fe3o4纳米酶结构与尺寸可以可控制备、成本低、毒性弱，磁性能优异、催化活性强、对极端条件适应能力高，制备方法成熟稳定；fe3o4纳米酶修饰氧化石墨烯后用于吸附未能反应的单链dna，运用成熟，稳定性强；以dna四边形框架为主体，同时进行cu nps的模版法制备及框架支链上hcr的进行(产生amca和cy5.5荧光标记产物)，三种荧光为检测信号对ota、zen和afb1进行同时检测，理论基础成熟，可靠性好。
[0049]
图1-5的结果分析如下：
[0050]
图1为本发明同时荧光检测传感器结构示意图，其中(a)为fe3o4磁性纳米材料；(b)为fe3o4@go复合吸附材料；(c)为制备特定dna框架；(d)为dna框架两个支链上分别引发hcr；(e)为dna框架边框聚(at/ta)双链结构生成cu nps。
[0051]
图2为荧光检测的传感器的检测原理示意图。
[0052]
fe3o
4 nps、go、fe3o4@go的tem图像如图3所示。由图3(a)可知，合成的fe3o
4 nps尺寸大约在300nm左右。由图3(b)可知，go为具有不规则的片状物。从图3(c)中可以看出，在go上成功负载了fe3o4，表明fe3o4@go的成功合成。
[0053]
fe3o
4 nps、go、fe3o4@go的ft-ir光谱如图4所示。go中1635cm-1
处的吸收峰归因于c＝o的伸缩振动，1400cm-1
处的吸收峰归因于c-o的伸缩振动。fe3o4@go的ftir光谱中也出现了go中1635cm-1
和1400cm-1
处的特征吸收峰，这表明fe3o4@go的成功负载。
[0054]
用所建立的方法对不同浓度的ota、zen、和afb1进行检测,检测结果如图5所示。其中(a)(b)(c)图分别是不同浓度ota、zen、和afb1所对应的荧光光谱图，随着目标物浓度的增加，荧光信号也相应升高。相应的标准曲线如图(d)(e)(f)所示，荧光信号与目标物的浓度的对数成线性关系。经计算，该方法对ota、zen、和afb1的最低检测限分别为0.006ng/ml、0.008ng/ml和0.003ng/ml，线性范围分别为0.01-50ng/ml、0.01-100ng/ml和0.01-100ng/ml。本方法经3次重复实验，相对标准偏差(rsd％)均小于5％，重现性良好。

技术特征：
1.同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器，其特征在于，所述传感器包括：由fe3o4磁性纳米材料和go结合形成荧光信号复合吸附材料fe3o4@go；zen、ota和afb1与对应核酸适配体特异性识别，在核酸外切酶剪切特性和dna自组装特性下组装成dna四边形框架，并在框架的两条支链上分别引发hcr反应，在框架边框聚at/ta双链结构上生成cu纳米粒子，从而产生检测zen、ota和afb1的3种荧光信号；其中zen的核酸适配体序列为seq id no.1，ota的核酸适配体序列为seq id no.2，afb1的核酸适配体序列为seq id no.3。2.权利要求1所述同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1、构建磁性纳米材料fe3o4将fecl3·
6h2o和naac加入乙二醇溶液中，剧烈搅拌直至粉末完全溶解，超声混匀，然后倒入ptfe反应釜中反应，产物经磁分离、乙醇重复清洗后干燥、研磨得到fe3o
4 nps；s2、制备fe3o4@go复合吸附材料将s1制得的fe3o
4 nps分散于pdda溶液中，超声、磁分离、超纯水洗涤后重悬于超纯水中，向其中加入go，室温搅拌后磁分离，纯水清洗、真空干燥制得fe3o4@go复合吸附材料；s3、构建荧光增敏传感器将zen的核酸适配体、ota的核酸适配体、afb1的核酸适配体、p1、p2、p3、h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3和f4用te缓冲液稀释，95℃恒温水浴变性后置于室温中2h；向含有目标毒素zen、ota和afb1的溶液中加入3种核酸适配体，95℃变性后37℃水浴反应1h使得适配体与目标毒素结合；加入发卡结构p1、p2、p3反应1h，加入核酸外切酶进行双链降解，灭活核酸外切酶，加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4并重新置于37℃及核酸外切酶环境中孵育，形成dna四边形框架，并在框架的两条支链上产生hcr荧光信号产物。3.根据权利要求2所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，s1中fecl3·
6h2o物质的量、naac物质的量及乙二醇体积比为1mmol:14～30mmol:40ml。4.根据权利要求2所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，s2中pdda物质的量、fe3o
4 nps物质的量、go物质的量、超纯水体积比为1μmol:1.71～2.09μmol:25.2～30.8μmol:30ml。5.根据权利要求2所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，s3中zen的核酸适配体、ota的核酸适配体、afb1的核酸适配体混合物，p1、p2、p3、h1、h2、h3、h4混合物及f1、f2、f3、f4混合物物质的量比为1pmol:3～5pmol:58.3～71.3μmol。6.根据权利要求2所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，s3中涉及的核苷酸序列为：h1为seq id no.4，h2为seq id no.5，h3为seq id no.6，h4为seq id no.7，p1为seq id no.8，p2为seq id no.9，p3为seqid no.10，f1为seq id no.11，f2为seq id no.12，f3为seq id no.13，f4为seqid no.14。7.根据权利要求2所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器的制备方法，其特征在于，s3中采用的核酸外切酶为exo iii 20～40u，降解温度为37℃，降解时间为1h，降解完成后混合溶液在70℃下反应10min对exo iii进行灭活。8.权利要求1所述的同时检测zen、ota和afb1的荧光增敏传感器在检测粮食食品中真菌
毒素的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测的步骤为：(1)向含目标真菌毒素的待测样品中加入3种核酸适配体混合物20～40μl，孵育结合反应，加入发卡结构p1、p2、p3混合物20～40μl继续孵育反应，加入20～40u exo iii进行双链降解与灭活，再依次加入h1、h2、h3、h4、f1、f2、f3、f4进行孵育；向其中加入0.1～0.5mg/ml的fe3o4@go复合吸附材料吸附60～120min后磁分离，上清液中加入1～3mm抗坏血酸和80～120μm cu
2+
进行反应，反应5～15min生成cu nps，检测体系荧光强度，建立荧光强度与zen、ota、afb1的标准曲线；(2)dna发夹结构f1和f3上分别标记荧光素amca和cy5.5，检测体系中cu nps、amca、cy5.5的激发波长分别为340nm、350nm和684nm，发射波长为600nm、440nm和710nm。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述方法对zen的检测限为0.008ng/ml，对ota的检测限为0.003ng/ml,对afb1的检测限为0.006ng/ml。

技术总结
本发明公开了同时检测ZEN、OTA和AFB1的荧光增敏传感器及其制备方法和应用，所述传感器包括：由Fe3O4磁性纳米材料和GO结合形成荧光信号复合吸附材料Fe3O4@GO；ZEN、OTA和AFB1与对应核酸适配体特异性识别，在核酸外切酶剪切特性和DNA自组装特性下组装成DNA四边形框架，并在框架的两条支链上分别引发HCR反应，在框架边框聚AT/TA双链结构上生成Cu纳米粒子，从而产生检测ZEN、OTA和AFB1的3种荧光信号；其中ZEN的核酸适配体序列为SEQ ID NO.1，OTA的核酸适配体序列为SEQ ID NO.2，AFB1的核酸适配体序列为SEQ ID NO.3。所述传感器应用于真菌毒素检测时，具有迅速便捷、高灵敏度的优点，且无需修饰猝灭剂就能降低检测的背景信号；对ZEN的检测限为0.008ng/mL，对AFB1的检测限为0.003ng/mL,对AFB1的检测限为0.006ng/mL。的检测限为0.006ng/mL。的检测限为0.006ng/mL。


技术研发人员：孔德昭 王俊妍 顾一丹 鞠嘉和 陈一桐 唐盛 沈薇 刘畅 史巧巧 张琪
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/10/7