耐氧型光氧化还原催化触发ONOO-释放的方法与应用与流程

耐氧型光氧化还原催化触发onoo-释放的方法与应用
技术领域：
1.本发明涉及光氧化还原催化技术领域，具体涉及一种耐氧型光氧化还原催化触发onoo-释放的方法与应用。


背景技术：

2.在生物体中，onoo-(过氧亚硝基阴离子)主要产生的来源是体内的no和o2·-自发反应形成，和很多疾病有着密切关系，在许多生理和病理过程中具有关键作用。对于外源性的onoo-供体而言，由于同时产生两种短寿命的活性物种是比较困难的，因此，发展新的onoo-供体仍然具有挑战性。目前已经开发了多种onoo-供体，包括已经商业化的sin-1，其在生理条件下自发释放onoo-。为了进一步提高onoo-供体的稳定性，减小onoo-的提前泄露和副作用，研究者发展了紫外光和酶响应的onoo-供体。然而，目前对于组织穿透深和光毒性低的近红外光响应的onoo-供体研究较少。
3.光氧化还原催化在有机化合物合成等领域中具有重要的作用，然而发展具有近红外吸收和非金属的光催化剂，同时能够在常氧条件下实现光氧化还原催化的过程是非常困难的，特别是在复杂的生理条件下实现光氧化还原催化的过程，而不添加任何清除氧气的试剂仍然具有很大的挑战性。在前期的研究过程中，发明人采用光氧化还原的策略能够实现在乏氧条件下通过红光激活吸收在紫外区的no供体分子，从而实现no的释放。另外，通过光催化过程产生的还原性物种消耗局部产生的活性氧，降低局部氧气含量，实现了耐氧型光氧化还原催化释放no体系。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种no供体分子和光催化剂分子(光敏剂)，no供体分子可通过活性聚合制备两亲性嵌段聚合物，进一步利用自组装将光催化剂负载在纳米组装体中，所制纳米组装体在光照条件下产生onoo-，用于杀灭革兰氏阳/阴性菌、真菌和耐药革兰氏阴性菌。
5.本发明的目的之一是提供一种no供体分子，具有式i和式ii结构：
[0006][0007]
式i和式ii中，r1选自式1～9结构中的一种；
[0008][0009]
式1～9中，r2、r3选自氢、硝基、甲氧基、三氟甲基、氰基中的一种，n选自1～5之间的任意整数。
[0010]
以r2＝no2、r3＝h为例，no供体分子的结构如下所示：
[0011][0012]
本发明所述的no供体分子也可称为no给体分子，其结构中的n-亚硝胺基元为no释放部分。式i和式ii的双键部分可通过可逆加成-断裂链转移聚合和原子转移自由基聚合等聚合方法制备两亲性嵌段聚合物，但不仅限于上述聚合方法。
[0013]
本发明的目的之二是提供一种制备两亲性嵌段聚合物的方法，由所述的no供体分子通过可控聚合制备两亲性嵌段聚合物。
[0014]
本发明的目的之三是提供一种两亲性嵌段聚合物，具有式iii和式iv结构：
[0015][0016]
式iii和式iv中，r1选自式1～9结构中的一种，m选自2～150之间的任意整数，n选自2～100之间的任意整数。
[0017]
优选地，所述两亲性嵌段聚合物的分子量为200-35000da。
[0018]
本发明实施例中的亲水性链段长度可以任意选择，如聚乙二醇(peg)聚合度m为2～150；疏水性嵌段(no供体基元)聚合度n为2～100，可根据条件进行适当改变。对于本发明来说，聚合度m和n不是关键，只要对本发明没有不利影响即可。
[0019]
本发明的目的之四是提供一种光催化剂，具有式v结构：
[0020][0021]
其中，x为硫或硒。
[0022]
将所述的两亲性嵌段聚合物和光催化剂分子自组装制备粒径为20-800nm的纳米组装体，即为耐氧型近红外光氧化还原催化触发onoo-释放平台。
[0023]
本发明的目的之五是提供一种纳米组装体，由所述的两亲性嵌段聚合物和光催化剂自组装制成。
[0024]
本发明的目的之六是提供一种制备所述纳米组装体的方法，包括慢加水法、纳米闪沉法、超声法和薄膜水化法等。
[0025]
在一个优选实施方案中，所述纳米组装体可通过以下方法制备：将所述两亲性嵌段聚合物和光催化剂分子溶解在作为共溶剂的有机溶剂(包括但不仅限于四氢呋喃、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环等)中，在一定温度和搅拌速度下加入水中，通过透析除掉有机溶剂，得到负载光催化剂分子的纳米组装体。
[0026]
在本发明中，所述纳米组装体在光照条件下可以同时释放no、o2·-和onoo-。对光照条件没有明确限制，只要在光催化剂分子的吸收波长范围内均可。对光照强度也没有明确限制，凡是可以激发光催化剂分子，且对释放性质没有不利影响的光照条件均可。
[0027]
本发明的目的之七是提供所述的纳米组装体在光氧化还原催化触发onoo-释放中的应用。
[0028]
本发明的目的之八是提供所述的纳米组装体在制备抗菌剂、抗肿瘤药物中的应用。纳米组装体在光照条件下产生onoo-，可以杀灭革兰氏阳/阴性菌、真菌和耐药革兰氏阴性菌。
[0029]
本发明的有益效果是：本发明制备的纳米组装体中的光催化剂在光照条件下一方面可以作为光催化剂，催化no供体分子释放no，即激发态的光催化剂将电子转移给两亲性嵌段聚合物中的no供体分子，从而释放no；另一方面光催化剂可同时作为一种i型光敏剂，在光照条件下产生o2
·-，间接消耗氧气，从而实现在常氧条件下释放no，产生的no和o2
·-可进一步反应产生onoo-。
附图说明：
[0030]
图1为实施例1中no供体分子的核磁氢谱图；
[0031]
图2为实施例2中光催化剂的核磁氢谱、碳谱和质谱图；
[0032]
图3为实施例3中pno和pnh的核磁氢谱图和gpc分析结果；
[0033]
图4为实施例4中纳米组装体的粒径和sem图；
[0034]
图5为实施例5中纳米组装体在光照前后(a)no，(b)o2·-，(c)onoo-的释放情况；
[0035]
图6为实施例6中纳米组装体的抗菌效果(a)金黄色葡萄球菌，(b)大肠杆菌，(c)耐环丙沙星绿脓杆菌，(d)真菌；
[0036]
图7为实施例7中纳米组装体用于分散生物膜的结晶紫染色实物图。
具体实施方式：
[0037]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
[0038]
实施例1：no供体分子的合成
[0039][0040]
将0.4g nbdnh溶解在冰醋酸和四氢呋喃的混合物中(30ml，v/v＝1:1)，然后缓慢加入亚硝酸钠(nano2，985mg)，将所得混合物在室温下搅拌反应5h。减压浓缩除去溶剂，并通过柱层析纯化，得到黄色固体产物nbdno，产率51.6％。
[0041][0042]
将上述得到的nbdno(200mg，0.8mmol)和2-异氰酸基甲基丙烯酸乙酯(184mg，1.19mmol)溶解在10ml四氢呋喃中，再加入催化剂dttl(100μl)，室温反应过夜，柱层析纯化，得到黄色固体产物，其结构表征图谱如图1所示。
[0043]
实施例2：光催化剂的合成
[0044][0045]
将化合物3(1.41g，7.03mmol)和化合物4(1.2g，2.34mmol)溶解在50ml 2,2,2-三氟乙醇中，将所得混合物在80℃下搅拌反应2h。减压浓缩除去溶剂，并通过柱层析纯化，得到0.72mg深蓝色固体产物nbse-oh，收率65％。
[0046]
将nbse-oh(0.2g，0.42mmol)溶解在15ml dmf中，并加入50μl dbtl，然后加入异氰酸乙酯(84mg，0.632mmol)，所得混合物在室温下搅拌过夜。减压浓缩除去溶剂，并通过柱层析纯化，得到195mg深蓝色固体产物nbse，产率76％，其结构表征图谱如图2所示。
[0047]
实施例3：两亲性嵌段聚合物的合成
[0048][0049]
将实施例1制备的no供体单体分子(80mg，20当量)、v70引发剂(0.6mg，0.2当量)和peo-based macroraft agent(22mg，1当量，合成方法参考macromolecules,2008,41,12)溶解在0.3ml二甲基亚砜中，然后加入到聚合反应管中，反应管通过冷冻-脱气-解冻循环重复三次脱气，并在真空下密封。聚合物反应液在60℃反应10h，用液氮淬灭聚合反应，将溶液沉淀到过量的乙醚和甲醇的混合溶液(40ml/5ml)中。上述溶解-沉淀循环重复三次，然后过滤收集滤饼，室温下在真空烘箱中干燥过夜，得到黄色固体产物pno。其对照聚合物pnh采用相同方法合成，结构表征图谱和gpc分子量分布图如图3所示。
[0050]
实施例4：纳米组装体的合成
[0051]
将1mg实施例3制备的两亲性嵌段聚合物和实施例2制备的200μmol光催化剂溶解于1ml二甲基亚砜中，室温高速搅拌条件下闪沉于水中，将闪沉后的组装体放置于透析袋中(14000da)，室温下在水中透析12h，得到纳米组装体nbse@pno，其水合粒径和透射电子显微镜图如图4所示。没有no释放基元的组装体记为nbse@pnh，其制备方法同上。
[0052]
实施例5：光氧化还原催化触发no、o2·-和onoo-释放
[0053]
no释放测试：
[0054]
将实施例1制备的no供体分子和实施例2制备的光催化剂溶解在dmso中，然后对所得混合溶液进行光照，光照波长为700nm，光照强度为40mw/cm2，测试紫外可见光吸收光谱的变化，按照如下公式计算no释放量：
[0055]
a1＝c0l(ε
1a
xa)+ε
1b
xb[0056]
a2＝c0l(ε
2a
xa)+ε
2b
xb[0057][0058][0059]
其中a1和a2分别为nbdno和nbdnh在λ1和λ2波长下的吸光度；ε
1a
、ε
2a
、ε
1b
、ε
2b
分别为nbdno和nbdnh在λ1和λ2波长下的摩尔消光系数；c0是nbdno的初始浓度，l是光程长度(＝1cm)；xa和xb是nbdno和nbdnh在任何照射时间点的摩尔含量。实施例4制备的纳米组装体的no释放采用相同的方法进行测试和计算。
[0060]
o2·-释放测试：
[0061]
使用商业化的荧光探针dhr 123探针测试o2·-的产生，记录在不同条件下的荧光发射光谱。
[0062]
onoo-释放测试：
[0063]
使用l-酪氨酸作为探针分子，通过高效液相色谱(hplc)测试onoo-释放，组装体和l-酪氨酸(l-tyr，1mm，2％dmf)的水分散液经过光照处理之后进行超滤离心，然后将滤液冻干并进行hplc测试分析。
[0064]
图5为纳米组装体在光照前后(a)no，(b)o2·-，(c)onoo-的释放情况。
[0065]
结果表明，本发明纳米组装体能够在光照条件下产生no和o2·-，并进一步反应生成onoo-。
[0066]
实施例6：光氧化还原催化触发onoo-释放用于抗细菌和真菌
[0067]
抗细菌试验：对于每个细菌菌株，将1-2个单独的菌落接种到新鲜的胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)培养基中，并在37℃下孵育15h。然后，将50μl细菌悬液加入5ml新鲜tsb中，并在37℃孵育至对数生长期(od
600
＝0.5-0.7)。离心收集细菌，并用无菌pbs洗涤两次并离心(10000rpm，5min，4℃)，用无菌pbs将菌浓调整至～1.5
×
106cfu/ml。将不同的组装体(100μl)加到96孔板中，每孔加入50μl细菌悬液。将96孔板在37℃下孵育20min，然后进行光照或不光照处理。将96孔板进一步在37℃下孵育30min，并用无菌pbs稀释100倍，将细菌悬液(20μl)置于tsb琼脂平板上，37℃下孵育15h，记录细菌菌落数，每个试验独立重复3次。
[0068]
抗真菌试验：将真菌接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)中，并在30℃下孵育15h(200rpm)。然后离心收集真菌细胞，用无菌pbs稀释至2
×
105cfu/ml作为工作悬液。将不同的组装体加到96孔板中。每孔加入50μl真菌细胞悬液，然后将96孔板在30℃下孵育20min，并进行光照或者不光照处理。然后，将96孔板进一步在30℃下孵育30min，并用无菌pbs稀释100倍，将真菌细胞悬液(20μl)在ypd琼脂平板上培养并在30℃下孵育24h后统计真菌的数量，每个试验独立重复三次。
[0069]
图6为光氧化还原催化释放onoo-对(a)金黄色葡萄球菌；(b)大肠杆菌；(c)耐环丙
沙星绿脓杆菌；(d)真菌的抗菌效果。
[0070]
结果表明，本发明通过光氧化还原催化释放onoo-，能够有效杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、耐药革兰氏阴性菌和真菌。
[0071]
实施例7：光氧化还原催化触发onoo-释放用于分散耐药菌生物膜
[0072]
生物膜培养：向24孔板的每个孔中加入500μl tsb培养基和100μl细菌悬液(108cfu/ml)，将24孔板置于37℃培养箱中孵育24h，然后将旧的培养基更换为新鲜的tsb培养基，继续孵育24h后用于进一步的抗生物膜实验。培养得到的生物膜分别加入不同的组装体，将生物膜在37℃下孵育1h后对生物膜进行光照或不光照处理。将生物膜在37℃下再孵育30min，并用pbs洗涤两次。加入0.5ml结晶紫染色液后孵育20min，然后用pbs洗涤两次，加入500μl纯乙醇后使用酶标仪测量均质悬浮液的od
550
定量生物膜量。
[0073]
图7为光氧化还原催化释放onoo-对耐环丙沙星绿脓杆菌生物膜的清除和杀灭情况。
[0074]
结果表明，本发明通过光氧化还原催化释放onoo-，能够有效清除细菌生物膜并杀灭细菌。
[0075]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种no供体分子，其特征在于：所述no供体分子具有式i和式ii结构：式i和式ii中，r1选自式1～9结构中的一种；式1～9中，r2、r3选自氢、硝基、甲氧基、三氟甲基、氰基中的一种，n选自1～5之间的任意整数。2.一种制备两亲性嵌段聚合物的方法，其特征在于：由权利要求1所述的no供体分子通过可控聚合制备两亲性嵌段聚合物。3.通过权利要求2所述的方法制备的两亲性嵌段聚合物，其特征在于：所述两亲性嵌段聚合物具有式iii和式iv结构：
式iii和式iv中，r1选自式1～9结构中的一种，m选自2～150之间的任意整数，n选自2～100之间的任意整数。4.根据权利要求3所述的两亲性嵌段聚合物，其特征在于：所述两亲性嵌段聚合物的分子量为200-35000da。5.一种光催化剂，其特征在于：所述光催化剂分子具有式v结构：其中，x为硫或硒。6.一种纳米组装体，其特征在于：所述纳米组装体由权利要求3或4所述的两亲性嵌段聚合物和权利要求5所述的光催化剂自组装制成。7.根据权利要求6所述的纳米组装体，其特征在于：所述纳米组装体的粒径为20-800nm。8.一种制备权利要求6或7所述的纳米组装体的方法，其特征在于：包括慢加水法、纳米闪沉法、超声法和薄膜水化法。9.权利要求6或7所述的纳米组装体在光氧化还原催化触发onoo-释放中的应用。10.权利要求6或7所述的纳米组装体在制备抗菌剂、抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种耐氧型光氧化还原催化触发ONOO-释放的方法与应用，涉及光氧化还原催化技术领域，本发明采用两亲性嵌段聚合物和光催化剂分子自组装制备纳米组装体，所述纳米组装体中的光催化剂分子在光照条件下既可以作为光氧化还原催化剂激活两亲性嵌段聚合物中的NO供体分子释放NO，同时可以作为I型光敏剂，在光照条件下产生O2·-，而NO和O2·-进一步反应产生ONOO-，用于杀灭革兰氏阳/阴性菌、真菌和耐药革兰氏阴性菌。和耐药革兰氏阴性菌。和耐药革兰氏阴性菌。


技术研发人员：贺克武 沈智强
受保护的技术使用者：合肥市第一人民医院
技术研发日：2023.02.06
技术公布日：2023/10/7